Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений : Свойства и регуляция активности Матасова, Лариса Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование особенностей функционирования, регуляции активности, механизма действия ферментов представляет интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения. Знание структуры и характеристик ферментов, разработка способов их выделения являются объектом внимания медицины и некоторых отраслей промышленности, поскольку ферментные препараты широко используются в диагностических и лечебных целях, практике лабораторных исследований, промышленном синтезе ряда биологически активных соединений. Исследования отдельных ферментных систем позволяют приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень

В этом плане многие аспекты регуляции метаболизма изучены крайне недостаточно. Это относится, в частности, к ферментам, катализирующим взаимопревращения гексозомонофосфатов: фосфоглюкомутазе (ФГМ. КФ 2.7 5.1) и фосфоманномутазе (ФММ, 2.7.5.5). Как правило, ФГМ встречается в клетках в большом количестве и является важным пунктом регуляции обмена запасных Сахаров (Galloway, Dugger, 1994). Этап ФММ реакции необходим для синтеза различных полисахаридов маннановой структуры, в том числе составляющих матрикс клеточкой стенки, а также компонентов гликопротеидов (Small. Matheson , 1979) ФГМ была выделена и охарактеризована из ряда объектов, в основном микроорганизмов и тканей животных (Ray, lr. Peck, [г. 1972; Joshi. Lane, 197S), ФММ - малоизученный фермент. Ряд аспектов функционирования ФГМ и ФММ в клетках высших растений остается практически неисследованным Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: шггозоле и хлоропластах, представляет интерес изучение субклеточной локализации ФГМ и ФММ в растительной клетке и возможное участие данных ферментов в сопряжении процессов, протекающих в различных компартментах клетки. До сих пор остается открытым вопрос о субстратной специфичности ФГМ и ФММ. Исследование каталитических и регуляторных свойств данных ферментов имеет существенное значение для понимания физиолого-биохимической роли ФГМ и ФММ в клеточном метаболизме высших растений.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности ФГМ и ФММ высших растений. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение и субклеточную локализацию ФГМ и ФММ в высших растениях. Исследовать изменение активностей ферментов при прорастании семян некоторых растений.

2. Разработать эффективные методы получения высокоочищенных препаратов ФГМ и ФММ из различных растений.

3. Провести изучение субстратной специфичности ФГМ и ФММ

4 Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства ФГМ и ФММ из разных растений,

5. Дать сравнительную характеристику различно локализованных форм
ФГМ.

6. Провести исследование влияния некоторых внешних факторов
(засоления, света) на ФГМ и ФММ

7. С учетом особенностей свойств ФГМ и ФММ разработать гипотетическую
схему регуляции и сопряжения метаболических процессов в различных
компартментах растительной клетки на уровне данных ферментов

Научная новизна. Показано, что ФГМ и ФММ встречаются в высших растениях в виде различно компартментализованных форм: цитоплазматической и хлоропластной; причем преобладающей формой является цнтоплазматическая Г--80-95% от общей активности). Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочишенные (в том числе гомогенные) ферментные препараты ФГМ и ФММ листьев гороха и кукурузы. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализованных форм ФГМ. Показано, что для различно компартментализованных форм ФГМ наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (чувствительность к субстратному ингибированию, концентрациям АТФ, влиянию 3-фосфоглицерата, различные электрофоретические подвижности). Разработаны способы разделения ФММ и ФГМ. Изучены некоторые свойства ФММ листьев гороха и кукурузы. Исследована субстратная специфичность ФГМ и ФММ, и выявлено, что ФГМ является бифункциональным ферментом, в то время как ФММ - монофункциональный фермент. Предложена гипотетическая

схема регуляции метаболизма углеводов в клетке на этапе фосфоглюкомутазной реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма растений.

Практическая значимость. Разработанные методы получения электрофоретически гомогенных препаратов ФГМ и ФММ из растений могут применяться в лабораторной практике и производственных условиях для выделения и очистки ферментов. Полученные ферментные препараты могут быть использованы для моделирования сопряженных ферментных систем in vitro. В связи с этим большое значение имеют результаты исследований по изучению специфичности ФГМ и ФММ.

Поскольку реализация потенциальной продуктивности растений во многом зависит от эффективности углеводного обмена, изучение закономерностей его ферментативной регуляции имеет важное значение для изыскания оптимальных путей применения различных биологически активных веществ в практике сельского хозяйства, а также для понимания адаптивных реакций растений на внешние воздействия.

Материалы работы используются в учебном процессе набиолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Этимология", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущине 1996): симпозиуме Российского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); 10-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Флоренция, Италия, 1996); VII Всероссийской конференции "Физико-химические основы и применение ионообменных процессов", (Воронеж, 1996); Всероссийской с участием стран СНГ конференции "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); II Открытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино (Пущино, 1997); II Съезде фотобиологов (Пушино, 1998), II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1998).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 9 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

4. Показано существование двух основных фондов ФГМ и ФММ активностей в растительной клетке: цитоплазматического и хлоропластного. В количественном отношении преобладающим является цитоплазматический фонд (80-95% от общей активности).

5. Исследования, проведенные на высокоочищенных ферментных препаратах ФГМ из растении показали, что различно локализованные формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций субстратов, адениловых нуклеотидов, ионов некоторых металлов (Mg *, Мп²"), интермедиатов углеводного обмена (6-фосфоглюконата. фруктозо-6-фосфата, 3-фосфоглицерата) и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (цитрата, изоцитрата)

6. Хлоропластная и цитозольная формы ФГМ, имея сходные каталитические свойства (кинетическое поведение по отношению к ионам Mg" и Мп" . близкие молекулярные массы, оптимумы рН и сродство к субстратам), различаются по электрофоретической подвижности, стабильности, и могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии.

7. Несмотря на сходные хроматографические и каталитические свойства, достигнуто разделение ФГМ и ФММ. Цнтоплазматическая ФГМ может катализировать реакцию изомеризации как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата. ФММ, напротив, является моноспецифическим ферментом Выявлены различия в оптимумах рН, сродстве к субстрату, стабильности ФГМ и ФММ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 173 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (137 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 51 рисунок и 21 таблицу; в приложении - 2 рисунка и 7 таблиц.