Введение к работе
Актуальность проблемы. КАБКубихинон-оксидоредуктаза
митохондрий (КФ 1.6.99.3) (комплекс I, первый пункт сопряжения) -фермент, поставляющий восстановительные эквиваленты от NADH в дыхательную цепь. Обратимый перенос двух электронов, осуществляемый комплексом I между NADH и убихиноном сопряжен с трансмембранным переносом 3-5 протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. МАОН:убихинон-оксидоредуктаза чрезвычайно сложный и наименее изученный компонент внутренней мембраны митохондрий, состоящий из 42 различных полипептидов и связанных с ними фосфолипидов [Walker, 1992J. Структурная организация фермента, молекулярные механизмы функционирования и возможные способы его регулирования мало изучены.
Недавно в лаборатории А.Д. Виноградова был описан феномен медленных обратимых переходов между активной и неактивной формами комплекса I в составе субмитохондриальных частиц (СМЧ) [Kotlyar, Vinogradov. 1990]. Для перехода фермента из неактивного состояния в активное необходимо его восстановление NADH и последующее окисление хиноном. Этот переход замедляется в присутствии ионов двухвалентных металлов [Kotlyar et al, 1992] и (или) при защелачивании. Обратный переход в неактивное состояние представляет собой спонтанный процесс, скорость которого сильно зависит от температуры. Ряд данных указывает на то, что активная и неактивная формы комплекса I отличаются не только по каталитическим свойствам, но и структурно. Однако, до настоящего времени нельзя утверждать, что гистерезисное поведение фермента в составе СМЧ обусловлено свойствами собственно комплекса I, поскольку необходимо иметь в виду, что существенную роль в этом может играть мембрана, в которую погружен фермент. Следует также учитывать возможность специфических взаимодействий между компонентами дыхательной цепи и другими интегральными белками мембраны, следствием которых и может быть сложное кинетическое поведение комплекса I.
Настоящая работа является продолжением серии исследований, посвященных изучению НАОН:убихинон-оксидоредуктазы, проводимых на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ. Ее актуальность определяется необходимостью разработки физико-химических ссноз биологического катализа, з частности, прминительно к биоэнергатическим системам аэробной клетки.
Цель работы состояла: 1) в изучении гистерезисного поведения изолированного комплекса I и сравнении параметров обратимого перехода неактивный-активный фермент для очищенного комплекса I и фермента в составе мембраны; 2) в изучении роли акцептора электронов в реакциях, приводящих к активации фермента для изолированного препарата.
Научная новизна работы. Представленые экспериментальные данные показывают, что изолированный комплекс I способен к медленным обратимым переходам из неактивного состояния в активное с параметрами, мало отличающимися от таковых ранее описанных для фермента в составе полной дыхательной цепи. Получены результаты указывающие на то, что сродство неактивного комплекса I к убихинону в ходе реакции активации чрезвычайно высоко, а соотношение активной и неактивной форм фермента контролируется редокс состоянием хинона. Предложена гипотеза, согласно которой при функционировании фермента в стационарном активном состоянии часть свободной энергии реакции окисления NADH убихиноном расходуется на поддержание термодинамически нестабильной конформации протон-транслоцирующей КАОН:убихинон-редуктазы.
Практическая значимость работы. Результаты, полученные в работе являются вкладом в фундаментальные представления о функционировании мембрано-связанных ферментов. Материалы диссертации используются в лекциях для студентов по биохимии. На основании работы предложено несколько демонстрационных задач для большого практикума по биоэнергетике на кафедре биохимии. В ходе выполнения работы разработаны простые методы получения активной и неактивной форм комплекса I в различных препаратах, что необходимо для достоверного измерения ферментативной активности и последующей интерпретации полученных результатов.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на : 2 Международной Конференции по биохимии и молекулярной биологии » ШВМВ - (1993, Бари, Италия), на российско-германтскоы симпозиуме молодых ученых (1994, Оснабрюк, Германия).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения
полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на стр. машинописного текста, включая 6 табл. и рис.
СМЧ [Kotlyar, Vinogradov. 1990] и комплекс I [Hated, Rieske. 19671 получали из митохондрий сердца быка и хранили в жидком азоте. Хинолоксидаза bd-типа, выделенная из клеток суперпродуцирующего штамма GOlO2/pFHl01 Escherichia coli по методу, разработанному в лаборатории Тенниса [Miller, Gennis. 19S3], была любезно предоставлена И.А. Красносельской (Отдел биоэнергетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ).
Перед началом опытов препараты СМЧ и комплекез I размораживали; СМЧ разводили до концентрации 5 мг белка/ на мл средой, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 8,5), 0,25 мМ сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, и бычьнй сывороточный альбумин (БСА) (1 мг/мл); комплекс I разводили до концентрации 1 мг белка на мл средой, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 8,5), 0,6 М сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мг азолектина на мл (смесь фосфолипидов). Оба препарата переводили в неактивное состояние инкубируя их 30 мин при 35С.
NADH-оксидазную активность СМЧ регистрировали при 25С (спектрофотометр Hitachi-557) в 2 мл стандартной среды, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 8,5), 0,25 сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, БСА (2 мг/мл) и 100 мкМ NADH. КАОН:0і-редуктазную активность СМЧ и комплекса I регистрировали в условиях, указанных выше, в присутствии 100 мкМ Од и 2 мкМ антимицина А.
Долю активной формы комплекса І в различных препаратах фермента определяли по начальным скоростям МАВН:Од-редуктазных реакций, измеренных в присутствии 8 мМ MgCl2, стабилизирующего фермент в неактивном состоянии. Полностью активным считали фермент после его преинкубашга в течении 1 мин с 100 мкМ Qi и 3 мкМ NADH.