Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование механизма ферментативного катализа и структуры активного центра ферментов является центральной задачей энзимологических исследований. Транскетолаза (ТК) - димерный фермент, два симметричных активных центра которого расположены на границе идентичных субъединиц и формируются только в присутствии кофермента (ТЇЇФ*) [Lindgvist et al., 1992, EMBO J., 1992, 11, 23731. Субстраты ТК - кето- и альдосахара различной длины (используемые в работе 5-6-углеродные субстраты мы будем называть большими,- ,а трехуглеродные - малыми). ТК обратимо*4 отщепляет от кетосахара (субстрата-донора ТК-реакцки) 2-х углеродный фрагмент, ("активный гликолевый альдегид") и присоединяет его к альдосахару среды (субстрат-акцептор), высвобождая в среду второй фрагмент субстрата-донора (аналогичный альдосахару среды). Методом химической модификации были определены следующие функциональные группы ТК: Trp, His, СООН, Arg. Позднее, с помощью РСА, почти все из-этих групп были идентифицированы как структурные составляющие активного центрадолофермента. . ,
Идентификация аминокислотных остатков, небходимых для катализа и для связывания ТЇЇФ, особенно продвинулась после получения и исследования мутантов по аминокислотам, консервативным согласно первичной и трехмерной структурам. Однако процессы связывания субстратов сопряжены с подвижностью структуры фермента и, к тому же, комплекс фермента с расщепляемым субстратом весьма нестабилен. По этим причинам каталитические и субстрат-связывающие остатки не всегда возможно идентифицировать методом РСА кристаллов фермента. -
Таким образом, традиционный метод исследования функциональных групп - специфическая химическая модификация реактивных ами-
*Сокрашения: ТПШ - тиаминпироФОсФат; ТК - транскетолаза; Ф6Ф - Фруктозо-6-ФосФат; К5Ф - ксилулозо-5-фосфзт; ДОА - диоксиаце-тон; ОП - оксипируват (гидроксипируват); NAM - N-ацетюіимидазол; ТИМ - тетранитрометан; НБД-хлорид - 7-хлор-4-нитробензо-2-ок-са-1,3-диазол; РСА - рентгеноструктурный анализ.
**3а исключением расщепления ОП. который необратимо декарбокси-лируется под действием ТК.
- 2 -нокислотных остатков, исследование влияния лигандов на этот процесс и свойств модифицированного белка - не потерял своей актуальности в плане идентификации каталитических и субстрат-связыва-ющих остатков активного центра, не вступающих в непосредственный контакт с кофактором.
Цель исследования - с помощью метода химической модификации выяснить, нужны ли для функционирования ТК остатки тирозина, и, если нужны, определить их местоположение в структуре фермента и возможную роль в катализе.
Научная новизна. Впервые показано критическое значение целостности остатков тирозина для функционирования ТК.
Реактивные остатки локализованы в структуре фермента.
В ходе модификации обнаружен неизвестный ранее эффект полуцентровой реактивности ТК при связывании субстратов, что указывает на механизм "флип-флоп" взаимодействия ее активных центров в ходе катализа.
Проведено обзорное исследование структурных основ функциональной подвижности молекулы фермента в ходе катализа на основе сопоставления подученных в работе данных с результатами РСА, направленного мутагенеза и последних кинетических исследовании ТК. Предложена подвижная модель функционирования фермента, удовлетворяющая этой совокупности результатов.
Практическая значимость. Локализация функциональных остатков тирозина в аминокислотной последовательности фермента дает возможность дальнейшего исследования их роли в механизме катализа методом направленного мутагенеза.
Разработаны оптимальные условия полного протеолиза фермента и разделения полученного гидролизата, что может быть использовано при дальнейших исследованиях структурных основ функциональности и регуляции фермента.
Предложен новый модификатор остатков тирозина - эквимоляр-ный комплекс НБД-хлорида с гидроксипируватом. Такой комплекс более реакционноспособен и специфичен в отношении функциональных остатков тирозина апоТК, чем НБД-хлорид.
Получены указания на функциональность аминогрупп ТК, что
может составить тему отдельного исследования.
Предложенная подвижная модель функционирования фермента в режиме "флип-флоп" позволяет объяснить имеющиеся данные о спектральных и кинетических свойствах ТК и указывает на необходимость учитывать причинную связь механических и химических процессов при дальнейших исследованиях механизма катализа.
Полученные результаты углубляют представление о структуре фермента и могут быть использованы при чтении спецкурсов по энзи-мологии и в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов.
Апробация. Результаты работы доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ 29-го января 1996г, а также на YI Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского.", 1995г., 4.
Публикации. Результаты исследования изложены в 5 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, освещающего структурные основы функциональности ТК, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа содержите.страниц^ машинописного текста, 1 таблицу и 30 рисунков. Список литературы включает 103 источника.