Введение к работе
Актуальность работы. В последние десятилетия работами ведущих микробиологических лабораторий мира продемонстрировано значительное распространение стрептококков группы В (СГВ) среди людей. По данным ряда авторов, четвертая часть населения планеты независимо от возрастных категорий инфицирована этим микробом (Baker С, Barrett Е, 1983, Easmon С, 1983, Jelinkova J., 1977). Наиболее остро стоит вопрос о роли стрептококков группы В в патологии беременности и новорожденных, в том числе и в этиологии инвазивных инфекций. Особую опасность в этом случае представляют матери-носители инфекта. Заражение ребенка происходит либо внутриутробно, либо при прохождении через родовые пути. У детей заболевание чаще всего протекает в форме менингита и сепсиса и в 20-50% случаев заканчивается летально (Ferrieri Р., 1985, Klein J., 1984).
По существу, борьба с СГВ - инфекцией есть борьба за здоровое материнство и детство. Следовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококка группы В актуально не только с научно-медицинской, но и с экономической, и с социальной точек зрения.
Хорошо известно, что вирулентность стрептококков группы В коррелирует с их способностью продуцировать полмсахаридную капсулу (Durham D., Straus D., 1981). Однако, наряду с полисахаридами, СГВ синтезируют большую группу патогенно активных веществ белкового происхождения, таких как а и В антигены, С5а пептидаза, нуклеазы, протеазы, CAMP фактор и др., роль которых в формировании вирулентности изучена крайне недостаточно.
Несмотря на значительные достижения в области генетики патогенных стрептококков, о генетике стрептококков группы В известно очень мало. К настоящему времени почти нет данных о распространённости генов, кодирующих факторы патогенности, среди штаммов стрептококков группы В различных серологических типов. Также мало известно о размере, строении и составе генома стрептококков группы В. Физическое и генетическое картирование генома стрептококков этой группы до настоящего времени не осуществлено. Соответственно, на их хромосомной карте до сих пор не локализованы гены потенциальных факторов патогенности. Экспериментальные данные о корреляции между серологическим типом СГВ и особенностями строения его генома
отсутствуют. Именно этой малоизученной области генетики патогенных стрептококков группы В и посвящено настоящее исследование.
Целью настоящего исследования является картирование и анализ гетерогенности генома стрептококков группы В. Для этого предстояло выполнить следующие задачи:
-
проанализировать штаммы СГВ методом электрофореза ДНК в пульсирующем электрическом поле и локализовать ряд генов на рестрикционных ДНК фрагментах, оценить степень гетерогенности рестрикционных паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК гибридизации;
-
осуществить картирование генома СГВ; сравнить физические и генетические карты генома штаммов различных серологических типов;
-
оценить наличие и уровень корреляции особенностей строения генома штаммов СГВ и индивидуальных серологических характеристик;
-
определить количество копий рибосомальных оперонов в геноме СГВ;
-
установить распространённость генов, кодирующих а и (3 антигены СГВ -потенциальные факторы патогенности, среди штаммов различных серологических типов;
-
разработать экспресс-метод иммунологической детекции штаммов стрептококков группы В, связывающих иммуноглобулины А;
-
сравнить данные молекулярно-генетической детекции Ьас гена, кодирующего IgA связывающий белок, с результатами иммунологической детекции;
Научная новизна и теоретическая ценность работы.
1) В ходе настоящего исследования разработан экспресс-метод
иммуноблотинга, позволяющий быстро выявлять IgA связывающие штаммы СГВ.
2) Изучена распространённость генов Ьса и Ьас, кодирующих аир
антигены, соответственно. Показано, что наличие гена Ьас в геноме коррелирует с
размером EcoRI фрагмента ДНК, содержащего Ьса ген. Обнаружено, что наличие
Ьас гена и кодируемого им IgA рецепторного белка являются маркерами,
позволяющими разделить стрептококки группы В на две субпопуляции.
3) Методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле
проанализированы геномные ДНК штаммов СГВ. Обнаружена высокая степень
гетерогенности рестрикционных паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК
гибридизации. На ДНК рестрикционных фрагментах СГВ локализованы 10 генов. Показано наличие в геноме СГВ 6 копий рибосомальных оперонов.
-
Построены первые физическая и генетическая карты генома штамма 78 / 471, серотип II /(а + Р). Размер генома оказался равным 2200 т.н.п.
-
Построенные физическая и генетическая карты генома штамма 78 / 471, серотип II / (а + Р), сопоставлены с предполагаемыми физической и генетической картами генома штамма СГВ 1 / 6586, серотип HI / а. Установлено, что, несмотря на высокую степень гетерогенности рестрикционых паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК гибридизации, общая организация генома стрептококков группы В характеризуется консервативностью расположения генов.
Практическая ценность.
Исследование носит теоретический характер. Однако, экспресс-метод иммуноблотинга, позволяющий быстро оценить способность штаммов СГВ связывать иммуноглобулины А человека, может быть использован в клинической практике для дифференцировки штаммов по наличию у них IgA рецепторного белка - одного из потенциальных факторов патогенності!.
Положения, выносимые на защиту.
-
IgA связывающий белок всегда экспрессируется штаммами СГВ при наличии у них Ьас гена, что указывает на биологическую значимость IgA связывания для жизнедеятельности стрептококков группы В. Установлено, что IgA связывающая способность штаммов СГВ и наличие Ьас гена являются маркерами, позволяющими разделить популяцию стрептококков группы В на 2 субпопуляции.
-
Полученные методом пульс-электрофореза рестрикционые паттерны ДНК и паттерны ДНК-ДНК гибридизации СГВ штаммов 78 / 471, серотип II / (а+Р), и 1 / 6586, серотип III / а, обладают высокой степенью гетерогенности, однако, общая организация генома стрептококков группы В характеризуется консервативностью расположения генов.
3) Существующая серологическая классификация стрептококков группы В
не отражает особенности строения генома различных штаммов.
Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:
-
Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.
-
Применением наиболее современных способов компьютерного анализа (использование банка данных GENBANK, компьютерной программы SEQAID и т.д.).
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах и доложены на 8 симпозиумах и конференциях: 4-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Санта Фе, США, в 1994 г.; Конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции памяти акад. А.А.Баева, Москва, Россия, в 1996 г.; Международном Симпозиуме по оригинальным методам и стандартизации в микробиологии, Кошице, Словацкая Республика, в 1996 г.; XIII Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, в 1996 г.; VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, в 1997 г., 8-ой Европейской Студенческой Конференции, Берлин, Германия, в 1997 г. Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМРАМН (1994, 1995,1996, 1997 гг.).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками, указатель литературы содержит 172 источника, в том числе 4 отечественных и 168 иностранных.