Введение к работе
Актуальность проблеми. Основными механизмами реализации биологической активности витамина Bj (тиамина) в живых организмах считаются коферментные, регуляторные и нейротропные функции его фосфорилированных производных - ТДФ и ТТФ /Bisewanger ,1974; Cooper, Ріпсив ,1979/. Его дефицит в рационе приводит к серьёзным нарушениям со стороны нервной, сердечно-сосудистой и мышечной систем. В целях профилактики заболеваний в странах с передовыми технологиями применяется обогощение тиамином пищевых продуктов (очищенная мука, макаронные изделия) /нааа ,1988/. При сложившейся в республике ситуации значительная часть населения переходит от |>а-ционального к углеводному типу питания, что способствует развития Вт-недостаточности. Положение усугубляется приобретающим всё большие масштабы потреблением алкоголя, наркотических средств, ведущих к прогрессирующему снижения всасывания, ассимиляции и фосфори-лирования витамина /Островский,1989/.
Проблема витаминизации населения остро обозначилась после аварии на Чернобыльской АЭС. Её решение требует персональной оценки обеспеченности человека тиамином, разработки методик адекватного отражения его содержания в клетке, идентификации, очистки и научения ферментных систем, ответственных за трансформация витамина до фосфорилированных активных форм. Такая постановка вопросов связана прежде всего с обнаружившейся инактивацией ферментов обмена тиамина при ряде патологических отклонений, воздействии неблагоприятных факторов внешней среды /Спиричев, Барашнев,1977/.
Біосинтез ТДФ, как коферментной формы, катализируется Т-кинч.-
зой. В литературе отсутствуют сведения о пространственной" органі
зацій молекулы Т-кинаэы, её внутримолекулярной подвижности, взаи
мосвязи между структурой и возможностью регуляторного контроля ак
тивности глобулы при её конформационных перестройках. Нет или
очень кало данных относительно физико-химических свойств и фунщч-
оналышх групп ферлента, геометрии строения его активного центрп;
Современные методы кинетической спектроскопии, белковой химии по
зволяют решать перечисленные задачи. '
Принятые сокращения: АДГ - алкогольдогидрогеназа; ПАЛГ - подм-ікриламидішй голь; ПАЛФ - пиридоксаль-б^-фосфат; ПДК - пируватдо-трбоксилаэа; ТДФ - тиаминднфЬсфат; ТТФ - тиаыинтрифосфат; Т-киня-эа - тнамишшназа (КФ 2.7.6.2); ТДФ-кинаэа - тиаминднфосфаткинарп (КФ 2.7.4.15); ТТФ-аэа - тиаминтрифосфатаза (КФ 3.6.1.28); ТИС -2-толуидинил-6-пафталинсульфонат; Ф1{ - неорганический фосфат.
Биотрансформация тиамина до ТТФ осуществляется ТДФ-киназой. На сегодня ограничено количество работ, касающихся распросгранения локализации и свойств этого фермента, а результаты и выводы ряда авторов /Ruenwongoa, Cooper, 1977; Cooper et ol., 198?., 1983/ о синтезе ТТФ только из специфического субстрата - связанного с белком ТДФ - остаются спорными. Такая ситуация не позволяет сформули' ровать чёткие представления о процессе фосфорилкрования ТДФ, что отрицательно сказывается на наших познаниях обмена тиамина в целой, ограничивая возможности направленного использования препаратов витамина и его производных в лечебных целях.
Точная биохимическая функция ТТФ остается неясной. Имеющиеся экспериментальные данные позволяют говорить о вероятном участии ТТФ в энергетическом обеспечении нервного импульса, поскольку показано, что процессы нервной активности сопровождаются его дефос-форилированием /itokawa» Cooper ,1970,1972/. Одним из подходов к выяснению функциональной роли трифосфорного эфира является изучение ферментов гидролиза - ТТФ-аэ, специфически катализирующих расщепление макроэргической связи между /3 - и X -атомами фосфора. Понимание распределения этих ферментов, физиологических условия. необходимых для проявления их максимальной активации, и условий, приводящих к ингибированнп, могут существенным образом способствовать решению этого вопроса.
Принципиален и методический аспект оценки статуса тиамина. Не применяются в настоящее время как неадекватные способы к нтро-ля обеспеченности тиамином по концентрации пировииоградной кислоты и экскреции её с мочой, нагрузочные пробы витамином. Подвергаются обоснованной критике используемые в этих целях показатели, получаемые при регистрации ТДФ-эффекта и скоростей ТДФ-пависимцх реакций /ВоскобоеЕ 1983/, обуславливая необходимость разработки н внедрения в практику медицины метода реальной оценки статуса тиамина у широких слоев населения.
Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских тем 01860022833 "Фосфорнлированные и нефосфорилнрованиые производные витамина Вт в регуляции обмена веществ", 01900062425 "Внтаминэа-виснмые реакции, их интеграция и регуляция в основных метаболических процессах" в соответствии с решением Всесоюзной - 2.28.4 . "Биохимия животных и человека" и республиканских - "Молекулярные основы структурообразования и функций биополимеров", "Фундамен- ' тальные исследования для медицины" комплексных программ.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования за-
ключалась в идентификации, очистке и изучении ферментных сист<м синтеза и деградации активных форм витамина Bj, оценке значимости индивидуальных ферментов в функционировании организма. В соотнет-ствии с поставленной целью определены следующие задачи:
разработать методику получения аналитически чистого, стабильного препарата трифосфорного эфира тиамина - субстрата ТТФ-аз-ной реакции;
предложить микрометод определения ТДФ, включающий: выделение и стабилизацию комплекса агсоПДК и АДГ, изучение оптимальных условий связывания микроколичеств коферменте с апоформой ПДК, создание модельной системи оценки концентрации ТДФ. Адаптировать метод для измерения активностей Т-кинаэы и ТТФ-азы;
исследовать распределение Т-киназы и ТТФ-азы в органах и тканях, субклеточную локализацию ферментов;
показать реальность использования экзогенного, не связанного с белком ТДФ, в процессе фосфорилирования ТДФ-кинаэой. Оценить содержание тиамиифосфатов в гомогенатах клеток в условиях, максимально препятствующих фосфоролиэу;
получить гомогенные препараты Т-киназы, ТДФ-киназы и ТТФ-аэн;
изучить субстратную специфичность, молекулярно-кинетические параметры, структуру и внутримолекулярную подвижность, вероятнее пути регуляции активности ^зрменгов, природу взаимодействия с субстратами, кофакторами и эффекторами, формальные механизмы реакций;
в сравнительном аспекте изучить физико-химические и кинетические свойства Т-киназы пивнкх дрожжей и мозга;
определить особенности, закономерности и направленность формирования потока тиамиифосфатов в условиях Вт-авитаминоза и в процессе его коррекции.
Научная новизна. На синтезированных аффинных сорбентах, содержащих в качестве лиганда ТДФ, впервые до гомогенного состояния осуществлена очистка препаративных количеств Т-киназы, позволившая изучить её структурную организацию к физико-химические свойства. Показано, что в клетках дрожжей энзим представлен аспоциируп-[це-диссоциирующей сие змой олигомеров, на состояние равновесия которых влияют условия среды, концентрации тиамина, субстратов де-гидрогеназ с'-кетокислот, дикарбоновых кислот цикла Кребса. Индуцируемые лигандамд изменения носят временной характер и являются регуляторним (фактором скорости образования фосфатов витамина. Предложена модель организации активного центра Т-киназы, где важная роль во взаимодействии тиамина и АТФ отводится двухвалентным кати-
онам, вызывающим локальные перестройки молекулы фермента. Проведен сравнительный анализ кинетики и свойств белка пивных дрожжей 'и мозга быка.
Впервые в индивидуальном состоянии получен препарат ТДФ-кина-зы, катализирующий биосинтез трифосфорного эфира тиамина. Установлено, что белок из пивных дрожжей синтезирует ТТФ из свободного, не связанного с гипотетическим белком-носителем ТДФ, и не требует для активации процесса присутствия глюкозы. Охарактеризованы молекулярно-кинегические параметры, структура, субстратная специфичность, механизм действия фермента. Найдено, что аналогично Т-киназе ТДФ-киназа дрожжей представлена множественными формами и олигомерной структурой, подверженной аллостерическому воздействию субстратов и ионов металлов. Определён молекулярный вес субъединиц, условия обуславливающие их ассоциатипно-диссоциатишюе взаимодействие. Показана возможность регуляции активности ТДФ-кинази ЛТФ, тиамином и его аналогами.
Приведены новые данные о количественном содержании дн- и трифосфорного эфиров тиамина в клетках и культуралыюй жидкости пивных дрожжей и гепатоцитах крыс. Доказано, что принципиальная схема реакции синтеза ТТФ в дрожжах аналогична таковой в тканях млекопитающих.
Впервые предложена методика выделения электрофоретически гомо-ген эй ТТФ-азы, энзима гидролиза ТТФ. Установлено, что фермент из мозга быка состоит из одной полипептидной цепи и обладает абсолютной специфичностью к трифосфорному эфиру. Изучены его кинетические свойства, механизм действия, возможные пути регуляции в клетке, взаимодействие с субстратом. Впервые сформулировано представление о растворимой ТТФ-азе как периферическом мембранном белко и универсальной роли ТТФ ч транспорте ионов.
Доказано наличие двух взаимопревращающихся кинетических форд ТТФ-азы, характеризующихся различными активностями, сродством к субстрату и энергиями активации. Выяснено, что связывание с ферментом осуществляется за счет фосфорнокислого остатка ТТФ, а взаимодействие тиаминовой части молекулы с каталитическим участком активного центра приводит к правильной ориентации и гидролизу субстрата.. Важная роль в процессе катализа принадлежит аминогруппе пнримидинового кольца, гидрофобнь контактам и четвертичному азоту тиазола. Установлены вероятные пути регуляции скорости гидролиза і'ГФ аденозинтрифосфатом и свободными ионами Mg .
Впервые исследована активность ферментов синтеза и деградации
5 активных форм тиамина в норме, Bj-гкповктаминозных состояниях и рассмотрена роль каждой белковой молекулы в формировании внутри-, клеточного пула витамина. Определены эаконоцерности изменения и направленность потока тиаминфосфатов в условиях нарушения адаптационных и гомеостатических возможностей организма.
Научная и практическая значимость. Полученные сведения важны о расшифровке механизмов реализации биологической функции витамина Вт. Они впервые позволяют оценить процесс фосфорилирования тиамина в микроорганизмах и тканях животных в целом, связать воедино данные о структуре, динамике, физико-химических (в частности кинетических и спектрально-люминесцентных) свойствах фермен- ' тов с их каталитической активностью, выявить общие черты и особенности организации ферментных систем синтеза фосфатов Вт, показать их роль и отличия от ферментов гидролиза. Обнаруженные закономерности влияния субстратов, кофакторов и эффекторов на внутримолекулярную динамику киназ свидетельствуют о принципиальном значении локальной подвижности белковых структур в реакциях ферментативного катализа, указывают на возможные пути регуляции его в системах жизнедеятельности организма, проясняют конкретные механизмы функционирования белков. Понимание этих процессов создаёт реальные предпосылки управления системами бногрансформации витамина путем оптимизации ф :торов, определяющих гомеостаз отого соединения в клетке, а также углеводный и энергетический обмены.
К практическим выходам работы относятся: метод определения микроколичеств ТДФ, пригодный для широкого использования в клинике и лабораторной практике при биохимической диагностике Вт-недо-статочности и оценке статуса организма; методы измерения активнэ-стей ТДФ-кинаэы и ТТФ-озы - в случае выяснения поведения макромолекул при сердечно-сосудистых и неврологических отклонениях у жо-дей, моделирования заболеваний у экспериментальных животных. Способы очистки тиаминкиназ, в совокупности с выявленными оптимальными условиями функционирования in vitro , могут быть применены при разработке биотехнологическгас процессов получения минорных по концентрациям тиам.; іди- и трифосфатов. идентификация реакцлон-новпособных участков фосфорилированных форм тиамина позволяет вп-сти синтез ак-чвннх аналогов с заранее предполагаемыми свойствами;
Экономическая значимость. Способ получения и стабилизации комплекса АДГ и апоПДК, зачищенный авторским свид«іь«^г^м, даёт возможность создать коммерческие наборы реагентов оценки обеспеченности населения тиамином до и после коррекции Вт-ппитоминозтк
'состояний лекарственными препаратами. Высокоочищенные устойчивые формы Т-киназы и ТДФ-кинаэы желательно использовать в медицинской практике для проведения ферментной терапии у больных с ослабленными процессами фосфорилирования Битамина, например, при расстройствах нервной и сердечной деятельности, сахарном диабете, некоторых ацидогических состояниях. Защищенный авторским свидетельством метод синтеза ТТФ найдет применение в фармации при получении препарата пролонгированного действия, направленного на лечение заболеваний, связанных с нарушением обмена и функций ТДФ-зависимых ферментов.
Основные положения, выносимые на оадиту:
-
Методы получения аналитически чистого устойчивого препара та ТТФ; оценки обеспеченности организма тиамином по концентрации общего или свободного ТДФ; определения индивидуальных скоростей реакций биотрансформации Вт; выделения и очистки Т-киназы, ТДФ-кннаэы и ТТФ-азы до гомогенного состояния.
-
Концепция синтеза трифосфорного эфира тиамина ТДФ-киназой микроорганизмов и животных с использованием свободного, не связанного с белком, ТДФ.
-
Обоснование специфичности гидролиза трифосфорного эфира витамина Вт ТТФ-азой головного мозга и универсальной роли ТТФ в транспорте ионов. Периферическая мембранная локализация Т-киназы и Л'Ф-азы мозга.
-
Молекулярно-кинетические свойства, специфичность, ст/укту-ра и динамика ферментов биотрансформации тиамина. Влияние внешней среды (растворителя, рН, температуры), ионов металлов, субстратов и эффекторов на кинетические, спектроскопические характеристики и каталитическую активность макромолекул. Модель структурной организации, активного ?нтра Т-кинаэы.
5.>Роль индивидуальных ферментов синтеза и деградации активных форм витамина в формировании внутриклеточного пула тиашшфос-фатов ы процессе развития Bj-недостаточности и её коррекции.
Личный вклад соискателя. В диссертации изложены результаты, полученные соискателем лично и под его руководством сотрудниками лаборатории прикладной энзимологии и биотехнологии Института -Э.А.Гриценко, А.Ф.Макарчиковым, В.С.Лучко, Т.А.Лучко. Исследования структуры и внутримолекулярной динамики Т-киназы выполнены совместно с сотрудниками кафедры общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им. Я.Купалы.
Вклад соискателя в совместных публикациях заключался в опреде-
7 лении направления и постановке конкретных задач исследования, разработке методик эксперимента и расчетных моделей, непосредственном участии в выполнении измерений, проведении анализа, обоб-' щении и трактовке полученных результатов.
. Апробация основных результатов работы проведена на ІУ и У Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград,1979; Киев,1986), Всесоюзной конференции "Теоретические и практические аспекты изучения питания человека" (Москва,1980), УІ конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига,1981), УІ Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин,1981), I Всесоюзной конференции "Аффинная хроматография" (Вильнюс, 1982), Симпозиуме "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов" (Иркутск,1983), II Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков,1984), УП Международной конференции по молекулярной и клеточной регуляции ферментативной активности (ГДР, Халле,198б), III и ІУ Всесоюзных конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Пущино,1985; Ташкент,1988), I Всесоюзной конференции "Проблемы микробного синтеза витаминов н их производных" (Ташкент, 1990), XX конференции ФЕЕО (Венгрия, Болотон,І990), ІУ Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Англия, йорк,І99І), I Международно конгрессе "Витамины и биофакторы в жизни науки" (Япония, Кобе,І99І), ІУ Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспече-ние" (Москва,1992), 1У Международной конференции по использованию лазерной спектроскопии в жизни науки (Финляндия, Ювескуле,1992), ХХХХІУ Питсбургской конференции (США, Георгия,1993), I съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск,1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 работ, в том числе 2 совместные монографии, 24 статьи; получено 3 авторских свидетельства СССР.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, семи глав (5 глав - собственно исследования), эг .точения, выводов к библиографии (389 источника, в том числе 93 отечественных и 296 иностранных авторов). Работа изложена на 310 страницах машинописного текста, включая <\1 страницу списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 47 таблицами и 102 рисунками, общим объёмом 81 страница.