Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 14
1. Действие физических факторов на клетки и активность ферментов крови 14
1.1. Факторы неакустической природы 14
1.2. Примеры разнонаправленного действия ультразвука in vivo 20
2. Ультразвук и механизмы его действия 22
2.1. Применение ультразвука в диагностике и терапии 22
2.2. Биологическое действие непрерывного, импульсного и амплитудно-модулированного ультразвука 23
2.3. Биохимические эффекты ультразвука на примере изменения ферментативной активности 33
Экспериментальная часть 35
II. Методология и материалы исследования 35
3. Объекты работы 35
3.1. Культуры бактерий и архей 35
3.2. Выделение лейкоцитов и получение интерферона 36
3.3. Отделение эритроцитов 37
3.4. Использование биосенсоров 37
3.5. Домашние и лабораторные животные 38
4. Способы ультразвукового воздействия на объекты исследования 42
4.1. Методика обработки суспензий клеток 42
4.2. Методика обработки цельной крови и сыворотки 43
4.3. Методика воздействия на лабораторных животных in vivo 44
5. Методы анализов 45
5.1. Визуальные методы (микробиологические и гематологические) 45
5.2. Цитохимические методы 46
5.3. Биохимические методы 47
5.4. Физические методы 51
5.5. Методы математического анализа нелинейной динамики 54
III. Результаты собственных исследований 64
6. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на модельные объекты 64
6.1. Выбор модельных объектов 64
6.2. Рост и эмиссия люминесцирующих бактерий Aliivibrio fischeri в разных условиях 66
6.3. Действие модулированного ультразвука на рост культуры Halobacterium halobium 71
7. Действие ультразвука на безъядерные клетки крови животных in vitro 74
7.1. Особенности воздействия ультразвука на тромбоциты 74
7.2. Особенности воздействия ультразвука на эритроциты 77
8. Действие непрерывного и импульсного ультразвука на лейкоциты 82
8.1. Жизнеспособность лейкоцитов 82
8.2. Модели изменения жизнеспособности лейкоцитов 83
8.3. Влияние непрерывного ультразвука на изменение лейкограммы 84
8.4. Действие ультразвука минимальной терапевтической интенсивности на лейкоциты здоровых и больных животных 88
8.5. Направления действия непрерывного ультразвука низких интенсивностей на лейкоциты в зависимости от возраста животных 91
8.6. Морфологические изменения клеток крови в непрерывном ультразвуковом поле 95
8.7. Действие импульсного ультразвука на клетки крови лошадей 98
9. Изучение действия амплитудно-модулированного ультразвука низких интенсивностей на клетки крови домашних животных 101
9.1. Действие модулированного ультразвука на клетки крови здоровых мелких домашних животных 101
9.2. Результаты изучения действия амплитудно-модулированного ультразвука на клетки крови лошадей 109
9.3. Действие модулированного ультразвука на клетки крови инвазированных животных 118
9.4. Сравнительный анализ выявляемых изменений клеток крови в поле бегущей непрерывной, импульсной и амплитудно-модулированной ультразвуковой волны 127
10. Анализ изменений клеток крови под воздействием физических факторов 132
10.1. Возможность использования в лабораторных исследованиях программного пакета HarFA 132
10.2. Определение с помощью пакета HarFA сочетанного действия нескольких физических факторов на кровь животных 135
10.3. Самостоятельное действие температуры на клетки крови животных 139
10.4. Статическое электрическое поле 140
11. Изучение изменения ферментативной активности 150
11.1. Направления изменения активности ферментов гомеостаза в результате непрерывного ультразвукового воздействия 150
11.2. Изучение активности ферментов крови после действия амплитудно-модулированного ультразвука 151
12. Биосинтез интерферона. Использование ультразвука в процессе биосинтеза лейкинферона 157
12.1. Идентификация биохимическими методами полученного с использованием модулированного ультразвука интерферона 158
13. Изучение действия ультразвука на ткани лабораторных животных in vivo 160
13.1. Результаты воздействия модулированного ультразвука на сперматозоиды мышей in vivo 160
13.2. Действие ультразвука на лейкоциты кролика in vivo 160
13.3. Действие ультразвука на живого возбудителя Dirofilaria repens 161
IV. Обсуждение результатов 162
14. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на культуры микроорганизмов 162
14.1. Действие пероксида водорода, температуры, pH и белков на интенсивность люминесценции Aliivibrio fischeri 163
14.2. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на бактерии Aliivibrio fischeri 164
14.3. Действие модулированного ультразвука на культуру археи Halobacterium halobium 166
14.4. Люминесцирующие бактерии как тест-система для оценки лекарственных препаратов 168
14.5. Основные математические модели пролиферативной активности культуры клеток почки телёнка MDBK, интенсивности свечения Aliivibrio fischeri, динамики роста культуры Halobacterium halobium и изменения жизнеспособности лейкоцитов после ультразвукового воздействия 168
15. Изменение физиологического состояния клеток крови в ультразвуковом поле 175
15.1. Особенности воздействия непрерывного ультразвука терапевтической интенсивности на лейкоциты мелких домашних животных 175
15.2. Возрастные особенности направления действия непрерывного ультразвука низких интенсивностей на лейкоциты мелких домашних животных 184
15.3. Анализ изменения состояния грануло– и агранулоцитов in vitro под действиемнепрерывного и модулированного ультразвука низких интенсивностей 189
15.4. Изменение жизнеспособности лейкоцитов 199
6. Разнонаправленное действие на клетки крови различных видов животных непрерывного и модулированного ультразвука in vitro 203
16.1. Направленное действие непрерывного ультразвука на клетки крови представителей семейства кошачьих 204
16.2. Влияние амплитудно-модулированного ультразвука на физиологическое состояние клеток крови животных семейства кошачьих 205
16.3. Действие ультразвука на клетки-мишени крови собак 211
16.4. Действие ультразвука на клетки-мишени крови лошадей 220
16.5. Возможность однонаправленного изменения физиологического состояния лейкоцитов разных видов животных с помощью модулированного ультразвука 225
16.6. Сводный анализ основных выявленных особенностей воздействия ультразвука на клетки крови домашних животных 229
16.7. Интегральный диагностический индекс степени влияния физического фактора на состояние клеток крови как результат фрактального анализа программным пакетом HarFA 248
17. Изменение активности ферментов 250
17.1. Изменение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинкиназы, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы после обработки крови животных непрерывным ультразвуком 250
17.2. Изменение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы
и креатинкиназы после обработки модулированным ультразвуком крови кошачьих 252
17.3. Действие модулированного ультразвука на активность ферментов крови
представителей семейства собачьих 253
17.4. Действие модулированного ультразвука на активность ферментов крови лошадей 257
18. Получение интерферона после применения амплитудно-модулированного ультразвука 261
18.1. Влияние модулированного ультразвука на синтез интерферона 261
18.2. Оценка интерферона. Реакция люминесцирующих бактерий на интерферон различной концентрации (активности) 262
19. Действие ультразвука на ткани лабораторных животных in vivo 264
19.1. Количественный анализ действия модулированного ультразвука на сперматозоиды мышей in vivo 264
19.2. Действие ультразвука на клетки крови кролика in vivo 266
Заключение 268
Список сокращений и условных обозначений 275
Словарь терминов 276
Список литературы
- Биологическое действие непрерывного, импульсного и амплитудно-модулированного ультразвука
- Выделение лейкоцитов и получение интерферона
- Методика обработки цельной крови и сыворотки
- Биохимические методы
Введение к работе
Актуальность исследования состоит в том, что в физиотерапии не определены спектры действия активных частот для разных тканей домашних животных при использовании модулированного УЗ. Необходимо знать эффективность и определить биохимические и физиологические механизмы изменения организма в целом, тканей и отдельных клеток при применении УЗ воздействия.
Для различных физических факторов воздействия (электромагнитных и акустических) было отмечено, что модулированные волны могут оказывать более сильное воздействие, чем непрерывные [Утешев В. К., 2010]. Модуляционное, по сравнению с непрерывным, воздействие на биологические системы разного уровня организации вызывает ответы при уровнях энергии намного меньших. Когда непрерывное воздействие является (под)пороговым, амплитудно-модулированный УЗ может инициировать более сильные стимулирующие или тормозящие эффекты. Это позволит достичь существенного снижения уровня отрицательного воздействия и уменьшить тепловое и кавитационное действие УЗ на органы и ткани при исследовании и терапии животного, тем самым увеличивая эффективность метода.
При УЗ терапии и диагностике всегда основным объектом воздействия являются клетки крови. Экспериментальные данные динамики изменения физиологического состояния клеток крови в поле непрерывной бегущей и амплитудно-модулированной УЗ волны позволят определять интенсивность, временные интервалы
и диапазоны частот ингибирования или активирования внутриклеточных процессов. Установленные физиологические и биохимические изменения клеток помогают выявлять безопасные для организма диапазоны.
Исследования по определению физиологических и биохимических аспектов непрерывного, импульсно– и амплитудно-модулированного акустического воздействия позволят разработать комплексную стратегию клинического использования терапевтического УЗ различной частоты в диагностике и терапии.
Нами проведено изучение и анализ экспериментальных и теоретических исследований, проработано 227 отечественных и 183 зарубежных источника. Исследователями установлена возможность разнонаправленного действия УЗ [Botyan N, 1989]. Установлено, что в УЗ поле могут возникать градиенты скорости, а объекты облучения подвергаться действию сдвиговых напряжений. Методом гемолиза эритроцитов в суспензии in vitro [Хилл К, 2008] было доказано, что высокие сдвиговые напряжения в акустических течениях повреждают биологические ткани. Отмечено повреждение эндотелия в кровеносных сосудах эмбрионов цыплят и матки мышей в месте контакта жидкости с оболочкой сосуда.
В зависимости от интенсивности и времени воздействия наблюдали активацию и подавление функционального состояния клеток, вплоть до их повреждения [Журавлёв А. И., 2015; Акопян В. Б., 2016], что сопровождалось изменением электрокинетических потенциалов клеток, систем активного и пассивного транспорта ионов через клеточные мембраны и их структурными перестройками, а также изменением биохимического состава крови [Orlowska E, 1980; Miller DL, 1995; Ако-пян В. Б., 2016]. Биологические эффекты УЗ многофакторны, а клеточный отклик на воздействие зависит от концентрации клеток [Brayman AA, 1996]. Проявление механизма биологического действия зависит от интенсивности УЗ и времени воздействия [Кузнецов В. П., 1987; Пашовкин Т. Н., 2010; Утешев В. К., 2010]. При воздействии акустических волн на живую клетку происходит изменение её функционального состояния, что проявляется изменением поверхностного заряда вследствие последовательного сжатия и разрежения цитоплазматических мембран (ЦПМ). Это как уменьшает, так и увеличивает количество активных каналов за счёт латеральной диффузии молекул липидного бислоя и может значительно изменить физиологическое состояние клетки [Пашовкин Т. Н., 1990; Акопян В. Б., 2016]. Указанные механизмы определяют интерес по выяснению процессов, про-
ходящих на уровне клеток, после УЗ воздействия in vitro и in vivo. Однако в литературных источниках данные о взаимодействии непрерывного и модулированного УЗ с подвижной тканью организма животного — кровью — или отсутствуют вовсе или представлены недостаточно. Также не указаны спектры опасных и безопасных частот модуляции при работе с УЗ терапевтических интенсивностей.
Таким образом, недостаточная научная разработанность означенной проблемы и то существенное значение, которое она приобретает для ветеринарной медицины, определяют актуальность темы, цель и задачи диссертационного исследования.
Цель исследования — изучить физиологические и биохимические эффекты воздействия УЗ на клетки и организм животных для характеристики разнонаправленных изменений указанных систем.
Для реализации указанной цели были поставлены задачи:
-
изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки бактерий;
-
изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки археи;
-
исследовать влияние in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови здоровых животных в зависимости от вида клеток и вида животных;
-
провести исследования по изучению особенностей влияния in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови больных и инвазированных животных;
-
изучить действие модулированного УЗ на продукцию интерферона (ИФН) лейкоцитами;
-
изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на активность ферментов крови разных видов животных;
-
провести испытания влияния in vivo модулированного УЗ на целый организм.
-
Впервые в качестве воздействующего фактора на клетки крови различных животных применён амплитудно-модулированный УЗ и изучено его влияние. Впервые из акустического спектра действия экспериментально найдены частоты модуляции УЗ волн для активного облучения (инсонации) конкретных биологических систем, позволяющие при равноэнергетическом воздействии получать биологические эффекты разного знака и амплитуд для разных частот модуляции.
-
Установлено, что воздействие модулированных УЗ волн терапевтического диапазона интенсивностей с частотой модуляции от 0.10 до 1000 Гц и временем
экспозиции от 10 с до 5 мин может оказывать стимулирующее, тормозящее или разрушающее воздействие на клетки. Определены диапазоны, оказывающие эти эффекты. Впервые выявлена особая чувствительность эритроцитов и нейтрофилов, содержащих внутриклеточных паразитов (бабезии), к воздействию модулированного УЗ.
3. Впервые показано однонаправленное стимулирующее действие непрерыв
ного и амплитудно-модулированного УЗ на клетки люминесцирующих бактерий,
архей, лейкоциты, сперматогенные клетки и выявлены оптимальные режимы воз
действия: интенсивность (средняя по пространству и времени интенсивность Isata),
время экспозиции (t3Kcn) и диапазоны активных частот модуляции (vM).
-
Стойкий стимулирующий эффект на эмиссионную активность фотобактерий вызывает трёхминутное облучение непрерывным УЗ интенсивности 0.2-0.4 Вт/см2, амплитудно-модулированным — из диапазона частот 85-100 Гц при 0.2 Вт/см2, а также 10-12 Гц при 0.4 Вт/см2.
-
Стимулирующее воздействие на клетки архей оказывает УЗ интенсивностью 0.4 Вт/см2 частотой 0.25-0.7 Гц.
-
Стимулирующее действие на лейкомассу оказывает УЗ интенсивностью 0.05 Вт/см2, частотой модуляции 800 Гц в течение 30 с — 1 мин, на сперматогенные клетки — 1.0 Вт/см2, частотой модуляции 250 Гц в течение 5 мин.
-
Впервые на клетках крови, культурах микробных клеток: бактерий AlUvibrio fischen 6, архей Halobactenum halobium 1001 (Я. salinarum; Natrinema pallidum) — показано тормозящее, супрессорное и разрушающее действие амплитудно-модулированного УЗ как самостоятельного фактора.
-
Впервые показаны физиологические изменения in vitro грануло- и аграну-лоцитов в поле бегущей непрерывной и амплитудно-модулированной УЗ волны, а также особенности её влияния на ЦПМ, цитоплазму (ЦП) и ядра клеток крови различных видов животных. Выявлена видовая чувствительность к амплитудно-модулированному УЗ. Выполнены расчётно-экспериментальные исследования динамики изменения лейкограмм разных видов животных после воздействия непрерывного и модулированного УЗ.
-
Впервые выявлены особенности действия модулированного УЗ на форменные элементы крови животных с моно- и смешанными инвазиями.
-
Впервые выявлены особенности поведения клеток крови в электростатическом поле (статическое электрическое поле — СЭП) и установлена аналогия с процессами, происходящими в акустическом поле.
-
Благодаря увеличению проницаемости мембран клеток модулированный УЗ интенсифицировал процессы метаболизма, выход эндогенных (ИФН) веществ через клеточную стенку. Биохимическими методами подтверждена полноценность, отсутствие токсичности полученного ИФН.
-
Впервые показана возможность одномоментного воздействия амплитудно-модулированного УЗ из экспериментально выявленного диапазона активных частот на ряд ферментов крови (аланинаминотрансферазу КФ 2.6.1.2 [АлАТ], аспар-татаминотрансферазу КФ 2.6.1.1 [АсАТ], креатинкиназу КФ 2.7.3.2 [КК], лактатдегидрогеназу КФ 1.1.1.27 [ЛДГ] и щелочную фосфатазу КФ 3.1.3.1 [ЩФ]) животного определённого вида, направленно уменьшающее активность одних, увеличивающее активность других, не меняя при этом активность остальных.
-
Впервые показана возможность термального воздействия на клетки крови in vitro амплитудно-модулированного УЗ терапевтического диапазона интенсивно-стей с частотой генерации (несущей) 0.88 МГц, начиная с минимальной интенсивности 0.05 Вт/см2, и найден минимальный порог биологического действия.
-
В установленных физиологических и биохимических изменениях клеток в зависимости от интенсивности непрерывного УЗ и от частоты при действии модулированного УЗ выявлены математические закономерности, описанные формулами.
1. Проведённые экспериментальные биохимические, физиологические и биофизические исследования расширили представления о механизме УЗ воздействия. Для новых биологических объектов определены активные частоты, вызывающие направленные биологические эффекты модулированного УЗ. Установлено, что ведущей (основной) причиной цитоморфологических изменений под действием непрерывного УЗ является дозовая зависимость, а в случае модуляционного воздействия — диапазон физиологически активных частот vM и интенсивность УЗ Isata.
Установлены механизмы происходящих in vitro физиологических и биохимических изменений: межклеточные взаимодействия, ускоренная агрегация/разрушение клеток крови больных/старых животных, изначальное разрушение ядерных клеток (клеток, содержащих гранулы, включения, паразитов), ядерный сдвиг лей-кограммы, разрыв ЦПМ, кариолизис, кариопикноз и кариорексис, изменение ферментативной базы, каскадность физиологических эффектов. В целом установлены разнонаправленные эффекты на уровне ткани in vitro —разрушающие и активиру-
ющие — идущие параллельно с изменениями клеток. Экспериментальные и расчётные данные по динамике клеточного и ферментативного отклика могут быть использованы для обоснования возможности направленного и избирательного акустического воздействия на белки и клетки-мишени. Также исследования являются основой для разработки УЗ аппаратов нового поколения с программируемыми режимами физиотерапии и заданием эффективных частот при избирательном лечении ряда патологий.
2. Практическая значимость исследований. Выявленные диапазоны УЗ воздействия — от стимулирующего до разрушающего —можно применять при разработке новых, более эффективных и направленных воздействий УЗ и создании новых методов в физиотерапии. Экспериментальные данные по характеристике и особенностям влияния на клетку амплитудно-модулированного УЗ терапевтических интенсивностей в широком диапазоне частот могут быть использованы при составлении рекомендаций по подбору частотных характеристик диагностических и терапевтических приборов, а также позволят обосновать и сформулировать основные подходы к защите человека, работающего с модулированными полями.
Созданы и верифицированы методы УЗ обработки клеток с целью активации/супрессии их физиологических процессов. Выявлены спектры активных частот и диапазоны интенсивностей, стимулирующие получение практически важных метаболитов (ИФН, бактериородопсин). Разработаны: способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после УЗ воздействия; способы окраски тромбоцитов после воздействия непрерывным и модулированным УЗ.
Научные положения, выводы и рекомендации диссертации включены в учебные пособия и используются при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и при выполнении научно-исследовательских работ на кафедрах ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина: Радиобиологии и вирусологии имени академиков А. Д. Белова и В. Н. Сюрина; Физиологии, фармакологии и токсикологии имени А.Н. Голикова и И. Е. Мозгова; а также Информационных технологий, математики и физики.
При проведении работы использовали современные методы, традиционные для области ветеринарной биохимии и физиологии: физиологические, биохимические, биофизические, микробиологические и цитохимические, а также методы статистического и фрактального анализа, биометрической обработки данных.
Объекты исследования: люминесцирующие бактерии A. fischeri, клетки культуры археи H. halobium, лабораторные животные (кролики, мыши), домашние животные (лошади и мелкие домашние животные [МДЖ]: собаки, кошки; другие кошачьи и собачьи), подобранные в группы по принципу условных аналогов. Материалом исследования служила кровь животных, лейкоцитарная масса клеток, семенники лабораторных мышей.
– Эффекты, возникающие при использовании непрерывного и модулированного УЗ на клетки различной природы — стимулирующие, супрессорные и разрушающие.
– Видовые и индивидуальные особенности действия непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови и активность ферментов плазмы и сыворотки крови. – Эффекты УЗ воздействия на организм.
Достоверность и обоснованность полученных результатов и выводов подтверждена:
– проведением методически правильно организованных исследований с использованием достаточного количества экспериментальных животных и клеточных культур; результатами корреляционного и фрактального анализов, методами математической статистики;
– сопоставлением расчётных и экспериментальных данных, полученных автором, с аналитическими решениями и данными физиологических, биохимических и биофизических исследований других авторов;
– получением 3 патентов на изобретения и публикацией результатов работ в ведущих научных журналах и в трудах отечественных и международных конференций.
Основные результаты работы обсуждены на 16 Международных, республиканских, всероссийских, межвузовских конференциях, съездах, симпозиумах и сессиях: «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» — Иркутск, 2002; «Проблемы современной микробиологии и биотехнологии» — Ташкент, 2009; VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» — Минск, 2010 г.; «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» — Москва, 2014; XI International Scientific and Practical Conference, “Modern European Science”. Biological Science: Science and Education,
Англия, Шеффилд, 2014; «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии» Москва: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2014; «Наука и образование в XXI веке» — Тамбов, 2014; «Научная дискуссия: вопросы математики, физики, химии, биологии» — Москва, 2014; «Теоретические и прикладные вопросы науки и образования» — Тамбов, 2015; Международных школах-семинарах «Физика в системе высшего и среднего образования России» — Москва, 2014 и 2015 гг.; V Съезде биофизиков России — Ростов-на-Дону, 2015; “Microorganisms and the Biosphere” — Uzbekistan, Tashkent, 2015; VII Международной научно-практической конференции Дулатовские чтения — Костанай, 2016; ХI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ — 2016» — Севастополь, 2016; IV Международной конференции “Radiation and Applications in Various Fields of Research. RAD Conference — 2016” — Сербия, 2016 г.
Диссертационная работа содержит расчётные, экспериментальные и прикладные результаты исследований, выполненные автором в МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина 2002–2016 годах. В представленных материалах автору принадлежит выбор направлений исследований, определение цели, постановка задач, выполнение расчётов, разработка способа УЗ обработки суспензии клеток и научно-техническое руководство проведением всех биохимических и физиологических экспериментов по верификации авторских методов; моделирование и интерпретация полученных результатов, обоснование и формулирование выводов. Результаты теоретических и экспериментальных исследований получены автором лично или при его определяющем участии, что нашло отражение в совместных публикациях с академиком РАН Ф. И. Василевичем, д.б.н. Т. Н. Пашовкиным, д.б.н. А. М. Носовским и другими.
По теме диссертации опубликована 51 работа в российских и зарубежных журналах, трудах международных и всероссийских конференций, в тезисах докладов. Из них 19 — в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ или входящих в международные базы цитирования AGRIS и Chemical Abstracts, 3 патента РФ на изобретения. Научные выводы и практические рекомендации включены в 6 учебных и учебно-методических пособий.
Диссертационная работа изложена на 324 страницах текста, включая 123 рисунка, 54 таблицы, состоит из введения, четырёх разделов, состоящих из 19 пара-10
графов; заключения, списка сокращений и условных обозначений, словаря терминов, списка литературы из 410 наименований, списков иллюстративного материала и двух Приложений.
Биологическое действие непрерывного, импульсного и амплитудно-модулированного ультразвука
Оценке влияния физических факторов акустической и электромагнитной природы на человека и животных посвящено значительное число работ [19, 21, 43, 47, 50, 54–56, 60, 62, 64, 79, 82, 84, 93, 100, 101, 109, 116, 120, 145, 158, 161, 164, 170, 171, 175–177, 180, 203, 209–211, 301, 302, 347].
Взаимодействие физических полей с биологическими тканями и клетками вследствие разной глубины проникновения может происходить как интегрально — на низких частотах, так и локально — на частотах электромагнитного излучения (ЭМИ) миллиметрового диапазона, когда во взаимодействие с полями включаются только клетки, входящие в структуры кожи и клетки крови, находящиеся в микрокапиллярах. Поэтому на сверхвысоких частотах (миллиметровый диапазон волн) биологические эффекты на уровне целого организма будут опосредованными, например, через выделение гистамина тучными клетками. Так как биологические макро — и микросистемы являются динамическими, разные клетки могут находиться на разных стадиях функционирования, а, следовательно, каждая из них может иметь разную чувствительность к фактору воздействия. Например, для ультразвуковых волн воздействие на осциллирующие эритроциты в различные фазы процесса осцилляции может приводить к разным эффектам: либо к увеличению числа осцилляций в несколько раз при сохранении уровня выброса калия из клеток, либо к сохранению числа осцилляций при существенном увеличении выброса ионов калия. [209, 210]. Поэтому максимальные эффекты физических факторов воздействия возможны при исследовании их влияния на клетки в синхронизированных культурах. Разные авторы отмечают наибольшую чувствительность к физическим факторам воздействия иммунокомпетентных клеток и клеток головного и спинного мозга.
Одной из первых мишеней воздействия физических полей на клетки является ЦПМ, имеющая поверхностный заряд, поры, каналы и мембраносвязанные ферменты. ЭМИ взаимодействует с заряженными частицами на поверхности мембраны. В системе возникают вынужденные колебания с частотой внешнего электрического поля. Ток через поверхность мембраны может иметь не непрерывный, а импульсный характер, а транспорт ионов хлора и натрия — происходить поочерёдно [53]. Концентрация электромагнитных волн в порах мембран локально повышает температуру, которая существенно превышает общий разогрев. Возникает возможность денатурации пептидных каналообразующих молекул, стрикция мембран, приводящая к генерации акустических волн, которые, в свою очередь, могут являться фактором воздействия и служить сигналом для других клеток. Локальные разогревы в мембранных порах, стрикционные сжатия и расширения мембран могут увеличивать или уменьшать открытое состояние каналов. При импульсных ЭМИ реализуется термоэластическое возбуждение акустических волн с частотой, зависящей от частоты импульсации или модуляции. Поэтому при действии ЭМИ крайне высокой частоты (30–300 ГГц) в импульсном режиме возможно глубинное воздействие на органы человека и животных за счёт воздействия генерируемых в результате поглощения ЭМИ [192]. Для сверхвысокочастотных непрерывных ЭМИ показана возможность возбуждения тороидальных вихрей в воде, существующих длительное время с колоссальными скоростями перемешивания молекул, пульсирующими в сверхнизкочастотных диапазонах [302].
При воздействии акустических волн за счёт сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможно изменение поверхностного заряда и изменение функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуются цепи одинаковых в дальнейшем эффектов как для акустических, так и для электромагнитных волн. Клетки, находящиеся в акустической волне, являются точечными по сравнению с длиной волны и могут испытывать сжатия и расширения объёма, достигающие 20%, при действии волн с амплитудой до 100 кПа. Это может уменьшить количество активных каналов за счёт латеральной диффузии молекул липидного бислоя и изменить функциональное состояние клетки.
Важную роль в функционировании клеток играет состояние воды, особенно вблизи заряженных поверхностей. Поэтому влияние магнитных, электромагнитных, акустических полей на воду и водные растворы, приводящее к структуризации диполей воды, может инициировать и существенное изменение функционального состояния клеток в сторону ухудшения из-за существенного уменьшения коэффициентов проницаемости различного вида ионов через неперемешиваемые слои.
Влияние переменных магнитных полей в последнее время изучается в многочисленных химических и биохимических экспериментах [198, 199]. Теория, объясняющая механизмы биологического действия магнитных полей на биологические системы, основана на факте существования биологических эффектов комбинированных (постоянного и переменного) магнитных полей при определённых, теоретически предсказуемых, значениях частот переменной компоненты поля, формально соответствующим циклотронным частотам ряда ионов (кальция, калия, магния). В основе расчёта частот воздействия лежит Ларморова прецессия как результат влияния магнитного поля на электронную орбиту с появлением дополнительного орбитального электронного тока и индуцированного магнитного момента электрона [116]. Механизмы, объясняющие биологическую активность ЭМИ, рассмотрены в работе Д. Панагопулоса с сотрудниками [347]. Вынужденные колебания свободных ионов вблизи поверхности плазматических мембран, индуцированные внешним полем, генерируют колебания, ускоряя транспорт ионов через ЦПМ и специализированные ионные каналы в системе активного транспорта.
Особое внимание следует обратить на действие физических полей на активность ферментов из-за особенностей функционирования как отдельных клеток (систем активного транспорта, участие в проведении нервного импульса, в наработке энергетических эквивалентов и так далее), так и биологических систем в целом. В связи с чем, изменение активности ферментов и показателей углеводного обмена при воздействии физических полей и вибрации может приводить к фатальным для клеток и тканей последствиям [62].
Результаты изучения особенностей импеданса биологических объектов животного происхождения под действием переменного электрического тока в диапазоне частот от 20 до 106 Гц выявили сложный характер частотной зависимости [51]. В ряде работ была теоретически рассмотрена возможность резонансного поглощения электромагнитного поля (ЭМП) белковыми молекулами в связи с так называемыми дисперсионными силами взаимодействия [161, 301]. В белках, содержащих ряд нейтральных и отрицательно заряженных основных боковых групп, среднеквадратичная величина дипольного момента отлична от нуля, даже если их средний постоянный момент равен нулю. Это обусловлено тем, что число поляризованных боковых групп в белковой молекуле обычно превышает число связанных с ними протонов, поэтому существует множество возможных конфигураций распределения протонов в молекуле, мало отличающихся по свободной энергии (за исключением случая сильно кислых растворов). Если предположить непрерывное распределение основных групп молекул ферментов, то происходящие за счёт флуктуации распределения протонов диполь-дипольные взаимодействия между группами может вызывать поглощение кванта энергии, соответствующего частоте 10 ГГц.
Исследование кинетики клеточной пролиферации гепатоцитов в процессе регенерации органа выявило, что облучение животных рентгеновыми лучами приводило к обратимой задержке клеточного деления гепатоцитов, которая линейно зависела от дозы облучения [47]. Индуцированная нейтронами полиплоидизация непролиферирующих гепатоцитов, так же, как полиплоидизация при регенерации органа, обратно зависела от возраста облучаемого животного.
Выявлен генотоксический эффект хронического воздействия низкоинтенсивного ионизирующего излучения на фолликулярный эпителий щитовидной железы полёвок, живущих на участке с уровнем радиоактивности (0.520 мкГр/ч), проявляющийся в увеличении частоты клеток с микроядрами. Повышенный пролиферативный потенциал может быть расценён как неспецифическая адаптивная реакция органа на хроническое радиоиндуцированное повреждение железистых клеток [177].
Учёными из Института биофизики клетки РАН (Пущино) [161] было изучено изменение относительной активности холинэстеразы при действии модулированного сверхвысокочастотного ЭМИ в опытах in vitro. Анализ результатов экспериментов позволил установить, что значимое влияние на активность холинэстеразы — от выраженного стимулирующего действия до уровня исходной активности и наоборот — оказывали частота и интенсивность воздействия. Это позволяет выделять модулированное ЭМП в особую группу излучений, биологический эффект которых зависит и от величины поглощённой энергии, и от типа модуляции, «адресованной» к первичной мишени в функционирующей системе. Следовательно, для выработки практических рекомендаций по применению электромагнитных и других видов полей в терапии необходимо будет учитывать амплитудно-частотную структуру воздействия наравне с величиной поглощённой энергии.
ЭМП радиочастотного диапазона с частотой 925 МГц (частотная модуляция 217 Гц) являются генотоксическим повреждающим ДНК стрессором для клеток млекопитающих, повышающим частоту клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов периферической крови человека при воздействии in vitro и частоту эритроцитов с микроядрами в костном мозге у мышей [100]. Воздействие ЭМП радиочастотного диапазона низкой интенсивности (несущая частота 925 МГц) приводило к развитию в костном мозге и периферической крови беременных мышей линии СВА компенсаторно-приспособительных реакций, которые проявлялись в увеличении общего числа эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови [82]. Генотоксический эффект ЭМП мог проявляться также увеличением числа полихроматофильных эритроцитов в селезёнке плода.
Выделение лейкоцитов и получение интерферона
Жизнеспособность клеток до и после УЗ воздействия определяли при помощи теста с трипановым синим [181, 384, 392]. Количество жизнеспособных клеток, поделённое на общее число клеток, показывало процент жизнеспособности. Клетки, окрашенные трипановым синим, считались нежизнеспособными.
Методика: готовили 0.4% раствор трипанового синего в фосфатно-солевом буферном изотоническом солевом растворе, pH 7.2-7.3. Добавляли 0.1 мл раствора трипанового синего к 1 мл клеток. Вносили 10 мкл окрашенной клеточной суспензии под покровное стекло и исследовали непосредственно под микроскопом при малом увеличении. Подсчитывали общее количество клеток и количество окрашенных в синий цвет. Трипановый синий избирательно окрашивает мёртвые клетки и повреждённые. Жизнеспособность клеток до и после УЗ воздействия определяли сразу и спустя 20 мин после обработки, так как УЗ обратимо меняет проницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ).
Гематологические показатели определяли общепринятыми методами. Данные средних значений общеклинических показателей крови [по 94]. 5.22. Окраска клеток крови
Делали мазки крови и окрашивали их по методу быстрого дифференцированного окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: фиксация в абсолютном метаноле 15 с, затем в растворах красителей по 10 с, промывание в забуференной воде, сушка и просмотр под иммерсией («ЛОМО» Микмед-5, объектив 100x/1.25, окуляр 10x/18). 5.23. Определение противовирусной активности интерферона Противовирусную активность ИФН определяли при использовании 4-5-суточных культур клеток первично трипсинизированной кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, или 1-2-суточных перевиваемых диплоидных культур клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека. В качестве индикаторного вируса использовали вакцинный штамм «Индиана» вируса везикулярного стоматита [108]. За противовирусную активность ИФН принимали его максимальное разведение, обеспечивающее защиту клеток от цитопатогенного действия вируса в 5% пробирок с культурой.
Белок определяли методом Лоури. Величину рH измеряли с помощью потенциометра «pH-метр 346».
Препарат ИФН был получен с использованием в процессе суспензионного биосинтеза амплитудно-модулированного ультразвука терапевтической интенсивности 0.05 Вт/см2. Частота модуляции 800 Гц, время экспозиции 30 с — 1 мин. Диапазоны воздействия подобраны экспериментально. Методика биосинтеза лейкинферона с использованием УЗ была верифицирована в Институте Медико-биологических проблем РАН.
Степень очистки ИФН и концентрацию иммуноглобулинов класса G (М) в полученном с помощью модулированного УЗ препарате ИФН определяли методом иммуноферментного анализа “ELISA-тест” [70, 141] на твердофазном носителе (ELISA — enzyme-linkedimmune-sorbentassay). Метод основан на взаимодействии растворённых (солюбилизированных) иммуноглобулинов с физически адсорбированными на пластике. Количество связанного конъюгата определяли проведением ферментной реакции со специфическим субстратом пероксидазы.
Ферментативную активность определяли методами Н. М. Титовой, Т. Н. Замай и Г. И. Боровиковой [22]. Активность измеряли в стандартных условиях по увеличению скорости каталитической реакции по сравнению с некаталитической. Скоростью реакции считается изменение концентрации субстрата или продуктов за единицу времени (ммоль/л в секунду). Международная единица (Ед, МЕ) это количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата в 1 минуту [94].
Для определения биохимических показателей сыворотки и плазмы крови животных: активности креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (AсАT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) — использовали отечественные тест-системы «Эколаб» и автоматический биохимический анализатор URIT — 8030. В среднем проводили не менее 7-10 измерений на точку. Данные средних значений биохимических показателей крови даны по Р. Кирку [94]. В работе использованы реактивы фирмы «Sigma», «Merk», реактивы отечественного производства (ч.д.а).
Метод определения ЛДГ основан на различии спектров поглощения окислённой и восстановленной форм НАД при 340 нм. Активность ЛДГ в сыворотке крови лошади, определённая этим методом, в норме при 25-30C находится в диапазоне 125-381 МЕ, что соответствует 2051-6250 нмоль/(с л) [113]. Активность ЛДГ определяли спектрофотометрически и с использованием автоматического биохимического анализатора URIT-8030. Референтные интервалы: для собак — 23-164 МЕ, для кошек — 55-155 МЕ, для лошадей — 100-400 МЕ [94]. У молодых, растущих животных активность ЛДГ увеличена в 2-3 раза.
Существует 2 группы методов определения активности трансаминаз в сыворотке крови: спектрофотометрические и колориметрические. В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга, эти методы наиболее специфичные и точные. Колориметрические методы основаны на образовании красно-буроокрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования.
Наибольшее значение имеет определение активности двух ферментов: аспартатаминотрансферазы (АсАТ, АСТ, англ. SGOT — Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase) и аланинаминотрансферазы (АлАТ, АЛТ, англ. SGPT — Serum Glutamic Pyruvic Transaminase), поскольку эти ферменты обладают большой каталитической активностью.
В качестве единицы принята активность трансаминазы, содержащейся в 1 мл сыворотки (плазмы) крови, которая в условиях описанного метода образует 1 мкг пировиноградной кислоты. Основа метода: гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде даёт коричнево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты, а по количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента.
Активность аминотрансфераз выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшейся в 1 мл сыворотки крови за 1 ч инкубации при 37С, или в международных единицах (МЕ/л).
Методика обработки цельной крови и сыворотки
До настоящего времени попыток использования возможностей фрактального анализа в целях диагностики физиологического состояния клеток после воздействия акустических полей или каких-либо других физических факторов предпринято не было. Есть работы по применению фрактальных методов для оценки диаметра дрожжевых клеток [391]. Остановимся на кратком описании основных положений теории фракталов и подходов фрактального анализа.
Биологические системы успешно существуют в широком диапазоне воздействующих факторов, адаптируясь к ним, поддерживая свой гомеостаз. Наличие фрактальных отношений является звеном нормальной деятельности различных функциональных систем организма. Фрактальный подход в биологии и медицине позволяет создавать новые оригинальные методы диагностики и коррекции состояния живых систем.
В ряде работ А. М. Носовского с коллегами [135-137] обосновано, что в основе гомеостаза живых систем лежат фрактальные отношения между их количественными показателями, формирующими многомерное динамическое пространство.
Источниками физиологической вариабельности характеристик макросистем могут служить колебательные процессы во внешней и внутренней среде. Колебательный характер изменений параметров, характеризующих жизнедеятельность организма на клеточном
и макроскопическом уровнях, установлен многими исследователями [23, 103, 115, 197, 276]. Более того, флуктуации основных характеристик состояния существуют, когда параметры внешней среды поддерживаются на максимально возможном постоянном уровне [24, 197]. У многоклеточных эукариот импульсный характер генной активности выражен сильнее, чем у бактерий [273, 311, 325, 377].
В целом биосистемы можно считать автоколебательными, так как колебательные процессы в них не обусловлены внешним воздействием. Состояние любой автоколебательной системы можно описать алгоритмом перемещения точки в фазовом пространстве [132, 353]. Установившимся колебательным процессам в системе соответствуют аттракторы в фазовом пространстве — множества точек (или подпространство), к которому приближается траектория после затухания переходных процессов. Хаотическому движению динамической системы соответствует более сложный (странный) аттрактор — притягивающее множество в фазовом пространстве, по которому движутся хаотические траектории.
Степень зависимости автоколебательной системы от начальных условий может быть измерена с помощью показателей Ляпунова, являющихся мерой расходимости траекторий в фазовом пространстве. Для каждой размерности фазового пространства показатель Ляпунова только один [68, 81]. Положительное значение показателя Ляпунова свидетельствует о том, что фазовое пространство растягивается (то есть близлежащие точки расходятся), а отрицательное — о том, что фазовое пространство сжимается (система восстанавливается после испытанного возмущения).
Соединяющим началом между фрактальными отношениями и системной целостностью для них является самоподобие. По изменению фрактальной размерности динамического (временного) ряда можно оценить гомеостаз физиологических систем. В качестве количественных мер, характеризующих хаотические колебания, в нелинейной динамике используются меры регулярности и геометрии движения: фрактальные размерности, энтропия Колмогорова и показатели Ляпунова [132].
В связи с необходимостью охарактеризовать различные самоподобные структуры математиком Мандельбротом [133, 319] было введено понятие фрактал. В настоящее время этот термин используется в физике, химии, биологии, медицине, физиологии, психологии, радиолокации, компьютерной графике [26, 107, 182].
Фрактал — геометрическая форма, которая может быть разделена на части, каждая из которых — уменьшенная версия целого [26]. Одно из основных свойств фрактала — самоподобие, которое означает, что фрактальный объект состоит из большого числа «копий» самого себя. Фрактал — это геометрическая фигура, определённая часть которой повторяется снова и снова [107]. Фрактальная размерность характеризует способность системы заполнять пространство.
Все части живых организмов построены по квазифрактальному принципу и несут в себе черты самоподобия, а многие биологические структуры имеют откровенные фрактальные формы. В человеческом организме множество фракталоподобных образований, например, сердечно-сосудистая, нервная, дыхательная система. При анализе принципов организации обмена кальция на организменном и клеточном уровне было выявлено полное подобие фрактальным структурам [54]. Возможно, в будущем, благодаря изучению фракталов, будут получены более тонкие методы анализа различных нарушений функций организма при старении, заболеваниях и воздействии токсичных веществ [215].
Фрактальная размерность (D) — количественная характеристика множества точек фазового пространства, показывающая, насколько плотно точки анализируемого динамического ряда заполняют подпространство, когда их число становится очень большим. Фрактальная размерность (размерность Хаусдорфа или Хаусдорфа-Безиковича) определяется как предел, если он существует, отношения натурального логарифма наименьшего числа кубов с длиной ребра , необходимых для покрытия геометрического образа динамического ряда, к натуральному логарифму обратной длины ребра куба: D = lim +/ Если множество состоит из одной точки, то для него N() = const = 1. Следовательно, размерность Хаусдорфа точки равна нулю. Если множество представляет собой отрезок длиной L, то N()= L-1, поэтому D=1, в то время как для поверхности площади S N()= S-2, и, значит, D=2. Когда размерность фазового пространства больше двух, в качестве фрактальной размерности используется корреляционная, являющаяся нижней оценкой фрактальной размерности [11, 13, 26-28, 30, 38, 68, 80-82, 86, 98, 99, 107, 133, 142, 163, 182, 222, 236, 262, 270, 319]. Корреляционная размерность несёт информацию о степени сложности поведения динамической системы, характеризуя гомеостаз.
Анализируя чередование участков с различной фрактальной размерностью и тем, как на систему воздействуют внешние и внутренние факторы, можно предсказывать поведение системы. И что самое главное, диагностировать и предсказывать нестабильные состояния.
В настоящее время известно, что дробная часть фрактальной размерности является количественной мерой степени хаотичности системы. Чем поведение системы хаотичнее, тем ближе дробная часть фрактальной размерности к единице. Если же фрактальная размерность значительно более 1.6, система становится неустойчивой и готова перейти в новое состояние. Если размерность около 1.5, то факторы, действующие на систему, разнонаправлены, и более или менее компенсируют друг друга. При фрактальной размерности менее 1.4, на систему влияет фактор, двигающий систему в одном определённом направлении.
Изменение фрактальной размерности при изучении динамики изменяющихся показателей целостного организма является результатом влияния на биообъект внешних или внутренних факторов, вызывающих изменения его состояния. По способности клеток крови сохранять или изменять свою реакцию на воздействующие физические факторы в данной работе мы впервые попытались оценить чувствительность микросистемы. Предлагаемый подход использует и раскрывает понятие целостности организма, его пространственно-временную определённость и многофакторность взаимодействия с окружающей средой.
Биохимические методы
Бабезиоз собак — протозойная природно-очаговая трансмиссивная болезнь, вызываемая простейшими отряда Piroplasmida, семейства Babesiidae, рода Babesia, протекающая сверхостро, остро и хронически. Заболевание широко распространено по всему миру, и широта распространения определяется ареалом обитания иксодовых клещей, передающих заболевание через укус [18, 106, 378]. Род Babesia включает в себя большое число видов. Для собак наиболее опасны B. canis и менее распространённая в средней полосе России B. gibsoni. Бабезии являются внутриклеточными паразитами, поражающими эритроциты, иногда нейтрофилы. Возбудители внутри клеток имеют грушевидную, овальную или округлую форму, располагаются преимущественно попарно, но могут быть и одиночные бабезии в эритроцитах. Размер B. canis составляет 3–5 , B. gibsoni значительно меньше. У заболевания наблюдается сезонность, что в свою очередь связано с циклом развития иксодового клеща [18, 36, 37].
В последние 10 лет выявлена связь между тяжестью течения бабезиоза и формой, размером, расположением, числом бабезий в клетках крови (эритроците, нейтрофиле) и плазме периферической крови. Не выявлено породной, половой и возрастной предрасположенности к бабезиозу [18, 37, 260]. Бабезии обнаруживают при микроскопии мазков, окрашенных по РомановскомуГимзе [37; 106].
Изменения гематологических показателей при бабезиозе. У собак, больных бабезиозом, биохимические и общеклинические показатели крови отличались от аналогичных показателей собак с микрофиляремией. В зависимости от интенсивности инвазии показатели общеклинического анализа крови могли колебаться в следующих пределах (p 0.05): гематокрит — от 8.9% до нормы, содержание эритроцитов — от 1.25 1012/л до нормы, тромбоцитов — от 11 109/л до нормы, лейкоцитов — 2.3–35 109/л, СОЭ — 1–19 мм/ч. Закономерность в сдвиге ядра выявить не удалось. Характер изменения биохимических показателей также напрямую зависел от степени поражения организма бабезиозом. Содержание общего белка составляло 46–79 г/л, количество общего билирубина в крови колебалось от нормальных значений до 1260 мкмоль/л (p 0.05), мочевины (p 0.05) — от 2.3 до 80 ммоль/л, креатинина (p 0.05) — от нормальных значений до 1200 мкмоль/л (у животных со вторичной, по отношению к основному заболеванию, острой почечной недостаточностью). Активность ферментов изменялась в диапазоне от нормальных значений до следующих: АсАТ — до 360 МЕ/л (p 0.05), АлАТ — до 510 МЕ/л, ЩФ — до 1340 МЕ/л, ЛДГ — до 847 МЕ/л (p 0.05).
Отмечены следующие изменения гематологических показателей при смешанной инвазии. Гематокрит понижен в 1.2–1.3 раза; СОЭ составляла 42–45 мм/ч; содержание гемоглобина, лейкоцитов, эритроцитов — в пределах нормы, тромбоцитов — в 4–5 раз меньше нормы (p 0.05). Уровень глюкозы не изменялся. Превышало норму содержание общего билирубина — в 3 раза, мочевины и активности АлАТ — в 2.7–7.5 раз, содержания креатинина и активности АсАТ — в 1.8–4.8 раза, активности ЩФ — в 3–11 раз. Сыворотка крови иктерична. Лейкограммы характеризовались значительным увеличением (таблица 27 на странице 120) числа моноцитов (в 1.7–5.7 раз), уменьшением количества сегментоядерных нейтрофилов (в 2–4 раза) и лимфоцитов (в 1.7–3.5 раз) по сравнению со здоровыми животными (p 0.05). Сильный разброс данных объясняется значительными колебаниями референтного ряда для каждого вида животных и невозможностью в большинстве случаев сравнить лейкограммы одних и тех же особей до инвазирования и после лечения: большинство хозяев делают анализ крови питомцам только в острый период болезни и после выздоровления. У всех наблюдаемых ранее животных с бабезиозом или дирофиляриозом не выявлено такого выраженного сдвига ядра влево (юных форм нейтрофилов в лейкограмме более 25%), как у собак со смешанной инвазией. При смешанной инвазии в крови обнаружено большое число юных форм нейтрофилов; лизис лейкоцитов начинался на 10-й секунде УЗ воздействия. При микрофиляремии у больных животных наблюдали сдвиг ядра влево, но не так сильно выраженный.
Изменения цитологических показателей после УЗ обработки крови при бабезиозе, дирофиляриозе и смешанной инвазии. Применяемый авторами метод окраски ДИФФ-КВИК позволил выявить наличие возбудителей как дирофиляриоза D. repens, так и бабезиоза B. canis в крови животных. Поэтому необходимость использования более длительного метода окраски по Романовскому–Гимзе отпала, и мы во всех исследованиях пользовались набором для быстрого дифференцированного окрашивания мазков крови. После УЗ обработки в течение 10 с проб крови животных со смешанной инвазией могли наблюдать изменения формы эритроцитов (рисунок 27г) и их структуры. Гемолиз эритроцитов при УЗ обработке крови животных с дирофиляриозом наступал через 25 с; бабезиозом — через 30 с, со смешанной инвазией — через 18–20 с. Отмечено начало лизиса клеток белой крови уже на 10-й секунде обработки ультразвуком, что осложняло их идентификацию. Похожую картину наблюдали в пробах крови животных с моноинвазиями (D. repens или B. canis) после 15-секундной УЗ обработки. (в контроле — после 30 с и дольше.) При микроскопии окрашенных мазков были выявлены дирофилярии, бабезии и частичное или полное разрушение всех видов лейкоцитов (рисунок 27а). У нейтрофилов происходили последовательно «вакуолизация» цитоплазмы, деформация и разрыв ядер и цитоплазмы. Так же, как и в крови собак с моноинвазиями, молодые формы клеток сохранялись дольше на фоне нарушения целостности ЦПМ и ядер.
УЗ волна с интенсивностью 0.4 Вт/см2 и частотой модуляции 10 Гц и 900 Гц вызывала клеточную агрегацию, изменяла форму эритроцитов, лейкограмму и структуру лейкоцитов животных с паразитемией (таблица 27 на странице 120). Цитологические изменения в клетках крови собак со смешанной инвазией наступали значительно раньше, чем у животных с моноинвазиями — микрофиляремией или бабезиозом.
При действии на кровь животных со смешанной инвазией (бабезиоз и дирофиляриоз) модуляция УЗ 900 Гц в течение 15 с вызывала агрегацию лейкоцитов, разрыхление их ядер и лизис цитоплазматических мембран. Увеличение экспозиции до 45 с приводило к появлению в мазках теней клеток и почти полному (более 97%) лизису всех видов лимфоцитов. Лейкограмма в целом претерпевала значительные изменения. После 15 с действия модулированного УЗ с частотой 900 Гц количество сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с контролем сокращалось в 1.5–2.4 раза, а число юных и палочкоядерных нейтрофилов составляло до 50% от общего числа лейкоцитов. Молодые и незрелые клетки разрушались последними (таблица 27). Строение гранулоцитов менялось в зависимости от экспозиции, вплоть до полного лизиса клеток. У нейтрофилов наблюдали деформацию и «вспенивание» ядра, вакуолизацию цитоплазмы. Разрушение начиналось с клеток, содержащих внутриклеточных паразитов. Частота модуляции 10 Гц также приводила к существенному сдвигу лейкограммы влево. При этом клетки было сложно идентифицировать, у более, чем 20% из них, были лизированы или разорваны ядра и /или цитоплазма, а их окраска была неоднородна и неспецифична. Ядра могли быть вакуолизированы или содержали зернистость. Во всех случаях отмечена иктеричность сыворотки крови, вызванная УЗ гемолизом эритроцитов. Во всех мазках крови, обработанной УЗ, в поле зрения микроскопа обнаружено большое количество тромбоцитов разного размера (рисунок 27в). По нашему мнению, это следствие более глубокой окраски клеток крови после УЗ воздействия, но, возможно, и влияние процесса двойной инвазии. После действия на пробы крови модулированным УЗ активность ЩФ, АсАТ и АлАТ возрастала в 3 и более раз, что, по-видимому, вызвано разрушением клеток.