Введение к работе
Актуальность проблемы. Обратимое фосфорилирование белков, катализируемое фосфопротеинкиназами (К.Ф.2.7.1.37) и фосфопротеинфосфатазами (PPPs, К.Ф.3.1.3.16) является одним из главных механизмов контроля внутриклеточных процессов (Krebs, 1986; Cohen, 1989).
Реакциями фосфорилирования-дефосфорилирования белков регулируются различные биологические процессы, а именно: метаболизм нуклеиновых кислот, аминокислот, углеводов, липидов, функции синаптических мембран, сократительного аппарата, передача нервного импульса, образование и разрушение цитоскелета и др. (Krebs, Beavo 1979; Krebs, 1985).
Достигнут существенный успех в изучении влияния фосфорилирования гистонов и негистоновых белков на функциональную активность клеточного ядра (Кучеренко и др., 1983).
PPPs в настоящее время изучены менее подробно, чем протеинкиназы. Интенсивное исследование PPPs началось в последние 10-15 лет. К настоящему моменту накоплено достаточно много сведений о специфичности, структуре, регуляции цитоплазматических PPPs (Ballon, Fischer, 1986), что касается PPPs из клеточных ядер, то эти ферменты изучены в значительно меньшей степени, чем цитоплазматические.
В настоящее время известны два класса PPPs: фосфосерин/ фосфотреонинпротеинфосфатазы (PSPPs) и фосфотирозинпротеин-фосфатазы (PTPPs), которые отщепляют фосфорильный остаток от фосфосериновых/треониновых или фосфотирозиновых остатков фосфопротеинов, соответственно. Наиболее широко представлен и изучен класс PSPPs (Cohen, 1989).
В последнее время особое внимание уделяется фосфорилированию клеточных белков по тирозиновым остаткам, которое непосредственно связано с регуляцией клеточной
актианости включая пролиферацию, дифференцировку и трансформацию (Lau et al., 1989). К настоящему моменту изучены трансмембранные и цитоплазматические PTPPs (Fisher et al., 1991). Сведений о ядерных PTPPs в литературе практически нет, хотя накоплено достаточно данных о существовании различных ядерных белков, фосфорилированных по тирозиновым остаткам (Meek et al., 1992), поэтому изучение ядерных ферментов сейчас является наиболее актуальным.
Цель и задачи данного исследования. Цель данного исследования: определение типа РРР из клеточных ядер селезенки быка, изучение локализации фермента и взаимодействие с хроматином. При выполнении работы стояли следующие задачи:
-
Выделение и характеристика РРР из клеточных ядер селезенки быка и нерпы.
-
Изучение субстратной специфичности и ингибиторный анализ фермента.
-
Получение, очистка и характеристика антител к РРР из клеточных ядер селезенки быка.
-
Изучение тканевой и видовой иммуноспецифичности РРР.
-
Изучение локализации фермента.
-
Изучение взаимодействия РРР с хроматином.
Научная новизна. В данной работе впервые определен тип РРР из клеточных ядер селезенки быка. Исследование субстратной специфичности показало, что фермент катализирует дефосфорилирование фосфотирозинозых остатков казеина, а также фосфотирозин и паранитрофенилфосфат (pNPP, аналог фосфотирозина). РРР ингибируется ионами цинка и ортованадата в микромолярных концентрациях (специфическими ингибиторами PTPPs). Ингибирование активности фермента ортованадатом натрия является бесконкурентным, а сульфатом цинка - смешанным.
Получены, очищены и охарактеризованы антитела к РТРР из клеточных ядер селезенки быка.
Определено, что низкомолекулярная форма РТРР не является ткане- и видоспецифичной.
Изучена локализация РТРР в ядре. Методом солевых экстракций показано, что значительная доля фермента связана с хроматином. Основная часть РТРР связана с труднофрагмеитируемой нуклеазами фракцией хроматина.
Методом иммунной электронной микроскопии при спрединге ядер изучена локализация РТРР с использованием моноспецифических поликлональных антител, коньюгированных с частицами золота. Показано, что фермент распределяется по хроматину неравномерно, в основном, выявляется в наднуклеосомных структурах.
Изучено связывание ,251-меченного препарата РТРР с фракцией легкофрагментируемого микрококковой нуклеазой хроматина печени крыс в условиях низкой ионной силы. Показана специфичность взаимодействия, наличие одного типа мест связывания и максимальная связывающая способность, представлены результаты по связыванию. Определено, что основная доля фермента связывается с высокополимерными ДНП-фрагментами хроматина после электрофореза (ЭФ) в ПААГ.
Научно-практическое значение. Разработан
высокочувствительный специфический метод определения РТРР (2-20 нг), сочетающий ЭФ в ПААГ с иммунопреципитацией, который может быть использован при изучении тартрат-нечувствительных кислых фосфатаз.
Разработан высокочувствительный быстрый метод определения тирозина (1-10 нмоль) с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения фосфотирозинфосфатазной активности, который может быть использован для изучения фосфотирозинпротеинфосфатаз.
Апробация работы, Основные материалы диссертации были доложены на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции
клеточного ядра" (Пущино, 1984), на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1984), на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), на XI Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на^страницах, включает 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 168 авторских ссылок.