Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы все большее внимание уделяется изучению неспецифических факторов защиты организма от различных повреждающих воздействий. Одним из ключевых компонентов системы неспецифической резистентности являются нейтрофильные гранулоциты - высокодифференцированные клетки, специализированные на осуществлении защитных реакций путем фагоцитоза или выделения антимикробных веществ в среду (.Пига-ревский,1973; Klebanoff, Clark,1978). Сочетание готового эф-фекторного потенциала со способностью к быстрой его реализации
свойство, которое делает нейтрофил одним из участников ранней ответной реакции на любые изменения в тканях организма (Маянский А., Маянский Д. ,1939). В лизосомальных гранулах нейтрофилов содержится набор биологически активных молекул -миелопероксидаза, лизрцим, нейтрально-Щелочные протеиназы, кислые гидролазы, неферментные катионные белки. Одним из компонентов гранулярного аппарата нейтрофилов являются дефенсины
группа гомологичных катионных полипептидов, открытых в 1963 году (Zeya, Spitznage1,1963) и детально изученных позднее другими американскими учеными (Ganz et al. ,1985; Lelirer et al.,1993), а в настоящее время привлекающих внимание многих исследователей благодаря обнаружению у этих пептидов спектра функциональных свойств. Дефенсины обладают высокой антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательяых бактерий, грибков и некоторых оболочечных вирусов, а также имеют ряд свойств, проявляющихся при взаимодействии их с различными типами клеток организма - способны вызывать хемотаксис макрофагов (Territo et al. ,1989), дегрануляцига тучных клеток (Yamashita, Saito,1989), увеличивать проницаемость сосудов (Ranadive,Cochrane, 1968) и стимулировать их рост (.Кудряшов и др, 1989), воздействовать на-Са++ каналы L-типа на мембранах энтероцитов (MacLeod et al. ,1991), а также ингибировать индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников крыс in vitro (Zhu et al. ,1988). Основной функцией дефенсинов большинство ученых считает их универсальную антимикробную активность, за которую их назвали "антибиотиками -тавотного происхождения" (.Кокряков, 1988, Lehrer et al. , 1991). Дефенсиноподобные белки обнаружены в гемолимфе насекомых (Lambert et al, 1989). Это свидетельствует о том, что такие соединения могут являться одними из древнейших факторов защиты
-4-.
организма от инфекционных агентов. Поэтому поиск и сравнительно- биохимический анализ дефенсинов и подобных им пептидов в фагоцитах животных разных видов, классов и даже типов может дать информацию, существенную для понимания путей эволюции факторов неспецифической резистентности.
Особого внимания заслуживает и.установленная пока только in vitro способность дефенсинов ингибировать стимулированную АКТГ продукцию кортикостероидов клетками надпочечников крыс (Zhu et al. ,1987,1988). Авторы назвали это свойство пептидов кортикостатической активностью и предположили, что дефенсины могут, быть включены в число соединений, участвующих бо взаиыо--действиях между гйпоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной системами (Bateman at al, 1989). Однако на уровне целостного организма способность эндогенных или экзогенных дефенсинов влиять на стероидогенез не показана, . нет данных и об их эффектах в условиях активации глюкокортикоидной реакции при стрессе, хотя эти данные могли бы оказаться немаловажными для объяснения известного феномена нейтрофилеза, наблюдаемого при стрессорных воздействиях,- биологический смысл которого до сих пор полностью не ясен.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании'физико-химических и функциональных свойств катионных полипептидов из лейкоцитов свиньи ( протегринов ) и дефенсинов из нейтрофильных гранулоцигов кролика, крысы и человека.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить высокоочищенные индивидуальные фракции полипептидов из лейкоцитов свиньи СпротегриноБ; и дефенсинов человека, кролика и крысы.
-
Исследовать физико-химические свойства протегринов (хрома-тографические и электрофоретические свойства, молекулярную массу и структурные особенности ).
-
Провести сравнительный анализ антимикробной активности протегринов и дефенсинов человека и кролика.
-
Изучить влияние суммарных препаратов и индивидуальных фракций дефенсинов и протегринов на стимулированное введением АКТГ повышение уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных.
: 5 '-
-
Исследовать влияние экзогенных дефенсинов на характер глюкокортикоидной реакции при стрессе.
-
Изучить эффекты введения дефенсинов на показатели гуморального иммунного ответа при сгресс-индуцированной иммуносуп-рессии.
Научная новизна. Открыт новый класс ранее неизвестных полипептидов из лейкоцитов свиньи - прогегринов (PG-1, PG-2 и
PG-3), осуществлен анализ ряда их физико-химических свойств {изучены хроматографические " и электрофоретические характеристики, определен молекулярный вес, аминокислотный СОСТЗЕ). Установлено, что эти полепептиды имеют не только ряд структурных особенностей, сближающих их с дефенсинами, но и по-видимому, являются их функциональными аналогами' - показана их бысо-
кая антимикробная активность, а также наличие кортикостати-ческих свойств у протегрина PG-3/
Впервые в условиях целостного организма установлено, что экзогенные дефенсины и протегрины способны снижать повышенный после инъекции АКТГ уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных.
Впервые показано, что предварительное введение дефенсинов животным предотвращает ингйбирующий эффект стрессорных воздействий на некоторые показатели гуморального иммунного ответа.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты сравнительного анализа структурных и функциональных свойств протегринов и дефенсинов могут внести свой вклад в развитие представлений о путях эволюции молекулярных механизмов неспецифической резистентности.
Сочетание высокой микробоцидной активности и относительно простой структуры, позволяющей производить химический синтез протегринов, открывает перспективы создания новых антимикробных лекарственных препаратов на основе этих соединений.
Установленная способность экзогенных дефенсиноБ влиять на уровень кортикостерона в крови экспериментальных животных в условиях активации глюкокортикоидной функции надпочечников свидетельствует в пользу гипотетического представления о де-фенсинах как об участниках взаимодействия между нейроэндок-ринной и иммунной системами, а также дает основание рассматривать дефенсины и протегрины как потенциальные стресс-лимитирую-щие агенты.
- .6' -Данные об отмене дефёнсинами стресс-индуцированной имму-посупрессии могли бы оказаться полезными при' разработке препаратов для клинического использования в случаях нарушения деятельности иммунной системы, вызванных тяжелыми стрессорными воздействиями.
Основные положения выносимые на зашиту:
-
Использованные препаративные методы выделения дефенси-нов и протегринов из лейкоцитарной массы позволяют получить высокоочищенные индивидуальное фракции этих полипептидов.
-
Из лейкоцитов свиньи получены три гомологичных полипептида с молекулярной массой около 2 тыс. Л, получивших название' протегрины, представляющих собой новую группу полипептидов, сочетающих в своей структуре черты дёфенсинов С значительное содержание основных аминокислот, в том числе аргинина, и, следовательно, высокий положительный заряд, а также наличие идентичных участков в молекулах дёфенсинов и протегринов; и антимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезина.
-
Протегрины проявляют микробоцидную активность против грамлололительных, грамотрицательных бактерий и грибков, сравнимую с активностью дёфенсинов кролика.
-
Экзогенные дефенсины и протегрины снижают' повышенный после введения АКТГ или стрессорного воздействия уровень кор-тикостерона в крови у крыс и мышей.
-
Введение дёфенсинов предотвращает стресс-индуцированную иммуносупрессию у экспериментальных животных.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании научной конференции-' Отдела общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института экспериментальной медицины РАМН С г. Санкт-Петербург; 3 ноября 1994г.
Основные положения диссертации были представлены на Санкт-Петербургской конференции молодых ученых и специалистов "Механизмы физиологических функций",1992 г. , 2 International Gongress ISNIM, Paestum (Italy), 1993 г., конференции "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний", Санкт-Петербург, 1993, конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию АМН, Москва, 1994.
По теме диссертации опубликовано 14 работ.
- 7'-
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы ' С шесть глав), материалов и методов, s глав собственных исследований, общего заключения, выводов. В диссертации 9 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемый список литературы содержит 220 наименований.