Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности Семенихина, Анастасия Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование биохимических сенов, ответственных за функциональную целостность, направленность взаимосвязанных физиологических процессов в растении представляют собой проблему, имеющую важное практическое и теоретическое значение. Разработка способов выделения ферментов, результаты изучения их структуры и регуляторных особенностей находят применение в медицине и некоторых отраслях промышленности, так как ферментные препараты широко используются в промышленном синтезе ряда биологически-активных соединений, в диагностических и лечебных целях. Знание механизмов регуляции отдельных ферментных систем являются необходимой предпосылкой для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятішм условиям, контролем урожайности и продуктивности. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень.

Для организации клеточного обмена в растительной клетке характерно, что на уровне метаболического узла, связанного с превращениями глюкозо-6-фосфата, имеет место пересечение ряда метаболических путей. Глюкозо-б-фосфат является интермедиатом гликолиза, глюконеогенеза и пентозофосфатного пути (ПФП). Физиологическая роль дегидрогеназ пентозофосфатного пути заключается в восстановлении НАДФ до НАДФН, восстановительные эквиваленты которого расходуются в биосингетических процессах. Другая функция этого пути заключается в образовании пентоз (в частности D-рибозы), которые используются для синтеза нуклеиновых кислот.

Осуществление регуляции функционирования данного пути возможно с помощью ключевого лісшітирующего фермента - глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазы (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49). Г6ФДГ была выделена и охарактеризована из ряда объемов, в основном из микроорганизмов и тканей животных.

Исследования Г6ФДГ растений крайне малочисленны, что связано с
методическими трудностями, возникающими при выделении и изучении
растительных белков по сравнению с белками из других организмов. Среда
особешюстей тканей растений, обусловливающих значительные

экспериментальные затруднения, следует прежде всего отметить освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации растительного материала вакуолярного сока с низким значением рН, таннинов, поляфенодоксидаз, протеаз, снижающих биолотическую активность ферментов.

Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: цитозоле и хлоропластах, представляет интерес изучение особенностей регуляции активности различно локализованных форм фермента и их роли в сопряжении процессов, протекающих в разных компартментах клетки. Необходимо развитие исследований по изучению координации путей синтеза и распада Сахаров в растительной клетке, утилизации НАДФН в различных бносинтетических реакциях (синтез жирных кислот, аминокислот, восстановление глутатиона), а также изучение субстратной специфичности фермента. Выяснение дадаых аспектов необходимо для более глубокого понимания физиолого-биохимической роли ГбФДГ в клеточном метаболизме высших растений.

Цели и задачи неследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности различных форм Г6ФДГ высших растений. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение и субклеточную локализацию Г6ФДГ в высших
растениях. Исследовать изменение активности фермента при прорастании
некоторых растений.

1. Разработать эффективные методы получения высокоочищенных препаратов различно локализованных форм Г6ФДГ из растений.

2. Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства цитоплазматической и хлоропластной Г6ФДГ из разных растений.

4. Провести исследование влияния экзогенных факторов (засоления) на активность Г6ФДГ.

5. С учетом особенностей регуляции активности различно локализованных форм Г6ФДГ разработать гипотетическую схему регуляции и сопряжения метаболических процессов в компартментах растительной клетки на уровне данного фермента.

Научная новизна. Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочищешше (в том числе гомогенные) ферментные препараты цитоплазматической и хлоропластной форм Г6ФДГ листьев гороха, ячменя и Spirodela polirizha. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализоватіьгх форм ГбФДГ, Показано, что для хлоропластной и цитозолыюй форм Г6ФДГ наряду со сходными чертами. характерны существенные отличия (чувствительность к субстраткор.гу иягибированию, концентрациям АТФ, влиянию рибозо-5-фосфата, галактозо-1-фосфата, галактозо-6-фосфата, различные электрофоретические подвижности). Показано существование диссоциативного механизма регуляции активности ГбФДГ в растительной клетке. Предложена гипотетическая схема регуляции метаболизма углеводов в растительной клетке на этапе Г6ФДГ реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма в различных компартментах растительной клетки.

Практическая значимость. Разработанные методы получения высокоочищенных, электрофоретически гомогенных препаратов Г6ФДГ из ряда растений дают возможность широко использовать их в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием сопряженных ферментных систем in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких представлений о механизмах ферментативной регуляции углеводного обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-лочвеяном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Экологическая биохимия", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 1998); 11-ом Конгрессе Федеращш Европейских биохимических сообществ (Варна, Болгария, 1998); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999); П Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), 10-ом европейском симпозиуме "Euro Carb X"

(Гауэй, Ирландия, 1999); ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1999).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях - 5 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Исследования, проведенные на высокоочшценных ферментных
препаратах Г6ФДГ из растений показали, что цитоплазматическая и
хлорогшастная формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и
контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет
регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций
субстратов, нуклеотидов (НДДФН, НАД, НАДН, АТФ, АДФ, АМФ, УТФ), ионов
некоторых металлов (Mg²⁺, Мп²⁺, Са²*"), интермедиатов углеводного обмена и ЦТК.

2. Хлоропластная и цитозольная формы Г6ФДГ имеют различные оптимумы рН, средство к субстратам, электрофоретическую подвижность, стабильность и хроматографические свойства. Ионы металлов, АТФ, рибозо-5-фосфат, галактозо-1-фосфат и галактозо-б-фосфат оказывают различное влияние на каталитическую активность хлоропластной и цитозольной форм Г6ФДГ.

3. Для регуляции активности как щггогшазматической, так и хлоропластной ГбФДГ характерен диссоциативный механизм регуляции. НАДФ способствует переходу димерной формы фермента в тетрамер, что сопровождается возрастанием ферментативной активности.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (4 глав), заключения, выводов, списка литературы (179 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 45 рисунков и 18 таблиц; в приложении - 4 рисунка и 5 таблиц.