Введение к работе
Актуальность- проблемы. Способность тромбоцитов и гранулоци-тов донорской крови легко активироваться под влиянием эндогенных и экзогенных факторов обусловливает их быстрое разрушение не только в условиях экстракорпорального кровообращения, но и в процессе выделения этих клеток и хранения донорской крови {.Ъгеие, Р-. г-.а-. , 1984; 4U?ntu~ Q). «&.*., 1986), В консервированной крови наблюдается образование микроагрегатов, пред -ставляющих собой микросгустки размером более 170 икм и агрегаты разрушенных клеток 10-200 шел, соогояцие в ооновном из фрагментов тромбоцитов, лейкоцитов и фибркновах гатеїі. Микроагрога-ты крови при транофузпях могут вызывать закупорку капилляров в органа;с реципиента и быть причиной различных пооттранеруэионных осложнений.
Вакнуэ роль в образовании мякроагрегагог' играет фибронек-гин плазмы крови, посредством которого клетки взаимодействуют иезду собой и компонентами межклеточного матрикоа,и осуществляется модуляция активации адгезии и агрегации тромбоцитов и гра-яулоцитов. Полифункционалыюсть фибронектияа объясняется наличи-вм в его гликопротовдной молекула специфических доменов и ело -зобноотью к аугопрогеолизу и прогеолизу с освобождением высокоактивных пептидных.фрагментов, содержащих, например,' последовательность аргянил-глщил-аопарг'ил (Л-РЯ),
В свете существенной роли тромбоцитов и гракулоцитов в громбогенном потенциале' донорской кропи и разнообразных метаболических и физиологических сдвигах у реципиентов, индуцируемых
биологически актизиклі везесгвака:, освобождаемыми активирован-нк.:п н незрэздзнккми тромбоцитами и гранулоцитами, вполне обо-сковакннм является поиск путей скинення "спонтанной" активации ог:-:х клею:: і: консервированной донорской крови и удаления "предаг.тпвпроЕйнных" тромбоцитов к гранулоцитоз, способных адге-знроватьел :: йнбронектину к я.едатику. В связи с этим, наші предпринято поучение 5унї:и:юнальясго состояния тромбоцитов и грану-лоцитов в донорской крози в условиях избирательного удаления из нее физ'ронзктпна (до начала наших исследований эти дачные от-сутсгвовахи), что представляет большой научный интерес и имеет важное практическое значение как возможный способ стабилизации активности клеток донорской крови.
Цалш и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в получении данных о функциональной активности тромбоцитов и гранулоцптов в условиях избирательного удаления юибронекгина из донорской крови. Конг.ретннз задачи исследования заключались в следуюдг:.!:
-
Разработка оптимальних условий сорбции и десорбции фнброяектпна из цельной донорской крови ка сорбенте силикагель-яелатине.
-
Зкявление возиолюстк стабилизации тро?лбоцитоз и гранулоцитоз донорской крозл путем фильтрации ез через силикагель-желатпн. - v
-
Хіігівление возможности эндогенной продукции фибронектина в процессе хранения донорской кроаи.
Научная гонизна. Показано, что избирательное удаление фибронектина из донорской крови,пугем сорбции его на спликагель-яелатинз, значительно снимает функциональную активность -Тро:„-
- 5 -боцкгов и гракулоцктов: агрегацнонная способность тромбоцитоз считается з 2-3 раза, а ді-с.ікнолзаг>кс;?,:.ая хс\:нл:;'.п;кзсцз:пдпя -гранулсцптов - в 10-13 раз. Восстаноглзкнс походной физиологической концемграции дліброіізктпяа в продхіьтрозанлої* кроки, напротив, яоЕьшает функциональные ответы зтіос глоток.
Установлено, что при использования нитратного буйєра, вместо 4,';! мочозиіш для элюцлл фпсронсктина с сцлккаголъ-г.елагк-на, ззнход и чистота сВдброяектина нэ умоньтаїнсь. Выявлено, что опдогешюго гфодуцпрозаніїя ддю'ронектпна в процессе хранения профильтрованной черэз сїгликагелг>-/.:елатин донорской крови не происходит.
Практическая тгенностъ. Полученные результата сеудєтєльсї-вутэт о том, что удаление фпбрсноктияа из донорской крови значи- ' телько снижает ^унюр-ональнуа активность тромбоцитоз и гранулс-цитсв, что очэпь существенно для уменьшения кіг*роагрегадка донорской крови и еэ троілйогашюскі. Практическое значение яма;../ и наши дакнке по разработке оптимальних условий сорбіт;--! на сорбенте спликагедь-ивдаткне фиброкектпяа из цельной донорской кров:1!: и поеледуюдой ого десорбции с цельэ получения ірибронеїші-на плазмы крозк, пригодного для лабораторних, биотеинологкческих долой и последующих клинический нспптап:п:.
Г.'атаркзлы исследотаьпй долог.елп; і: обсу;;тдєж» на заседают .секции "Биохимии крови" Всесоюзного бпокпгягческого общества АН СССР (Москва, НПЩ, 27 января 156Э г ) включены з програму 2-го Всесоюзного каучно-прахтлчоското соїдаїара 'Чуакциокальноз, кли-ккческоо и диагностическое значение длібронектина" (Y-ocicsa, ГКЇ ТТіїПЗ АІ.ЇЇ СССР, П-ІЗ декабря IS39 г ) и предстаглзіп; па 1-А Всесоюзной пп<олз-сэ;,г.;нарв "Тромбоцит как тост-скстег.а >;цзколзгл-ческих и патологических состояний человека" (Москва, Ні'Л ГїлПЗ
- є -АМН СССР, 12-14 пошт 1ЭЭО г ).
; Сгрукттса и объем диссертации. Диссертация изложена на 116.: страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемых публикации, включающего 134 источника.
Материалы и це'іодн исследования. Исследования проведены на 55 донорах крови станции переливания крови ВГЩ и 55 практически здоровых лицах, наблюдавшихся в кардиологическом отделении ШИ гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР.
Материалом для исследования была сверкая цигратпая кровь и донорская плазма.
Концентрацию фибронектана в плазме крови измеряли при поїзди а&Іинкой. хроматографии на коммерческой ;келатин-се$арозе 4В ( "tMfH^tuutii- ", Швеция) и на силикагелъ-келатине, полученном в лаборатории биохимки ВГНЦ Н.А.Федорова/г и соавт. (1987 г), а также турбидякетрнческим методом с использованием коммерческих реактивов фирмы " .^SWAc^^r- "Австрия) и реакцией гемагглюти-нации келатЕнизированкых эритроцитов барана (Й.Н. Овчарук и соавт., IS90 г ). В большинстве случаев результаты были сопоставимы, но в силу быстроты определение концентрации фибронектина в плазме крови мы осуществляли гурйидиметричеснш методом.
Количество.тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови подсчитывали общепринятым-методом в счетной камере Горяева ("Лабо-
- ? -
раторшэ метода исследования в клинике. Справочник", 1937 г ).
Функциональную активность тромбоцитов донорской крови определяли измерением їж агрэганионнои способности, согласно методу «&>**-- (1962 г), на агрегоглетре, сконструированном в МЇУ Е.С.Лебедевым и соавт., с использованием в качестве индук-тороз агрегации аденозиндифосфата (АД5) ( &1*пг-", ФРГ) /0.2; 0,5 я І мкііі/ я арахидо'ковоЁ кислоты ("А^лиг/,. США.) /250 к1 500 мкМ/.
вункцкональнуи активность гранулоцитов донорской крови определяли путем измерения лаигаолусклешюй хекклмминеспенпхи (S.О.Сиолиговец и соавт., 1989 г) на лгаинометре ХЖ ІЦ-0І о использованием 5кМ раствора лнмикола ( -«wit- , ФРГ), формил-метионил-лойніи-^ошілаланиа (>5#«Я) ( "&tf*ui.', США) /5 10- раствор/ и зклозака ( из J! я^п^яе- gca^st ) ( Щмл- , США) в качестве активаторов дыхательного взрыва.
Цельную донорскуп кровь (5 мл),без принудительной прокачки, пропускали через колонку Д 16 см/, заполненную 10 мл сорбента силикагель-калаткна,-прадваритвльно уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ССБ) рН 7.4. Зйющпо фибронектина осуществляли 4М мочевиной в 0.03.1 7 - №- буфере (рН 7.4) со скоростью 0.25 мл/мин или 0.05 М нитратным буфером ( рй 5.5) при 37С, принимая во внимание указания ^и^^-^Л^&л, У, ^.<г,(1Э34 г).
Чистоту выделяемого фябронектияа плазмы крови оценивали
электрофоретпческя общепринятым методом в 6% полаакриламидном-
геле при-стандартных условиях. ,
Результаты исследований обрабатывали статистически о помощью коэффициента Стьвдента.,;,