Введение к работе
Актуальность проблены. Исследование неханизков, с помощью которых в дифференцированных клетках высшего организма обеспечивается избирательное включение генов, является одной из основополагающих проблем молекулярной биологии. Молекулярно-генети-ческий подход к решению проблемы в сочетании с новейшими биохимическими методами позволили описать некоторые неханизмы регуляции экспрессии генов эукариот. В основе этих процессов лежит взаимодействие транскрипционных факторов со специфическими последовательностями ДНК. При их связывании изменяется структурное состояние хронатина регуляторних областей генов, приводящее к изменению функционального состояния гена.
Для выяснения структурно-функциональной организации хроматина регуляторних областей как транскрибируемых, так и находящихся в компетентней к транскрипции состоянии генов, широко применяется обработка различными нуклеазани. Гиперчувствительные к нуклеазам участки (ГЧУ) являются фундаментальными элементами в организации хроматина, однако особый интерес представляют ГЧУ, локализованные в регуляторных областях генов. Характерной особенностью индуцибельных (в частности, гормон-зависимых) генов является существование в их регуляторных областях специфических ГЧУ вне зависимости от действия индуктора. Присутствие таких конститутивных ГЧУ в 51-фланкирующих областях гормон-зависимых генов [Gross, Garrard, 1988) является показателем подготовленности их к транскрипции (компетенции к транскрипции).
Молекулярные механизмы возникновения и поддержания "открытой структуры" в конститутивных гиперчувствительных областях гормон-зависимых генов остаются не изученными. Известно, что в участках гиперчувствительности нуклеосоны либо смещены, либо удалены. Существенную роль в этих процессах играет точное расположение нуклеосом на ДНК. В литературе обсуждается вклад различных факторов (транс-действующих белков, последовательности ДНК и ее вторичной структуры) в формирование "открытой структуры" транскрипционно активного хронатина. В настоящее время для решения этих проблем делаются попытки использовать различные системы in vitro [Chasman е.а., 1990; Tsulciyama е.а, 1994),
- 2 -позволяющие изучать роль каждого фактора в отдельности. Разработка этого направления представляется нам современной и актуальной.
Настоящая работа посвящена изучению in vitro гиперчувствительности к ДНКазе 1 5'-фланкирующей области горнон-зависииого гена триптофанохеигенаэы [К.Ф.1.13.1.11] крысы (ТО). В 5'-флан-кирующей области этого гена идентифицированы конститутивные ГЧУ к ДНКаэе 1 in vivo [Becker е. а., 1984]. Ген ТО экспрессируется преимущественно в печени, его активность регулируется стероидными гормонами. Исходя из этих соображений, иы выбрали ген ТО в качестве надели для наших исследований.
Цели и задачи исследования^. Основная цель нашей работы заключалась в тон, чтобы изучить гиперчувствительные области к ДНКаэе 1 в регуляторной области горнон-зависимого гена трипто-фаноксигенаэы в составе рекомбинантной ДНК in vitro и проследить судьбу этих участков при реконструкции на ней нуклеосом. в связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
изучить гиперчувствительность к ДНКаэе 1 свободной рекомбинантной ДНК, содержащей 5'-фланкирующую область гена ТО, в суперспирализованной, релаксированной и линейной формах;
-
осуществить реконструкцию нуклеосомных коровых частиц на рекомбинантной ДНК, содержащей ГЧУ к ДНКаэе 1 в регуляторной области гена ТО;
-
выяснить, сохраняется ли гиперчувствигельное состояние при образовании нуклеосомных коровых частиц на рекомбинантной ДНК, содержащей регуляторную область гена ТО.
Научная новизна и теоретическая ценность работы^ В нашей работе впервые обнаружены ГЧУ к ДНКаэе 1 в суперспиралиэованной рекомбинантной ДНК, содержащей фрагмент регуляторной области гена ТО и показано, что их локализация коррелирует с локализацией ГЧУ в хроматине печени крыс in vivo. Выявлена зависимость гиперчувствительного состояния 5'-фланкирующей области гена то в рекомбинантной плаэмиде от наличия упругого напряжения в ДНК. Показано, что при реконструкции хроматина в присутствии гомологичных коровых гистонов фрагменты гена ТО из структурной и регуляторной областей вовлекаются в нуклеосомную организацию, вследствие чего снимается гиперчувствительное состояние в ДНК
- з -регуляторних областях гена ТО. Полученные нами результаты представляет интерес в связи с тем, что, используя рекомбинант-нуп ДНК, содержащее 5'-фланкирующую область гена ТО, можно моделировать ч системе in vitro события, происходящие в ядре на уровне хроматина. В частности, можно изучать действие транс-действующих белковых факторов на структурную организацию хроматина регуляторной области гормон-зависимого гена ТО в процессе реконструкции на ней хроматина.
Работа носит фундаментальный характер. Полученные результаты по локализации ГЧУ на суперспирализованной рекомбинантной ДНК развивают представления о роли в индукции гиперчувствительного состояния ДНК нуклеотидной последовательности ДНК, ее вторичной структуры и подтверждают имеющиеся данные о том, что для возникновения гиперчувствительных областей в хроматине необходимы дополнительные факторы. Полученные нами данные расширяют имеющиеся представления о структурных изменениях хроматина регуляторних областей гормон-зависимых генов в компетентном к транскрипции состоянии.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах лаборатории химии белка и кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета, на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механиэны генетических процессов" (Москва, 1990), на 13-м европейском совещании "Клеточное ядро" (Венгрия, 1993), на XI Всероссийском симпозиуме "структура и функция клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков, список литературы включает 133 работы.