Введение к работе
'
Актуальность проблемы. Нивые организмы характеризуются
функционированием сложных метаболических систем, обеспечи
вающих нормальный ход физиологических процессов. Основу ме
таболических систем составляют ферменты, исследованию кото
рых уделяется огромное внимание. Последнее, однако, харак
терно в большей степени для животных организмов. Lie яду тем
обмен веществ растительных организмов существенно отличает
ся от тавотных. В частности, общеизвестно, что растительные
клетки содержат вакуоли, являющиеся вместилищем разнообраз
ных органичесзсих кислот и некоторых Ферментов, отсутствую
щих в ЖИВОТНЫХ Клетках ( Boiler, WLemken, 1986 ),
Несмотря на большие успехи, достигнутые в последние годы в изучении ферментов, ферменты ЦТК и глиоксилатного цикла растений, участвующие в образовании трикарбоновых кислот - цитратсинтаза (ЦС) и аконитатгидратаза (АГ) были изучены в очень слабой степени. Что же касается обмена транс-аконитовой кислоты в растениях, то этот вопрос еще не был изучен и фермент аконитатизомераза (АИ), участвующий во взаимопревращении цис- и транс-аконитатов, был обнаружен лишь в бактериях ( Rao, Altekar, I96I ). ВОПрОС О МеТЗбОЛИЗМе ОК-
силимонной кислоты, найденной в растениях-, до наших работ был очень не ясен (ІІ'ипарєв, Солдатенков, 1972).
Известно, что органические кислоты в растениях являются связующим звеном как в биосиитетических, так и катаболичес-ких реакциях. Метаболизм органических кислот в растениях тесно связан с обменом аминокислот и процессом глюконеогене-за, выступая в качества их субстратов и регуляторов ( Nishi-mura, Beevers, 1974 ). Именно эта значимость процессов обмена трикарбоновых кислот в растениях и побудила нас исследовать ферменты, участвующие в этих реакциях.
Цель и задачи исследования. Основной целью начгей работы явилось изучение свойств ферментов, участвующих в метаболизме цитрата, цис- и транс-аконитатов, ацетил-КоА и окепцпт-рата, а такяе механизмов их регуляции у высотах растений.
Исходя из цели работы нами бнли поставлены следугавде задачиї
I. Выделить и получить в'гомогенном пли внеокоочипенном состоянии ЦС, АГ, ЛИ.п'-'етил-КоА-гплролпзу (АпГ) из высших ра-
стеїгай. Изучить их физико-химические и кинетические свойства.
-
Исследовать внутриклеточную локализацию этих ферментов и наличие их мнохсественных молекулярних форм.
-
Изучить распространеіше и динамику изменения активности ЦС, АцГ, АГ и АН в онтогенезе различных растений.
-
Исследовать возможность индуцированного синтеза ЦС, АГ и АН в растениях под действием эндогенных органических кислот.
-
Изучить воздействие некоторых факторов внешней среди на активность ЦС, АГ, АН и АцГ.
-
Вияснить пути обмена оксилимонной кислоти в кивых организмах.
Научная нолизна работы. 3 результате проведенных исследований разработан способ получения в гомогенном состоянии ЦС из кенафа и изучены ее физико-химические свойства. Впервые получены в галогенном состоянии АГ и АцГ из растений и также изучены их физико-химические и кинетические свойства. Показано присутствие АН в растениях и исследоваїш физико-химические и кинетические свойства,частично очищенной АН из кукурузы.
Изучена внутриклеточная локализация ЦС, АцГ, АГ и ЛИ в растениях. Показано, что ЦС локализована как в митохондриях, так'и глиоксисомах. АГ находится в основном в цитоплазме, небольшая активность обнаружена в митохондриях и глиоксисомах. Основная часть АцГ и АИ локализована в цитоплазме, небольшая активность найдена в митохондриях.
Для АГ впервые показано, что физико-химические и каталитические свойства ыитохондриальной аконитазы заметно отличаются от свойств этого фермента из цитоплазмы в глиокси-сом. В то же время обнаружено значительное сходство свойств АГ из цитоплазмы и глиоксисом.
С помощью модифицированных нами методов специфического проявления ЦС, АцГ и АГ в гелях после электрофореза впервые показано присутствие мноне стенных молекулярных форм этих ферментов в высших растениях.. Получены в частично очищенном состоянии молекулярные формы АцГ и ЦС из катрана и кенафа, соответственно, и изучены их свойства.
В результате на:чей работы отмерит йоги:й фермент - окси-цитратдогііцратаза(докарбоксилиру.зщая)(ОД), участвующая в
обмене оксицитрата в бактериях. Показано присутствие этого фермента в кенафе. Произведена частичная очистка ОД из бактерий и изучены ее некоторые свойства.
Распространение ЦС, АцГ, АГ и АИ изучено в более чем 50 видах растений. Обнаружено, что ЛцГ присутствует у всех изученных растений, что говорит о возможности регуляции ЦС, а следовательно, и ЦТК, на ферментативном уровне. -С помощью разработанных нами методов показано, что АИ присутствует у тех растений, которые способны накапливать аконитовую кислоту. Изучено изменение активностей вышеупомянутых ферментов как при прорастании целого ряда семян растений, так и в ходе их онтогенеза;
Впервые изучены активные центри ЦС, АцГ, АГ и АИ из высших растений. Для ЦС обнаружено, что в каталитическом синтезе цитрата участвуют одна молекула лизина и одна молекула аргинина. На примере АцГ ячменя впервые показано наличие в активном центре фермента одного остатка триптофана. Дня АГ из растений, в отличие от АГ из других источников, показано отсутствие цистєина в активном центре молекулы, а также присутствие в нем одной молекулы аргигина. В активном центре АИ обнаружено присутствие одной молекулы гнстндшіа.
Впервые для внспих растений обнаружено, что при выращивании семян подсолнечника на растворах ацетата и цитрата в его семядолях происходит индуцированный синтез АГ. При выращивании проростков ячменя на растворе транс-аконитата в' них происходит индуцированный синтез фермента АИ. Дня АГ показано, что эта индукция происходит в глиоксисомальной и цитоплазматической йракцнях клеток. Индуцированныйсинтез этих ферментов происходит на 60s рибосомах клетки.
Обнаружено, что при выращивании растений на свету в них происходило снижение активностей АцГ, АГ и АИ по сравнеотю с темповыми условиями. Для А" найдено, что свет ускорял метаболизм транс-аконитовой кислоты з зеленых проростках кукурузы и тормозил этот процесс з этиолированных проростках, причем действие синего света было болое эффектш-нш, чем красного. Дтптелъная гппегеня (до 2 дней) подавляла активность ЦС, АцГ и АГ з ру.стенпях, причем СОо-агмосТіера оказывала гораздо более іп!"::б;ту'Л"ег дпГстзне на эти "ермопты, чем атмосфера азота .' г-~<р.
На основании полученных данных в настоящей работе предложена схема обмена трикарбоновых кислот и ферментов этого метаболизма в растительной клетке.
Практическая ценность работы. Полученные в диссертационной работе данные дают нам возможность гонять, как организован обмен трикарбоновых кислот.как в целой растительной клетке, так и в ее компартментах. Результаты наших исследований позволяют объяснить процессы метаболизма транс-аконитата и ' оксицитрата в растениях. Полученные результаты указывают на тесную взаимосвязь ЦС и АцГ в растениях, что имеет большое значение'для регуляции'ЦТК в растениях.
Открытие нового фермента - -ОД имеет очень большое значение для.объяснения некоторых сторон обмена оксицитрата в природе. Разработан способ определения активности этого фермента.
Модифицированы и сделаны пригодными для высших растений методы определения активности АГ и методы специфического проявления изоформ ЦС, АцГ, АГ в гелях, на которые получены 4 рационализаторских предложения. Разработаны два метода определения активности АИ: первый - радиометрический и второй-спектрофотометрический. Разработан способ получения НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), на который получено авторское свидетельство (А.с, ЖЕ205929, 1986 г.).
Выявленные в работе закономерности регуляции активности ЦС,.АГ, АцГ и АИ-являются теоретической основой для понимания механизмов адаптации растений к различным экологическим факторам* таким как газовый состав атмосферы и освещение. Подучены принципиально новые данные, показывающие возможность индукции з растениях АГ и АИ.
В ходе работы получил дальнейшую разработку метод аффин-но-элюционной хроматографии ферлеитов, который позволяет получить гомогенные ферменты из растений и с достаточно большим выходом...,'..
Основные положения диссертации, вннооимые на защиту.
1, В растениях, накапливающих транс-аконитовую кислоту,
присутствует фермент АИ, участвующий в ее метаболизме, при
чем этот фермент находится как в цитоплазме, так и в мито-
хонлриях.
2. ЦС локализована как и глкокаісо^ах,так. и в митохонд-
риях, а аконитатгидратаза обнаружена кроме того и в цитоплазме. Множественные формы АГ и ЦС в глиоксисомах и митохондриях значительно отличаются по своим свойства!.!.
-
По своему строению активные центры растительных ЦС.АГ и АцГ имеют как определенные сходства с. активними центрами ферментов из других источников, так и существенные различия.'
-
АцГ растений является мультифункциональньм ферментом, одной из ватаейллх функций которой является ее участие в ре- . гуляции ЦС, а следовательно, и ЦТК.
-
Освещение несколько укеньпает (на 10-20$) активность ферментов АГ, АцГ я АИ и не влияет на активность ЦС, что говорит о достаточно высокой степени функционирования ЦТК на свету.
Апробация работы. Материалы, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, докладывались и обсукдались на Ш Всесоюзном биохимическом съезде (Рига,'1974), на 17 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Алла-Ата,1978), на Всесоюзной конференции "Проблемы изучения и использования в народном хозяйстве растений природной флоры (Москва,1979), на П Всесоюзной межуниверситетской конференции молодих ученых (Тбилиси,I960), на УІ Всесоюзной" конференции по фотоэнергетике растений (Львов,I960), на УТ Объединенном симпозиуме биохікяческих обществ СССР и ГДР (Таллин,1961), на Всесоюзно!! конференции "Проблемы и пути повышения устойчивости растений к экстремальным условиям среды в свете задач селекции" (Ленинград,1981), на Всесоюзной конференции "Проблемы физиологии и биохимии древесных растений" (Красноярск,1982), на Ml и ХІУ конференциях молодых ученых биологического факультета Московского государственного университета (Москва,1982, 1984), на Всесоюзно;'! конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урояайности" (Львов,1984), на 1-ом Всесоюзном совещании "Актуальные-задачи физиологии и биохимии растений в ботанических садах СССР" (Пущино,1984), на У Всесоюзном биохимическом съезде'(Москва,1936), на УІ Всесоюзной кон-фюренции по применению ионообменных материалов в промігаленног-сти и аналитической химии (Зоронєж,І986), на .Всесоюзной конференции "Применение биотехнологии в народном хозяйстве" (Уфа, 1987), на УШ делегатском съезде Всесоюзного' ботанического общества ( Алма-Ата," І988), на-7-ом Ме.гду-
народном конгрессе Европейского общества физиологии растений (Швеция,1990), на УП Всесоюзной конференции по .применению ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии (Воронеж,1991), на .111 съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург,1993).
Публикации. Материалы диссертации изложены в одной монографии и в более 60 экспериментальных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,' обзора литературы (68 с), экспериментальной части.(208 е.), заключения (15 с.),'выводов, списка литературы и приложения (54 с). Диссертация изложена на 403 страницах машинописного текста, включая список литературы, содержащий 93 отечественных и 307 иностранных наименований работ. Работа содержит 38 таблиц, 5 схем и 53 рисунка в тексте и 21 таблицу и 24 рисунка в приложении. .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы" и методы исследования
Объект исследования. Основными объектами начшх исследо
ваний СЛУЖИЛИ следующие растения: кукуруза.( Zea mays L. )
СВоронежская 76, ЯЧМеНЬ ( Hordeum sativum L. ) С.НОСОВСКИЙ 6,
ПОДСОЛНеЧНИК (telianthus animus L. ) С.ПереДОВИК, ГОрОХ
( fisum sativum L. ) С.РаМОНСКИЙ 77, Кенаф ( Hibiscus canna-
binus l. ), Кроме этих объектов в разных опытах мы использовали и другие виды растений (более 70 видов).
Семена растений были получены из Орловской опытной станции, ботанического сада ВГУ и Краснодарского Всесоюзного НИИ масличных культур.
Методы определения органических кислот, кетокислот. Сахаров и аминокислот в растениях, для этих целей растения после опытов фиксировали кипящим 96$ этанолом и подвергали ра-диохроматографическому анализу. Экстракты фракционировали на ионообменвдках и определяли аминокислоты по методу Г.С.Пас-хиной (1964), органические кислоты - по С.В.Солдатенкову и Г.А.Мазуровой (1962), углеводы - по О.А.ПавлиновоЙ (1962) и кетокислоти -.по А.А.Землянухину и А.М.Макееву (1970).
- 6- С-транс-аконитовую кислоту синтезировали из 6- С-лимонной міслоти го методу В.Брюса (1949), а 6- ^С-цис-ако-нитовую кислоту - по методу В.Умбрейта (1951). Радиоактивность образцов просчитывали с помощью установки УМФ-І500
или сциитилляционного счетчика СБС-2.
Определение активности с&ерментов. Для определения активности АГ использовали спектрофотометрический метод Бэкона ( Bacon ,1959). Активность АцГ и ЦС определяли различным методами в зависимости от условий эксперимента и целей ис- следования (srere ,1976; a-ass et ai,l980). Активность АИ определяли МеТОДОМ Клинмана И Роуза ( Kllnman, Rose; 1971 ).
Нами были ррзргбстаны несколько методов для определения активности ферментов. Для определения АГ в растениях был разработан способ определения ее активности, используя дополнительный фермент НАДФ+-ИДТ. Два новых метода были разрабо- таны для определения активности АИ. Первый метод основан на учете выделяющейся С02 при.введении в интактнке ткани растений 6- С-транс-аконитата. Второй метод, спектрофотометрический, основан на использоваїши двух дополнительных ферментов - АГ и НАДФ+-ИДТ (АГ выделяли из щитка кукурузы). Второй метод является более быстрым и специфичным по сравнению с первым методом.. Для определения активности ОД мы применили дополнительный фермент - НАД^-глутаматдегидрогеназу.
Определение белка. Содержание белка определяли по методу
ЛоурИ И Соавторов ( Loury et al, 1951 ).
Разделение клеточных органелл. Эту работу проводили методом дифференциального изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в течение 4-5 часов при 24000 об/мин на ультрацентрифуге УЦПЗ-47, ротор РКС-25.
Выращивание бактерий P. Micrococcus Бактерий, ВНДЄЛЄН-
ные нами из почвы, обладали способностью расти на оксицитра-те. Среда выращивания имела следующий состав: оксицитрат -' 10 ммоль/л, Mgso^ 6 ммоль/л, КрШ^ 1,5 ммоль/л,( мн4^4 ~ 10 ммоль/л, CaCIg 0,04 ммоль/л. Бактерии росли в колбах в термостате, при +27 в течение двух суток, затем собирались и разрушались на установке УЗДН-2Т в течение 2 мин с интенсивностью 22 кГц.
Очистка Ферментов. Выделение и очистку АцГ проводили, используя фракционирование сулъоатом аммония, ионообменную и аффинно-элгоцноннуга хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацию на сефадексах Г-25 и Г-І50. Гомогенный препарат АцГ из ячменя получили путем экстракции фермента из гелей
МеТОДОМ ОбраТНОГО -ЭЛСКТрофореза ( Braatz, Ilclntire, 1977 ).
Разделение изоформ АцГ из катрана провидили используя градиентную элюцию трис-буфером с ДЭАЭ-целлюлозы.
Выделение и очистку ЦС осуществляли с использованием субклеточного фракционирования, аффинно-элюционной хромато- графии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на сефадексах Г-25 и Г-І50.
Для выделения АГ из растений использовали фракционирование сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефадексе Т-25, вторичное высаливание сульфатом аммония и хроматографию на сефадексах Г-100 и Г-І50. При очистке АГ из кенафа и читка кукурузы применяли вместо вторичного^высаливания сульфатом аммония аффинно-элюционную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе.
Выделение и очистку АИ из колеоптилей кукурузы осуществляли путем высаливания сульфатом аммония, аффинно-элюционной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографии на сефадексах Г-25 и Г-100.
При очистке ОД из бесклеточного супернатанта высаливали этот ферлент сульфатом аммония и затем обессоливали его на сефадексе Г-25. Далее проводили ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, используя ступенчатый градиент трис-бу-фера и гель-хроматографию на сефадексе Г-100.
Определение молекулярной массы ферментов. Для определения молекулярной массы ферментов использовали метод гель-фильтрации на сефадексах Г-100 и Г-І50 (Детерлан,1970).Также применяли гель-электрофорез в присутствии додецил-сульфата ,
НатрИЯ ( Laemmly, 19?0 ).
Изучение множественных нолекулярннх фода ферментов (M$S) и определение степени чистоты (Т'ермонтннх препаратов. Электро-
фОреТИЧеСКИе ИССЛеГЮВаНИЯ ПРОВОДИЛИ ПО МеТОДУ ДЭВИСЭ ( Davis,
196 )." Специфическое' проявление форл АГ после гель-электрофореза, осуцествляли модифицированным наг.ш тетразолиевым методом при использовании субстрата цис-аконитата и вакууминфиль-трации. Специфическое окрашивание АцГ и ЦС осуществляли модифицированным нами методом Волка и соавт. ( voik et ai,
1971* ) в системе геля с линейно меняющейся концентрацией ак-, рпламидной смеси от 2 до 15# с помощью реакции образования медно-ферроцианидного осадка при сульфгидрильнои окислении
феррИІЗІШІИДа ( Trelease et al, 1974 ).
- II -
Определение продукта реакции, катализируемой Аг'Л и синтез ацотил-КоА. Для определения продукта реакции, катализируемой АцГ (из проростков ячменя), использовали радиоизотопный МеТОД (П-asa et al.,I980), ОСНОВаННЫЙ !Щ ИЗВЄСТНОЙ НИЗКОЙ
экстрактивности уксусной кислоты.серным эфиром из водных смесей по сравнению с другими кислотами. Синтез ацетил-КоА
ПРОВОДИЛИ ПО Методу СиМОНа И ШеМИНа ( Simon, Shemln, 1953 )
из коферменте А и уксусного ангидрида.
Идентификация йункционалъных групп активного центра Ферментов. Для изучения роли остатков гистядинав молекулах Ферментов ИСПОЛЬЗОВалИ ДИЭТИЛПЯрОКарбОНаТ (Fan et al., 1977 ), . ДЛЯ арГИНИНа - ДИацеТИЛ (Borders et al.,1978- ) ,длЯ серИНЭ- фе-
нилметилсульфонилйторид (chatonnet, 1985 ), для триптофана -
Н-брОМСуКЦИНЯМИД ( 1« et al.,I98I ), для ТИР03ИНЭ - ТЄТраіІИ-
трометан (Caruso et аі.,1987 ), для лизина - пиридоксаль-5*-фосфат ( BeecJcraans,i98i* ), для SH-.групп остатков цистеина -П-ЙІБ (Торчинский,1977). Количество остатков аминокислот в актизном центре рассчитнвали по методу Майлза ( mies,i978 ). Константы ионизации субстрат-езязтающих, групп в молекулах определяли по методу Диксона (1962).
Статистическая обработка результатов. Все опыты проводили не менее 3-4 раз, причем аналитические определения для ка-кдой пробы выполняли в трех повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех определений. При математической обработке использовали критерий Стыодента. Определение констант Михаэлиса, пнгибпрования и расчет термодинамических параметров осуществлял! с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов. Расчет коэффициента Хилла и рК ионизационных групп осуществляли по Диксону и Уэббу (1982).