Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Редокс-зависимые процессы в клетке 11
1.2. Роль глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах 11
1.2.1. Синтез de novo и ресинтез глутатиона 11
1.2.2. Роль соотношения восстановленного и окисленного глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах 14
1.2.3. Глутатион и редокс-зависимая регуляция апоптоза 19
1.3. Роль глутатионтрансферазы в редокс-зависимых процессах 25
1.4. Глутаредоксин. Роль в редокс-зависимой регуляции 32
1.5. Мультилекарственная устойчивость опухолевых клеток. Механизмы формирования 38
1.6. Противоопухолевое действие цисплатина. Роль алкилирования ДНК и генерации активных форм кислорода 47
Глава 2. Материалы и методы 63
2.1. Культуры клеток. Условия культивирования 63
2.2. Оценка жизнеспособности клеток 63
2.3. Схема лизирования клеток 64
2.4. Определение содержания общего (GSН + GSSG) и окисленного (GSSG) глутатиона 64
2.5. Определение содержания белка методом Бредфорда 65
2.6. Определение активности -глутамилцистеинсинтетазы 65
2.7. Определение активности -глутамилтрансферазы 66
2.8. Определение активности глутатионредуктазы 66
2.9. Определение активности глутатионтрансферазы 66
2.10. Определение активности глутаредоксина 66
2.11. Оценка экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР 67
2.12. Определение уровня белков методом Вестерн-блоттинга 68
2.13. Оценка апоптоза методом проточной цитофлуориметрии с помощью окрашивания клеток пропидий иодидом и аннексином V, конъюгированным флуорохромом FITC 69
2.14. Определение уровня продукции супероксид-анион радикала (О ) 71
2.15. Методы статистического анализа 71
Глава 3. Результаты исследований 72
3.1. Экспрессия генов, контролирующих синтез GSH de novo и восстановление его окисленной формы, при формировании резистентности опухолевых клеток к цисплатину 72
3.1.1. Оценка содержания восстановленного и окисленного глутатиона в опухолевых клетках, чувствительных и резистентных к цисплатину. Анализ изменения отношения GSH к GSSG как основного показателя в формировании окислительно-восстановительного статуса клетки 72
3.1.2. Оценка экспрессии генов -глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы – ключевых ферментов синтеза GSH de novo в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 73
3.1.3. Оценка экспрессии гена и активности -глутамилтрансферазы в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 76
3.1.4. Оценка экспрессии гена и активности глутатионредуктазы в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 78
3.2. Оценка экспрессии генов и активности изоформ GSTP1-1, GSTA4-4, GSTT1-1, GSTM1-1 и GSTK1-1 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 80
3.3. Оценка экспрессии генов изоформ Grx1 и Grx2 и активности глутаредоксина в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 85
3.4. Оценка транскрипционного фактора Nrf2 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках 87
3.5. Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием перекиси водорода 89
3.6. Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием цисплатина 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 108
Заключение 117
Выводы 119
Список использованной литературы 120
Благодарности 155
- Роль соотношения восстановленного и окисленного глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах
- Противоопухолевое действие цисплатина. Роль алкилирования ДНК и генерации активных форм кислорода
- Оценка экспрессии генов и активности изоформ GSTP1-1, GSTA4-4, GSTT1-1, GSTM1-1 и GSTK1-1 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках
- Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием цисплатина
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Редокс-зависимые механизмы лежат в основе регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Редокс-гомеостаз поддерживают ферментные системы, регуляция действия которых осуществляется через редокс-зависимый сигналинг. При недостаточном уровне антиоксидантной защиты активные формы кислорода (АФК) приводят к развитию окислительного стресса, вызывающего повреждения молекул липидов, белков и нуклеиновых кислот, нарушение функциональной способности клетки, что приводит к ее гибели. Вследствие этого окислительный стресс служит одной из причин развития многочисленных патологических состояний, в том числе онкологических заболеваний [Sies H. et al., 2017].
Из систем, поддерживающих внутриклеточный редокс-гомеостаз, основными являются соотношения восстановленных и окисленных форм НАД, тиоредоксина и глутатиона [Go Y.-M., Jones D.P., 2008], среди которых лидирующее положение занимает соотношение GSH/GSSG вследствие наиболее высокой внутриклеточной концентрации этого трипептида. В связи с этим, в последнее время большое внимание уделяется изучению механизмов контроля соотношения GSH/GSSG, рассматриваемого в качестве главного показателя клеточного редокс-статуса, а также эффективности действия GSH-зависимых ферментов, в первую очередь, глутатионтрансферазы и глутаредоксина, принимающих активное участие как в антиоксидантной защите, так и в процессах тиол-дисульфидного обмена, связанных с редокс-зависимой регуляцией функциональной активности белков и ферментов [Shen D.W. et al., 2012; Galluzzi L. et al., 2014; Fra A. et al., 2017].
В настоящее время активно исследуется роль редокс-зависимых процессов в развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток [Kuo M.T., 2009; Cort A. et al., 2016; Davalli P. et al., 2018], которая значительно снижает эффективность химиотерапии онкологических больных. Природа формирования лекарственной устойчивости носит многофакторный характер, и наиболее известные механизмы её развития представляют собой инактивацию лекарственных средств, снижение поступления лекарств в клетку за счет ускорения их обратного транспорта из клетки, амплификацию молекул-мишеней цитостатиков, подавление систем клеточной гибели [Norouzi-Barough L. et al., 2018]. Однако вклад редокс-зависимых ферментных систем, поддерживающих и регулирующих клеточный редокс-гомеостаз, в развитие устойчивости опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам, обладающим прооксидантным действием, все еще остается малоизученным.
Широко используемый в онкологической практике противоопухолевый препарат цисплатин находится в одном ряду с препаратами, для которых эффективность использования в терапии ограничена развитием лекарственной устойчивости опухолей [Achkar I.W. et al., 2018]. Цисплатин обладает прооксидантным действием, в связи с чем актуальным становится исследование роли изоформ глутатионтрансферазы и глутаредоксина в редокс-зависимых процессах формирования устойчивости опухолевых клеток к цисплатину.
Степень разработанности темы.
Первоначально цисплатин рассматривался как алкилирующий агент [Fichtinger-Schepman A.M.J. et al.; 1985; Eastman A., 1986], однако в настоящее время установлена его способность активировать генерацию активных форм кислорода [Bratasz A. et al., 2006; Berndtsson M. et al., 2007; Rubera I. et al., 2013; Filippova M. et al., 2014; Yuan Y. et al., 2015; Quintanilha J.C.F. et al., 2017]. В то же время, роль редокс-зависимых механизмов в
развитии устойчивости злокачественных новообразований к действию этого
противоопухолевого препарата остается малоизученной.
Несмотря на известную роль глутатиона и глутатионтрансферазы в детоксикации цисплатина [Goto S. et al., 1999; Peklak-Scott C. et al., 2008], не изучен вклад изоформ глутатионтрансферазы, участвующих в антиоксидантной защите [Dusinska M. et al., 2001; Desmots F. et al., 2002; Belzacq A. S. et al., 2003; Manevich Y. et al., 2004; Breton C. V. et al., 2007], в редокс-зависимые процессы формирования лекарственной устойчивости опухолевых клеток к цисплатину. Глутаредоксин, как тиоловая оксидоредуктаза, катализирует процессы восстановления дисульфидов и деглутатионилирования и участвует в редокс-зависимой регуляции клеточного сигналинга [Anathy V. et al., 2009; Gallogly M.M. et al., 2009; Stroher E. et al., 2012; Allen E.M.G. et al., 2012; Hanschmann E.M. et al, 2013; Liu X.B., 2015], однако не изучена его роль в развитии резистентности опухолевых клеток к прооксидантному действию цисплатина.
Цель исследования. Изучить роль изоформ глутатионтрансферазы и
глутаредоксина в редокс-зависимых процессах формирования лекарственной
устойчивости ряда опухолевых клеток к цисплатину.
Задачи исследования:
определить соотношение GSH/GSSG, установить характер экспрессии генов ключевых ферментов синтеза GSH de novo и восстановления его из окисленной формы, оценить активность этих ферментов при развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток человека эритролейкемии K562, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и аденокарциномы яичника SKOV-3 к цисплатину;
установить характер экспрессии генов редокс-зависимых изоформ глутатионтрансферазы GSTP1-1, GSTA4-4, GSTТ1-1, GSTМ1-1, GSTК1-1 и оценить активность GST при развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток к цисплатину;
установить характер экспрессии генов изоформ глутаредоксина Grx1 и Grx2 и оценить активность Grx при развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток к цисплатину;
оценить содержание редокс-зависимого транскрипционного фактора Nrf2 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках;
оценить роль глутатион-зависимых процессов в редокс-регуляции апоптоза у опухолевых клеток, чувствительных и резистентных к цисплатину.
Научная новизна. Впервые показано, что формирование устойчивости опухолевых клеток человека эритролейкемии K562, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и аденокарциномы яичника SKOV-3 к широко используемому в химиотерапии онкологических заболеваний противоопухолевому препарату цисплатину сопровождается ростом экспрессии генов изоформ глутатионтрансферазы GSTP1-1, GSTA4-4, GSTТ1-1, GSTМ1-1, GSTК1-1, а также изоформ глутаредоксина Grx1, Grx2, играющих значительную роль в системе антиоксидантной защиты, редокс-зависимом сигналинге и антиапоптотических механизмах, что можно расценивать как важную часть адаптивного антиоксидантного ответа на окислительный стресс, вызываемый ростом концентрации цисплатина, обладающего прооксидантным действием. Установлено, что повышение индекса клеточного редокс-статуса – соотношения GSH/GSSG, в резистентных клетках обусловлено скоординированным ростом экспрессии генов -GCSL, -GCSH, GSS, что создает оптимальные условия для синтеза GSH de novo и указывает на усиление роли GSH-зависимых процессов при формировании резистентности к цисплатину. Впервые показано, что скоординированный рост экспрессии генов изоформ GST и Grx (hGSTP1, hGSTA4, GLRX1, GLRX2), а также генов ключевых ферментов синтеза GSH de novo (-GCSH, -GCSL, GSS, Gt) в резистентных клетках может объясняться повышением
внутриклеточного содержания редокс-зависимого транскрипционного фактора Nrf2. Установлено, что сохранение высокого уровня соотношения GSH/GSSG и активностей GST и Grx способствуют защите резистентных клеток от индуцированного окислительным стрессом апоптоза при действии как Н202, так и цисплатина, что сопровождается отсутствием или низким ростом АФК и отсутствием изменения соотношений Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты работы значительно расширяют фундаментальные представления о механизмах развития лекарственной резистентности опухолевых клеток, показывая важный вклад изоформ глутатионтрансферазы и глутаредоксина в развитие адаптивного антиоксидантного ответа как редокс-зависимого пути формирования устойчивости к противоопухолевым препаратам, обладающим прооксидантным действием. Полученные данные могут быть использованы для создания новых схем химиотерапии с учетом установленной роли изоформ глутатионтрансферазы и глутаредоксина.
Методология и методы диссертационного исследования.
При выполнении работы в методологическом плане использован ряд современных экспериментальных методов: МТТ-тест для оценки жизнеспособности клеток, определение содержания белка методом Бредфорда, оценка экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР, определение уровня белков методом Вестерн-блоттинга, оценка апоптоза методом проточной цитофлуориметрии с помощью окрашивания клеток пропидий иодидом и аннексином V, спектрофотометрические методы для определения активности ферментов, флуоресцентный метод для определения уровня образования супероксид-анион радикала. Оценка статистической значимости различий проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Статистическая обработка результатов проводилась с применением программных пакетов Statistica 10, BioStat.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При формировании резистентности к цитотоксическому препарату цисплатину, обладающему прооксидантными свойствами, в клетках человека эритролейкемии К562, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и аденокарциномы яичника SKOV-3 наблюдается скоординированное изменение экспрессии генов ключевых ферментов синтеза глутатиона de novo и ферментов глутатион-зависимой системы, обладающих антиоксидантными свойствами и участвующими в тиол-дисульфидном обмене, - изоформ глутатионтрансферазы и глутаредоксина, что свидетельствует о важном вкладе этих ферментов в развитие адаптивного антиоксидантного ответа в резистентных клетках.
-
Резистентные к цисплатину клетки характеризуются ростом уровня соотношения GSH/GSSG (показателя клеточного редокс-статуса) за счет повышения внутриклеточного содержания GSH, что обеспечивается скоординированным ростом экспрессии генов ключевых ферментов синтеза GSH de novo - каталитической (y-GCSH), регуляторной (у-GCSL) субъединиц у-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы (GSS). В резистентных клетках К562/CDDP и MCF-7/CDDP этот эффект усиливается повышением экспрессии гена -глутамилтрансферазы (Gt).
3. Формирование резистентности к цисплатину сопровождается ростом экспрессии генов
изоформ глутатионтрансферазы, обладающих антиоксидантными и детоксицирующими
свойствами: hGSTPl, hGSTA4, hGSTTl, hGSTMl и hGSTKl. Уровень экспрессии генов
hGSTMl и hGSTKl не изменяется в клетках MCF-7/CDDP и SKOV-3/CDDP,
соответственно.
4. Для резистентных клеток K562/CDDP, MCF-7/CDDP, SKOV-3/CDDP характерно
повышение экспрессии генов митохондриальной и цитозольной изоформ глутаредоксина
(Grx1 и Grx2) наряду с высоким уровнем активности Grx по отношению к смешанным
дисульфидам.
-
Скоординированный рост экспрессии генов изоформ GST и Grx (hGSTP1, hGSTA4, GLRX1, GLRX2), а также генов ключевых ферментов синтеза GSH de novo (-GCSH, -GCSL, GSS, Gt) может объясняться повышением внутриклеточного содержания редокс-зависимого транскрипционного фактора Nrf2 в резистентных клетках.
-
У резистентных клеток K562/CDDP, MCF-7/CDDP и SKOV-3/CDDP, в отличие от чувствительных, действие как Н2О2, так и цисплатина при выбранных концентрациях не приводит к активации апоптотической гибели клеток и характеризуется отсутствием или низким ростом АФК, сохранением соотношений Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, чему способствует высокий уровень соотношения GSH/GSSG и активностей GST и Grx.
Степень достоверности результатов работы.
Выводы, представленные в данной работе, подтверждаются экспериментальными данными. Для решения поставленных задач в работе использовались современные инструментальные методы. Используемые методики исследования и проведенные расчеты корректны и статистически достоверны.
Апробация результатов работы.
Результаты диссертационного исследования были представлены на 9
Международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные
патологии» (Судак, Крым, Украина, 2013), XХII Международной конференции и
дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине,
биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2014), XVI
международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2014), 8
национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные
формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2014),
5th Asia Pacific ISSX Meeting (Tianjin, China, 2014), 14th International Congress on Amino
Acids, Peptides and Proteins (Vienna, 2015), IX Международной конференции
"Биоантиоксидант" (Москва, 2015), Седьмой Всероссийской научно-практической
конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов»
– Молодежного симпозиума «Медико-биологические и экологические аспекты
компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2015), Annual Meeting of
Society for Free Radical Research-Europe (SFRR-E) 2016 (Budapest, Hungary, 2016),
Международных конференциях и дискуссионных научных клубах «Новые
информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Россия, Крым, 2016, 2017), V Съезде физиологов СНГ, V Съезде биохимиков России (Сочи–Дагомыс, 2016), Oxygen Club of California (OCC) World Congress and Annual SFRR-E Conference 2017: Metabolic Stress and Redox Regulation (Berlin, Germany, 2017).
Личное участие автора.
Личный вклад автора состоял в подготовке образцов, проведении биохимических экспериментов, обработке, анализе и интерпретации полученных данных. Автор участвовал в подготовке публикаций по материалам исследований. Автором лично проведены научно-информационный поиск, анализ и обобщение литературных данных, формулирование положений и выводов при написании диссертационной работы.
Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликованы 19 работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях из Перечня ВАК.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии имени академика Березова Т.Т. Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и используются при подготовке лекционного курса «Медицинская энзимология» для студентов III курса, обучающихся по специальности «Лечебное дело».
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста. Она включает введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, заключение, выводы, список сокращений, список литературы, 17 таблиц и 25 рисунков. Список литературы содержит 397 ссылок (24 отечественных и 373 зарубежных).
Роль соотношения восстановленного и окисленного глутатиона в клеточных редокс-зависимых процессах
В молекуле GSH остаток цистеина выступает ключевым функциональным звеном, наделяя ее реакционноспособной тиольной группой. Реакции с участием GSH протекают как неферментативно, так и катализируются ферментами, для которых глутатион является косубстратом. Защита клеток от токсического действия окислительного стресса является одной из важнейших функций глутатиона. В первую очередь, он как низкомолекулярный антиоксидант в качестве эффективного скэвенджера («ловушки») различных свободных радикалов вносит вклад в неферментативную антиоксидантную защиту. Например, GSH может вступать в реакцию с такими соединениями, как гидроксильный радикал (ОН), гипохлорит СЮ", синглетный кислород, пероксинитрит (ONOO ) [125, 282]. GSH используется глутатионпероксидазой для восстановления перекиси водорода. С помощью глутатионпероксидазы восстанавливаются до соответствующих спиртов и органические гидроперекиси, такое восстановление катализируется и Se-независимой глутатионтрансферазой, где глутатион также используется в качестве косубстрата:
ROOH + 2GSH GPx ROH + GSSG + Н20,
ROOH + 2GSH GST ROH + GSSG + Н20.
Весьма значимый вклад в организацию редокс-зависимых процессов принадлежит еще двум GSH-зависимым ферментам - глутатионтрансферазе и глутаредоксину. Отражению этого материала посвящены отдельные разделы данной главы.
Соотношение GSH/GSSG для цитоплазмы в нормальных условиях достаточно высоко. Для клеток печени это соотношении составляет 100:1, но в условиях окислительного стресса падает до величины 4:1 [262]. Высокий базовый уровень пула восстановленного глутатиона по отношению к окисленному поддерживается и в клетках других тканей [80]. Для эндоплазматического ретикулума (ЭПР) характерно более низкое соотношение GSH/GSSG, поскольку в нем происходит процесс фолдинга белков с участием дисулфидизомеразы из семейства дитиол/дисулфидоксидоредуктаз, осуществляющей образование дисульфидных связей при формировании нативной структуры сворачиваемых белков, что требует окисления тиольных остатков в активном центре дисулфидизомеразы [373]. Осуществить точное измерение соотношения GSH/GSSG затруднительно, но приблизительные оценки этой величины получены. Например, для микросом печени крысы эта величина лежит в пределе от 3:1 до 5:1 [43], GSH в ЭПР служит для обеспечения оксидоредуктазной каталитической функции, а также как редокс-буфер для защиты от АФК, генерируемых в ЭПР, предотвращая при этом от возможного развития стресса ЭПР (подробнее см. в разделе 1.6). Для ядерного пула глутатиона известно, что его уровень меняется по ходу клеточного цикла. Отмечено четырехкратное превышение содержания ядерного GSH над цитозольным на стадии пролиферации и примерно равное распределение GSH в цитоплазме и ядре наблюдаются у клеток в фазе G0/Gi [253]. GSH в ядре необходим для защиты ядерной ДНК от возможных повреждений за счет окисления и действия ионизурующего облучения, что необходимо для надежного хранения и считывания наследственной информации. Кроме того, GSH является донором атома водорода при восстановлении рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды при синтезе ДНК [164]. Митохондрия - это клеточная органелла, которая является местом постоянной генерации АФК, поэтому сбалансированная работа редокс-системы GSH/GSSG чрезвычайно важна для поддержания редокс-гомеостаза митохондриального матрикса для осуществления защиты ДНК, РНК, белков и липидов от действия АФК [134]. Синтез GSH идет в цитоплазме и за счет активного транспорта пополняется его пул в митохондриях. В случае истощения содержания внутриклеточного GSH возникают благоприятные условия для нарушения работы митохондрии в результате развития окислительного стресса.
Помимо важнейшего вклада в антиоксидантную защиту глутатион работает как медиатор многочисленных процессов, в которых осуществляется обратимое окисление остатков цистеина в различных белковых молекулах. Возможно как неферментативное, так и ферментативное S-глутатионилирование, т.е. присоединение молекулы GSH к этим остаткам с образованием дисульфидной связи (формирование смешанных дисульфидов), что защищает цистеиновые остатки от возможного необратимого окисления до сульфоновой кислоты (Cys– SO3H) через стадии сульфеновой (Cys–SOH) и сульфиновой кислот (Cys–SO2H), а следовательно, защищает сами белки от утраты способности выполнять свои функции. Образование сульфеновой кислоты – первый этап окисления тиольной группы с образованием кислородсодержащего интермедиата. Сульфеновая кислота неустойчива и обычно служит промежуточным интермедиатом, при окислении тиолов до дисульфидов или до сульфиновой кислоты. Процессам обратимого и необратимого окисления тиоловых остатков способствует наличие АФК (в осносном перекиси водорода) и активных форм азота (АФА). При взаимодействии тиолов с перекисью водорода на первом этапе образуется сульфеновая кислота; при избытке окислителя образуется сульфиновая и далее сульфоновая кислота, которую при физиологических условиях невозможно восстановить, т.е. такая модификация белка является необратимой [309]. Органические гидроперекиси как и Н2О2, а также различные природные соединения, например, дегидроаскорбиновая кислота, флавины и хиноны или химические реагенты: 5,5 -дитио-бис(2-нитробензойная кислота), азосоединения, редокс-красители, галогены и селениты, – могут вносить свой вклад в окисление тиолов до сульфеновой кислоты [53, 187]. Важно отметить, что при физиологических условиях при нейтральном рН у цистеина, находящегося в свободном состоянии, значение рК равно 8,5; при этих условиях окислительные модификации оказываются невозможными. Когда цистеин находится в составе белков, могут создаваться условия, при которых он активируется, происходит переход из протонированного состояния в состояние тиолат-аниона (RS–), когда его рК приобретает значения ниже нейтрального, это происходит благодаря различным факторам, среди которых действие соседних основных аминокислотных остатков (гистидина, лизина и аргинина), водородные связи, связывание с субстратом [66]. Такая диссоциированная форма обеспечивает реакционноспособность значимых для работы фермента остатков цистеина. В виде тиолат аниона остатки цистеина могут взаимодействовать с пероксинитритом ONOO с образованием сульфеновой кислоты. Кроме того, определенные АФА при взаимодействии с остатками цистеина могут приводить к появлению нитрозотиольных интермедиатов (RS-NO), гидролиз которых как и сульфенил-галогенов также приводит к появлению сульфеновой кислоты [53, 376].
При взаимодействии двух тиолов образуется дисульфид. В общем виде реакция выглядит следующим образом:
2R-SH R-SS-R + 2H+ +2е".
Обратимый переход тиол дисульфид - довольно распространенный биохимический редокс-процесс, протекающий при мягких условиях с образованием относительно стабильной дисульфидной связи. Такая связь может образовываться между тиильными радикалами двух независимых свободных тиолов, находящихся вблизи друг от друга, либо в составе одного белка, либо у двух разных белков. Образование дисульфидных связей в полипептидных цепях сопровождает формирование третичной структуры белков, но редокс-изменения сульфгидрильных остатков важны не только для фолдинга белков, но и для модуляции активности белков и передачи редокс-сигналинга.
Еще один наиболее значимый путь формирования дисульфидов в клетках - реакции тиол-дисульфидного обмена, когда происходит переход двух электронов с пары восстановленных остатков цистеина на цистеины, уже объединенные дисульфидной связью. При этом данная связь распадается с образованием двух свободных тиолов, но окисляется первая пара тиолов с появлением новой дисульфидной связи. Ферменты, способствующие данному обмену, осуществляют его, катализируя обмен дисульфидными связями между связями, локализованными в своей собственной структуре, и в белках-мишенях. Классическим примером таких ферментов является дисулфидизомераза, о которой уже упоминалось раньше. Дисулфидизомерза в большом количестве присутствует в ЭПР эукариотов; содержит пару редокс-активных остатков цистеина в активном центре. Эти остатки меняют свой статус, становясь либо свободными тиолами, либо образуя дисульфидную связь. В ЭПР дисулфидизомераза катализирует окисление новых формирующихся белков и участвует в изомеризации белков с неверно сформированными дисульфидными связями, добиваясь построения их нативной структуры [373].
Процесс S-глутатионилирования сопровождается образованием смешанных дисульфидов, при этом если в реакцию вступает белок с модифицированным цистеиновым остатком в виде сульфеновой кислоты, то в реакции участвует GSH: P-SOH + GSH- P-SSG+H0.
Противоопухолевое действие цисплатина. Роль алкилирования ДНК и генерации активных форм кислорода
Цисплатин (цис-диаминдихлорплатина) – содержащий платину противоопухолевый препарат, который по своей значимости в области лечения онкологии является образцом использования металлов в медицине. На сегодняшний день цисплатин и его аналог карбоплатин являются наиболее часто используемыми противораковыми препаратами. Цисплитин представляет из себя нейтральное квадратное планарное комплексное соединение, где металлоцентром является платина в степени окисления +2, соединенная с двумя атомами хлора и двумя аммониевыми радикалами в цис-положении (рис. 2) [71].
Изучение механизма цитотоксического действия цисплатина началось с установления его алкилирующего действия на молекулы ДНК с образованием внутри- и межспиральных сшивок, которые изменяют структуру ДНК, что приводит к подавлению репликации, а также синтеза РНК и белка. В дальнейшем было показано, что в клетке есть и другие мишени цисплатина. Общее влияние цисплатина на указанные объекты приводит к гибели клетки через апоптоз, некроз или одновременно через эти два пути [92, 142]. Также гибель клеток может реализовываться в результате незавершенной апоптотической программы, развития репликативного клеточного старения [370], митотической катастрофы [105] и аутофагии [390].
Цисплатин эффективен при лечении многих солидных опухолей, например, опухолей яичек, яичников, шейки матки, мочевого пузыря, головы и шеи, мелкоклеточного рака легких и немелкоклеточного рака легких др. [60, 135]. Обычно используется внутривенное введение цисплатина, такой способ в 50 раз эффективнее по сравнению с интраперитонеальным введением. Однако, цисплатин очень токсичен и его клиническое использование ограничивается по дозе из-за побочных эффектов, таких как нефротоксичность, нейротоксичность, миелотокситность, ототоксичность, появление краткосрочных неврологических симптомов, дисфункция вестибулярного аппарата [135, 264, 299]. Так как цисплатин является ингибитором синтеза ДНК, он оказывает сильное воздействие на нормальные ткани с высокой скоростью пролиферации, такие как костный мозг, тонкий кишечник, волосяные фолликулы, кожа. Кроме того, часто встречается развитие устойчивости опухолевых клеток к цисплатину, а при мультилекарственной устойчивости к целому ряду структурно отличных друг от друга соединений, в результате чего гибель клеток при используемой терапии снижается во много раз по сравнению с прогнозируемой.
После введения цисплатина пациентам внутривенно, препарат в большой степени связывается с белками плазмы, что вызвано сильной реактивностью платины в отношении серы тиольных групп остатков цистеина белков плазмы. Так, около 90% платины в крови связано с альбумином и другими белками, что приводит к инактивации большого количества цисплатина [194]. Для связывания с клеточными нуклеофилами необходимо замещение ионов хлора из координационной сферы цисплатина на другие лиганды с образованием положительно заряженного производного. В кровяном русле цисплатин находится в стабильном нейтральном состоянии. Вне клетки концентрация ионов хлора 100 мМ, однако его внутриклеточные концентрации ионов находятся в пределах 2-30 мМ. При таких условиях происходит гидратация цисплантина, одна или две молекулы воды занимают места хлора, с образованием катионов [Pt (NH3)2(H2O)Сl]+ или [Pt (NH3)2(H2O)2]2+, соответственно. Эти соединения очень реакционноспособны в отношении нуклеофильных центров биомолекул, потому что Н2О в качестве лиганда замещается намного легче, чем Cl– [183].
Транспорт в клетку цисплатина может осуществляться за счет пассивной диффузии и эндоцитоза, а также в большой степени при участии высокоафинного транспортера меди Ctr1 [222]. Другими транспортерами, участвующими в процессе поступления цисплатина в клетку, являются белки из семейства ОСТ (от англ. organic cation transporter), осуществляющих перенос органических катионов. Обнаружены представители этого семейства в разных органах. Так, основная изоформа в печени – ОСТ1 [207], OCT2 является главным транспортером цисплатина в почках, где он экспрессируется в проксимальных канальцах как у животных, так и у человека [78], OCT3 обнаруживается во многих органах, максимальная экспрессия обнаруживается в плаценте и сердце [207]. При этом важно отметить, что цисплатин не транспортируется ОСТ1 у человека, и это коррелирует с тем, что для печени не наблюдается существенной токсичности при действии данного препарата [386]. Напротив, нефротоксичность является основным побочным эффектом цисплатина, ограничивающим повышение терапевтической дозы, что наблюдается на фоне высокой экспрессии ОСТ2 в почках.
Обратный транспорт цисплатина из клетки в значительной степени связан с работой транспортеров меди из субсемейства 1 АТФ-аз Р-типа АTP7B и АTP7А [319, 321]. Транспортер ATP11B из субсемейства 4 АТФ-аз Р-типа также отмечен как участник процесса обратного транспорта цисплатина из клетки [271]. Кроме того, для транспортеров MRP1 и MRP2 из суперсемейства АВС-белков показано их участие в удалении из клетки цисплатина [89, 143, 155].
После проникновения цисплатина в клетку, он реализует свои алкилирующие свойства. Возможно образование нескольких различных вариантов аддуктов цисплатина и ДНК. Изначально образуются монофункциональные аддукты цис-[Pt(NH3)2(H2O)]:ДНК, далее почти все они превращаются в бифункциональные внутри- или межцепочечные аддукты цис-[Pt (NH3)2]:ДНК, которые блокируют репликацию и/или препятствуют транскрипции [290]. Атомы азота в гуанине и аденине, локализующиеся в главном желобке двойной спирали ДНК, являются наиболее подходящими для замещения в координационной сфере платины молекул воды из-за того, что эти атомы более доступны и обладают нуклеофильными свойствами. Анализ очищенной ДНК, обработанной цисплатином, или выделенной у больных, которых лечили цисплатином, показал, что главные цисплатин–ДНК комплексы, составляющие около 90% от общего количества аддуктов, – это 1,2-внутрицепочечные d(GpG) сшивки (между соседними гуанинами), на их массовую долю приходится 50-65%, и 1,2-внутрицепочечные d(ApG) сшивки (между аденином и соседним гуанином от 5` к 3`) с массовой долей около 25%. Кроме того, присутствуют 1,3-внутрицепочечные d(GpХpG) сшивки (между пуринами, разделенными одним или более основаниями, отличными от аденина), составляющие менее 10%, а также минорное количество иных межцепочечных сшивок, монофункциональных аддуктов и аддуктов ДНК-цисплатин-белок [107, 117].
До попадания в ядро и образования аддуктов с ДНК цисплатин встречает большое количество других потенциальных клеточных мишеней. При прохождении цисплатина через клеточную мембрану может происходить взаимодействие атома платины на уровне координационной сферы с некоторыми компонентами липидного бислоя, которые содержат атомы азота и серы, – фосфолипидами и в особенности фосфотидилсерином [340]. После того, как цисплатин оказался внутри клетки, он подвергается гидратации и взаимодействует со своими клеточными мишенями. В цитоплазме многие клеточные компоненты и макромолекулы, обладающие нуклеофильными сайтами, подвергаются атаке цисплатина [192]. Есть исследования, в которых сообщается, что только 5-10 % ковалентно связанного цисплатина обнаруживается во фракциях геномной ДНК, тогда как 75-85 % этого препарата связано с белками и другими клеточными компонентами [27]. Существует еще более категоричное мнение, что только около 1 % внутриклеточного цисплатина взаимодействует с ядерной ДНК с образованием различных аддуктов [292]. Наиболее часто среди тиолсодержащих соединений, взаимодействующих с цисплатином, называют восстановленный глутатион и металлотионины [123]. Цисплатин способен влиять на активность ферментов, рецепторов и других белков путем связывания с атомами серы цистеиновых и/или метиониновых остатков и с атомами азота остатков гистидина, что в итоге может вносить вклад в токсичность цисплатина [123]. Цисплатин аккумулируется кроме цитоплазмы и ядра и в других клеточных органеллах, таких как митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, плазматическая мембрана, цитоскелет, что способствует активации в них специфических сигнальных каскадов, способных стимулировать гибель клетки [131].
Оценка экспрессии генов и активности изоформ GSTP1-1, GSTA4-4, GSTT1-1, GSTM1-1 и GSTK1-1 в чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клетках
Результаты проделанной работы показали, что развитие резистентности опухолевых клеток К562/S, MCF-7/S и SKOV-3 к цисплатину, обладающему прооксидантным действием, связано с изменением экспрессии генов редокс-зависимых изоформ GST, вносящих существенный вклад в клеточную антиоксидантную защиту – GSTP1-1, GSTA4-4, GSTТ1-1, GSTМ1-1, GSTК1-1.
Оценка активности GST по отношению к 1-хлор-2,4-динитробензолу (универсальному субстрату для всех изоформ GST) позволила обнаружить ее значительное повышение во всех типах резистентных клеток: в клетках К562/СDDP, MCF-7/СDDP и SKOV-3/CDDP – в 2,5, 2,8 и 2 раза, соответственно (таблица 6). Отмечен также рост активности по отношению к этакриновой кислоте, специфичному для GSTP1-1 субстрату, в 1,7, 2,5 и 1,4 раза, соответственно. Рост экспрессии гена hGSTP1 обнаружен во всех резистентных клетках (рис. 9, а, в). Установлено, что по сравнению с чувствительными клетками уровень мРНК GSTP1-1 в клетках К562/СDDP, MCF-7/СDDP и SKOV-3/CDDP был выше в 2, 2,8 и 1,3 раза, соответственно. Следует отметить, что GSTP1-1 участвует в инактивации продуктов окисления ДНК и липидов, в том числе пропеналей азотистых оснований и акролеина, по отношению к которым GSTP1-1 обладает высокой специфичностью [49].
Рост экспрессии гена hGSTA4 обнаружен у всех исследуемых сублиний резистентных клеток (рис. 9, б, г). В клетках К562/СDDP, MCF-7/СDDP и SKOV-3/CDDP рост уровня мРНК GSTA4-4 был практически одинаковым и превышал таковой в чувствительных клетках в 2,8, 2,8 и 2,5 раза, соответственно. Оценка активности GST по отношению к 4-гидрокси-2,3-ноненали (специфичному субстрату для изоформы GSTA4-4), продукту перекисного окисления липидов, способному вызывать деструктивную модификацию белков и ДНК и активацию апоптоза [101], позволила установить её рост в 1,9, 1,8 и 1,8 раза, соответственно (таблица 6) [6].
Во всех трех линиях резистентных к цисплатину опухолевых клеток обнаружен рост экспрессии гена изоформы GSTТ1-1 (рис. 10, а, в), которая способна предотвращать окисления пиримидиновых оснований в ДНК [106]. В клетках К562/СDDP, MCF-7/СDDP и SKOV-3/CDDP уровень мРНК GSTТ1-1 превышал таковой в чувствительных клетках в 2, 2,4 и 2,9 раза, соответственно.
Повышение экспрессии гена hGSTM1 установлено в клетках К562/СDDP и SKOV-3/CDDP (рис. 10, б, г). При этом более высокий рост уровня мРНК GSTМ1-1 отмечен в клетках К562/СDDP (в 2 раза). GSTМ1-1 выступает в качестве ловушки свободных радикалов и тормозит окисление молекул ДНК, защищая от появления 8-гидрокси-2 -дезоксигуанозина [63]. Кроме того, наряду с GSTP1-1 для GSTМ1-1 отмечено участие в антиапоптотических механизмах регуляции клеточного сигналинга посредством инактивации МАР-киназ – ASK1 и JNK1 в результате белок-белкового взаимодействия [158].
Митохондриальная изоформа GSTK1-1 обладает пероксидазной активностью по отношению к органическим гидроперекисям [269]. В клетках К562/СDDP и MCF-7/СDDP установлено повышение экспрессии гена hGSTK1. В этих клетках обнаружен одинаковый (в 2,6 раза) рост уровня мРНК GSTК1-1 (рис. 11).
Таким образом, в процессе формирования устойчивости опухолевых клеток к цисплатину был обнаружен рост экспрессии генов изоформ GSTP1-1, GSTA4-4, GSTТ1-1, GSTМ1-1 и GSTК1-1, вносящих значимый вклад в работу системы антиоксидантной защиты, процессов детоксикации, а также в регуляцию клеточного сигналинга, отвечающего за ингибирование апоптоза в резистентных опухолевых клетках, что свидетельствует в пользу значимости функционирования различных изоформ глутатионтрансферазы в преодолении цитотоксического действия цисплатина. Полученные результаты также свидетельствуют о наличии зависимости характера экспрессии этих генов от генеза опухолевых клеток.
Оценка активности глутатионтрансферазы и глутаредоксина, соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, уровня активных форм кислорода у чувствительных и резистентных к цисплатину опухолевых клеток при активации апоптоза действием цисплатина
На рисунках 20 – 22 представлены данные оценки апоптоза методом проточной цитофлуориметрии по анализу клеток, окрашенных PI и AnnV-FITC в чувствительных и резистентных к цисплатину клетках. Установлено, что после инкубации чувствительных и резистентных клеток линий K562, MCF-7, SKOV-3 (в течение 24 часов c 1, 2,5 и 0,5 мкМ цисплатина, соответственно) в чувствительных клетках наблюдался рост апоптотической гибели (в 4, 2,3 и 3,4 раза, соответственно) по сравнению со спонтанным уровнем апоптоза. Напротив, в резистентных клетках не наблюдалось активации апоптоза (рис. 23). У чувствительных клеток число событий поздней апоптотической гибели после инкубации с цисплатином повышалось.
При оценке влияния цисплатина на уровень АФК обнаружен его рост в клетках K562/S, MCF-7/S и SKOV-3/S (в 1,6, 2,5, и 1,6 раза, соответственно) (рис. 24). Напротив, в резистентных клетках K562/CDDP и SKOV-3/CDDP не отмечено достоверно значимого (p 0,05) изменения уровня АФК (рис. 24, а, в). В резистентных клетках MCF-7/CDDP установлено повышение уровня АФК (в 1,7 раза), однако в меньше степени, чем в чувствительных клетках MCF-7 (в 2,5 раза) (рис. 24, б).
Оценка внутриклеточного уровня белков Bcl-2, Bcl-xl и Bax методом Вестерн-блоттинга позволила установить, что инкубация клеток дикого типа K562/S, MCF-7/S, SKOV-3/S с цисплатином приводило к заметному снижению уровня Всl-2, Bcl-xl и росту уровня Bax (рис. 25, А). Напротив, в резистентных клетках практически не отмечалось изменения внутриклеточного содержания этих белков, тогда как изначально резистентные клетки обладали изначально более высоким в сравнении с чувствительными клетками уровнями Bcl-2 и Bcl-xl (рис. 25, Б).
Установлено, что инкубация с цисплатином вызывает снижение соотношения Bcl-2/Bax в чувствительных клетках K562/S, MCF-7/S, SKOV-3/S: в 3,7, 5,5 и 6,0 раза, соответственно (таблица 13), тогда как в резистентных клетках это соотношение практически не менялось.
Соотношение Bcl-xl/Bax также снижалось в чувствительных клетках: в 5,5, 5,0 и 8 раз в клетках K562/S, MCF-7/S, SKOV-3/S, соответственно (таблица 14). Напротив, в резистентных клетках не обнаружено изменения этого соотношения.
После инкубации с цисплатином в клетках K562/S, MCF-7/S и SKOV-3/S установлено снижение соотношения GSH/GSSG (1,5, 2,4, и 1,5 раза, соответственно) (таблица 15). В резистентных клетках K562/CDDP и SKOV-3/CDDP не было отмечено достоверно значимого (p 0,05) изменения GSH/GSSG. В то же время в резистентных клетках MCF-7/CDDP значение GSH/GSSG оказалось сниженным в 1,6 раза, однако в меньшей степени, чем в чувствительных клетках MCF-7/S (в 2,4 раза).
Действие цисплатина приводило к снижению активности GST в чувствительных K562, MCF-7 и SKOV-3 клетках по отношению к 4-гидрокси-2,3-ноненали – специфичному субстрату для изоформы GSTA4-4 (в 1,6, 1,8, 1,6 раза, соответственно), к этакриновой кислоте – специфичному субстрату для изоформы GSTP1-1 (в 1,5, 1,6 и 1,5 раза, соответственно) и к универсальному субстрату для всех изоформ GST – 1-хлор-2,4-динитробензолу (в 1,5, 1,6 и 1,5 раза, соответственно) (таблица 16). В то же время активность GST в резистентных клетках практически не изменялась.
Оценка активности глутаредоксина показала ее снижение в чувствительных клетках К562, MCF-7 и SKOV-3 (в 1,6, 1,8 и 1,5 раза, соответственно) и отсутствие изменений в устойчивых клетках (таблица 17).
Таким образом, действие цисплатина, обладающего прооксидантным эффектом, приводило к росту уровня АФК и снижению активностей GST и Grx, а также соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax, что способствовало активации апоптоза в чувствительных клетках K562/S, MCF-7/S, SKOV-3/S. Напротив, в резистентных клетках K562/CDDP, MCF-7/CDDP, SKOV-3/CDDP наблюдались сохранение высокого уровня активности GST и Grx, низкой генерации АФК, а также высокого уровня соотношений GSH/GSSG, Bcl-2/Bax и Bcl-xl/Bax после воздействия цисплатина. Аналогичные результаты были продемонстрированы при индукции окислительного стресса в опухолевых клетках при действии перекиси водорода (см. предыдущий раздел). Полученные данные свидетельствуют о том, что в защите от развития апоптоза в резистентных опухолевых клетках участвует механизм редокс-зависимого адаптивного антиоксидантного ответа, при этом важный вклад в данный механизм вносят изоформы глутатионтрансферазы и глутаредоксина и скоординированная работа ферментов синтеза GSH de novo, обеспечивающая поддержание на высоком уровне соотношение GSH/GSSG.