Введение к работе
Актуальность теми. В биохимии белков зерна злаков ведущая роль всегда принадлежала исследованиям, связанным с проблемами качества урожая: (Кретович, 1958, 1973, 1981; Козьми-ка, 1959; ]&ягиничев, 1959; Вакар, 1961; Пено и др., 1968). Такая, направленность вполне объяснима» поскольку средя злаков основными объектами чалю всего являются рис, пшеница, рожь, .ячмень, овео п кукуруза, зерно которых служит главным источником пищевого балка. Большинство других злаков дают очень мелкие семена* не имеющие пищевой пли кормовой ценности. Главным образом поэтому биохимия белков семян многих культурных и дикорастущих'алаков, например, кормовых злаковых трав разработана очень слабо пли совсем не разработана.
В последние десятилетия белки семян злаков привлекают внимание биохимиков в связи с перспективами использования ах ' как биохимических маркеров для решения различных теоретических я практических задач прикладной ботаники, генетики и селекции»
В настоящее время можно выделить два основных направления, по которым эти исследования развиваются наиболее успеш- . но. Одно из них - щдантификацпя и регистрация генетических ресурсов пшеницы и ее ближайших сородичей ло спектрам прода-мина (Конарев и др., 1970; Созинов и др., 1973; Конарев, 1980, 1983; Созявов, 1985; Autran and 3ourd«t , 1975). Другое направление - решение проблемы происхождения геномов полиплоидных пшениц и выявление геномных отношений пшениц й их дикими сородичами. Значительные успехи достигнуты здесь Ала-годаря использованию в качестве фалогенегичеолих маркеров неглиадиковкх белков спирторастворимои фракции семян (Конарев и др., 1970, I97S; Johnson-, 1969, 1972, 1975).
Вопросы родства видов, идентификации и регистрации сортов, биотипов и популяций - узловые для современной селекции, в основе которой - использование всего разнообразия ресурсов . культурных растений и их диких сородичей. Они актуальны, как для зерновых, так и для всех других возделываемых злоков, в том .чи~ле, кормовых и пастбвщшх злаковых трав - представителей триб овсовнх, тимофеевковых и мягликовых. В последние года интерес к этим культурам в нфіей стране?івд&р?$<ЖЙРязя
имечи К.А- Тичир^сиз
ЦНБ имени Н.И. ??^лезновг
Фонд научнн&литературы
тасг
о необходимостью создания прочной кормовой базы для яшвотно-' водства.
Прогресс в использовании современных биохимических я V-0-лекудярно-биологическнх подходов к изучению ресурсов злаков одерживается из-за водоотаточной изученности белкоз их седан. Так» к настоящему времена сравнительно хорош исследованы лишь прояамины пшеницы, ржи, ячменя и кукурузы, йгабо изучены проламиш овса, риса и проеовидиых и практически по изучены »ти белки у других злаков, Что касается природа непроламиш-вих белков сдиргораотворимой фракции, вклкгаающих видоспаци-фичнве антигены, то она оставалась неясной даже у пшенлцн.
Цель нашей работы - изучить белки семян видов злаков для ефективного использования их в генетическом и филогенетическом анализе этих растений д освоения реетрсов семейства Роа-oeae Bamh. как исходного материала для селекции.
Научная новпзна, и рпакгитеская значимость. Выявлены и охарактеризованы видо-(геномио-)спецп$ігчіша белки.- антигены семян пшеницевых, обосновано использование их в идентификации геномов и геномной анализе полиплоидных злаков; во фракции альбуминов вдентифицировани л охарактеризована как антигены ингибитор " ос-амилаз - альбумин 0,19 и "специфический альбумин" мягкой пшенинд, по ісотороілу в иммунохимическах реакциях отличаются ее балки от таковых твердой шегшцы. Показана возможность использования этих белков в оценке степени родства между видами в пределах грибы пшеницевых. Выяснен компонентный состав пролашщов и сопутствующих им белков сплртораотво-ршой фракции семян представителей основных триб злаков. Изучены свойства проламинов представителей трибы мятликовых. Обнаружена в охарактеризована новая группа проламинов — быстрые проламикы (Шї, характерные )^ія представителей ряда триб злаков, но отсутствующие у пшеницевых. Изучен полиморфизм прола-мнноя представителей трибы мятликовых. Получены показатель- ' отва в пользу родства проламинов (проламшювых генов) шпени-цевше, овсовых и мятликовых. Предложены номенклатура л единый эталонный спектр злектрофоретических компонентов дроламина, позволяющий записывать в виде белковых (проламииовых) формул сорта и биотипы всех видов семейства злаков.
В хода изучения природы и свойств видо-<геяомио-)спеця-фичных белков антигенов приготовлены выоокоспецифичные вммун-4
ныв сыворотки ла ати белки, обеспечивающие более надежную идонткфшщию генома. В результате изучения антигенного со-отаса геншносдецифичных белков оемяв и альбуминов кнгиСито-pos « -атдшаз получены новые давние о родстве и происхождении геномов ВИДОВ Tritlcum , Elytrigia , Elymue , Asropyron. Leymus , Loiiuat и Festuca . Показана высокая эффективность использования таких иммунных сывороток для определения геномного состава искусственно получаемых амфпдиплопдов. Разрабо- . тана методика посемейного анализа компонентного состава про-л&'лкяов келкоешяшшх злаков, что дает возможность анализировать сортовыэ, природные и гибридіше популяции злакових трав. На основе изучения компонентного оостава пролшашов злаков существующий эталонный алектрофоретический спектр глиадина дополи-ц пегчэдкяш быстрых проламинов. Номенклатура и единый эталоне! электрофоретпческий спектр пролашшов,* предложенный в результате сравнительного изучения их у разных видов, родов и триб злаков, когут быть использованы как основа для разработки единой системы регистрации и документации генетических ресурсов семейства
Апгобагеїя работы. Материалы диссертации были доложены: на П Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), ЇП Мевдуна-РОД.ЮМ ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Всесоюзных созезалпях "Белковые маркеры и их использование в решении проблем прикладной ботаника, генетики и селекции'! (Ленинград, 1Э78, 1983), Всесоюзных совещаниях по хемосистематшге и эволюционной бирхьлаи высших растений (Ялта, І979, 1982; Москва, I9SS), Советско-Французских симпозиумах по биохимии и генетике белков.зерпа пшеницы (Одесса, 1977; Ленинград, 1983), 62-* ежегодном съезде американской ассоциации химиков злаков (Сан-Оранцаско, 1977), Всесоюзном совещании "Актуальные задачи физиологии и биохимии растений в ботанических садах'ЧЗвенигород, 1984).'
Публииаокк.. По материалам диссертации опубликовано 45 работ.
Структура, п объем работы, диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендации и списка цитированной литературе (385 наименовании на русском и иностранных языках). Работа изложена на 317 страницах машинописного текста,
включающих 53 рисунка и 16 таблиц. В обзоре литературы дана краткая характеристика семейства злаков, а таюш предотавлены сведения о белках семян и их использовании в изучении родства видов и внутривидового полиморфизма злаков.
Материалом дай проведения исследований послужили семена около 1000 образцов приблизительно 300 видов семейства злаков. Семена получали из коллекции НИШ растениеводства им.Н.И.Ва-вллова, Главного ботанического сада ЛІІ СССР,' университета штата Юга (США), других учреждений, а такяаэ от отдельншс отечественных и зарубежных исследователей.
Вндолаїша болкоа семян. Белки аз семян злаков экстрагировали: ЇМ Насі на фосфатном буфере рй 7,0 для получения алвбумино-глобулиновой фракции <АГФ), 70ДГ этанолом для получения спиртораствортюй фракции (СО), 0,2$ Гаон для получения глютелиновой фракции, 2М мочевиной для получения АГФ и СФ (Гаврилюк и др., 1973).
Цолучениа иммунных сывороток. Использовала схему иммуни-зации, принятую в ВИРб (Гаврилш и др., 1973}. Іфоликов ffiw-низировали суммарными препаратами АГФ, Сф или глютелшов, а также фракциями или компонентами, полученными хроматографией, препаративным электрофорезом пли иммунной аффинной хроматографией. Для поддержания необходимой концентрации антител животному через 20-30 дней дополнительно вводили антиген. В ходе работы было получено более 250 иммунных сывороток на белки семян злаков.
Имцунохшичеокив методы. ІІюдунохимический анализ белков семян проводили в основном методом двойной шллукодиффузии в геле (Ouohterlony , 1950) а иикромодафикацин, предложенной Гуоевым и Цветковым (Цветков, 1961; Гусев, 1968), Использовали 1$ раствор агар-агарозы или 0,8$ раствор агарозы ва мвди-нал-цитратном или трис-барбитуратном буфере рН 8,6. Имгдуно-элекгрофореэ проводили в геле 1% агарозы на предметных стеклах размером 5 х 5 см с использованием одного из упомянутых выше буферов. Электрофорез вели в течение 3 часов 15 минут при аиле тока 45 мА и напряжении 4В/ом. Для количественного 6
. определения антигена проводили ракетный (количботвеїший) ам-муноэлеятрофореэ (Laurell , І966) * Длительность иммуноэлек-трофореза 4 чаоа 40 минут при 4В/ом.
Антигенные овоаотва гетерогенного белка изучали следующим образом. После электрофореза гели ДАЛ инкубировали в трис-барбгтуратном буфере рП 8,6 в течение 60-90 шнут. Далее гель заплатили в агарозу на предметном отекло и проводили двойную шмутгодиффузию.
Сиворотки, которые в двойной -датогнодяффузии давали о суммарным препаратом белка одну лшшю преципитации, получали Евдуниэацией соответотвушим препаратом Селка или истощенной, При постановке реакции двойной иммунодиффуэии чаще всего пояьтэовалыоь методом истощения в бороздке, предложеннш Кло-оом (Барасашвили и др., 1979). Истощение шмунгавс сывороток проводзыш также обычным опоообом, т.е. в раствора. . . '
Для очистки антител сыворотку при необходимости предва-» рителыю потодали,- а затом отделяли ШАмгуноглобулины типа iga от воох ооталышх белков сыворотки крови бееколонотаым методом на ДЕАЕ-сефадеков. Очищенные иммуноглобулины использовали для приготовления кмкуносорбента для иммунной аффинной хроматографии, .
При приготовлении иммунооорвента иопольэовали оефарозу, активировшшую бромистим цианом производства фирмы " РЬапш-сія Fine Chemicals ", а также сефароэу 4В,активированную в лабораторных условиях (Туркова, I960; Оотермаи, 198Э). "Бодки элюировали о колонки ОД М укоусной кислотой.* Раотвор концентрировали на роторном испарителе или электродиалиаом,. Использовали также имыупооорбент, приготовленный на основе ультро- геля, активированного глютаральдегидош. Иммунооорбент готовили по прописям методик (Туркова, I960; Оотврман, 1963). Элю-цию антигена проводили 0,2 М гдицин-ИС1-буфером, рН 2,9.
фракционирование белков методами зтоматограйт. эдекттю-
йооеза и изоэдектричеокого Йокуоировадид. Для фракционирова
ния белков СФ семян злаков использовали геогь-фильтрашго через
оефадекс а-100 .Колонка 3 х 100 см, буфер ОД М уксусная
кислота { oimtrboanler , 1971). Фракционирование альбуминов
ілягкоР пшеницы проводили следующий образои.' Фракцию водо-ооле-
растворимых белков получали экстракцией иэ муки фосфатным Оу-
'-:: . 7
. фврои рН 6,6 (К*НгЮ4 - 0,025 М, К;НР04 - 0,041 Mf N»01 - .
- 0,48 М), Альбумины осаздали из экстракта сульфатом аммония в пределах концентрации последнего 0,93-1,33 М, Получешна осадок диализовали против воды при +4С. Голь-фильтрацию альбуминов осуществляли через сефадоко g-юо в колонке раз- мером 3 х 100 ом. Попользовали фосфатний буфер рп 6,6 приведенного выше'состава (silano «t ai. , 1Э73). Для очистки фракций и компонентов ос - ад -проламинов и бштрьсс проламя-нов злаков использовали методику ионообменной хроматографии Еа сульфопропил-сефадексе С-50 ( Charbonnier and Новее, 1980).
Электрофорез проламинов в трубках проводили по принятой в БИРв методике (ГаврилвК и др., 1973). Голевая система содержала 7,5/Е акриламида, 30$ укоусноЗ кислоти и 5М мочевину. Цуфер 0,013 М уксусная кислота, рН 3,2. Время электрофореза 5 часов 30 мин. Для получения спектров белков СО семян злаков, включающих компоненты кепроламиновых белков, время электрофореза сокращали до Z часов 15 мин. Белковые зоны окрашивали 0,2-0,3? амидовш черным, приготовленным на 7,5% уксусной кислоте или фиксировали в растворе 7-I3JS ТХУ. Злектрофо-ретический анализ альбуминов семян злаков проводили по методу Орнштейна и Девпса (Ornsteln , 1964; Dayie , 1964), Для определения относительной молекулярной мзсоы белков проводили
вЛЙКтрофОрвЗ В ПААГ О ES-Ha ПО ЫеТОДШСе ДеШДЛВ (baemmll ,
1970). Для исследования свойотв отдельных электрофоретаческих, компонентов белки извлекали из геля по описанному способу (Кенаров, 1974).
Электрофорез проламинов шлкооемянных злаков проводили в вертикальной пластино ПЛАТ в приборе производства экспериментальной лаборатории "Хийу Калур" (г.Таллин). Толщина геля 1мм. Гель готовили по прописи методики для разделения глиадина (Гаврилок и др., 1973), но содержание уксусной кислоты в геле умешдіали до 5$. Семена елей, плевела, овояницн растирали в ячейках 4x6 мм, высверленных в дисках из орготекла, Прола-микы извлекали 60$ (для ежа) иди 70 этанолом при комнатной температуре. Холичеотво зкотрагента на зерновку - 25-35 мкл. Пробы'утяделяли раствором 10 и мочевины, центрифугировали и полноотью наносили на гель, Электрофорез проламинов'овояши и плевелов вели 3,6-4 часа при 10 мАна пластиду геля в течение 'первого часа и ЗО мі в оставшееся время. Валковые зоны фикси-0
ровали и окрашивали раствором 0,75? кумасси а-250,, приготовг-леннш на 3,5^ хлорной кислоте (Остерман, 1983).
Изоэлектрическое фокусирование белков проводили в труб
ках (Wrigley and Shepherd , 1973) и в шгаотше ПААГ в прибо
ре "Multiphor ", согласно руководству, выпущенному фирмой ЛКБ
(Winter et лі, , 1977). >
- Выявление ингибиторов протеаз в препаратах проламина осуществляли по методу, предложенному Ад.Конаревым (Конарев, 1985, 1988). .
'Анализ аминокислотного состава белков проведен в отделе молекулярной биологии ВИР (З.В.Чиелева), определение и -кон-цевга: аминокислотных, последовательностей - в Институте моле-куляряоя биологии АН СССР (С.В.Н1ияпников).