Фермент плацентарная щелочная фосфатаза в оценке и экспериментальной терапии плацентарной недостаточности и синдрома задержки развития плода Ямпольская Ирина Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Современные аспекты этиологии, патогенеза и диагностики фетоплацентарной недостаточности 12

1.2. Значение эмбриоспецифических и плацентарных белков в развитии нормальной и осложнённой ПН и СЗРП беременности 26

Глава 2. Материал и методы исследования 45

2.1. Клиническая характеристика обследованных групп беременных 45

2.2. Методы инструментального исследования 48

2.3. Экспериментальные методы исследования 50

2.4. Материал и методы лабораторного исследования 51

2.5. Методы выделения, очистки и идентификации белков 53

2.6. Методы статистического анализа 56

Глава 3. Характеристика, выделение и очистка щелочной фосфатазы из плаценты человека и крысы и конструирование иммунохимического теста на плацентарную щелочную фосфатазу 57

3.1. Физико-химическая и хроматографическая характеристика щелочной фосфатазы из плаценты человека и крысы 57

3.2. Разработка технологии получения препарата ПЩФ из экстракта плаценты человека и крысы 61

3.3. Характеристика очищенных препаратов ПЩФ человека и крысы 67

3.4. Характеристика иммунохимического теста на ПЩФ человека 68

Глава 4. Плацентарная щелочная фосфатаза, ферритин, альфа-фетопротеин и аутоантитела к плацентарной щелочной фосфатазе в сыворотках крови женщин с нормальной и осложненной плацентарной недостаточностью и синдромом задержки развития плода 70

4.1. Содержание и активность фермента ПЩФ в сыворотках крови женщин с нормальным и осложненным ФПН течением беременности 72

4.2. Содержание ферритина и АФП в сыворотках крови женщин с нормальным и осложненным ФПН течением беременности 90

4.3. Поиск аутоантител к ПЩФ, ферритину и другим плацентарным белкам в сыворотках крови женщин с нормальным и осложненным ПН и ЗРП течением беременности 107

Глава 5. Плацентарная щелочная фосфатаза в экспериментах по моделированию фето-плацентарной недостаточности 115

5.1. Разработка на крысах аутоиммунной модели ФПН 115

5.2. Влияние экстрактов плаценты крысы и ПЩФ человека на экспериментальную аутоиммунную ФПН 120

Глава 6. Обсуждение полученных результатов 123

Заключение 136

Выводы 138

Практические рекомендации 139

Перспективы дальнейшей разработки темы 140

Список сокращений 141

Список литературы

• Значение эмбриоспецифических и плацентарных белков в развитии нормальной и осложнённой ПН и СЗРП беременности
• Материал и методы лабораторного исследования
• Разработка технологии получения препарата ПЩФ из экстракта плаценты человека и крысы
• Содержание ферритина и АФП в сыворотках крови женщин с нормальным и осложненным ФПН течением беременности

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Оценка состояния системы мать-плацента-плод остается весьма актуальной проблемой современного акушерства и перинатологии (Савельева Г.М., 2006; Стрижаков А.Н. и соавт., 2012). Из отечественной литературы следует, что в акушерской практике частота встречаемости фето-плацентарной недостаточности (ФПН) колеблется от 10 до 24 % (Макаров О.В. и соавт., 2003; Сидорова И.С., 2007; Гужвина Е.Н., 2013), а синдрома задержки развития плода (СЗРП) – от 4 до 17 % (Серов В.Н. и соавт., 2010). При этом перинатальная смертность при СЗРП в 10 раз превышает среднестатистические показатели (Кулаков В.И., Барашнева Ю.И., 2006).

Еще до макрозадержки развития плода, к первым ранним проявлениями СЗРП относятся нарушения кровообращения в фето-плацентарном комплексе (Сидорова, И.С., 2005). Эта проблема привлекает наибольшее внимание современных исследователей (Аржанова О.Н., 2004; Бурлев В.А. и соавт., 2006), однако немаловажная роль в развитии ФПН отводится иммунологическим нарушениям в системе «мать-плацента-плод» (Газиева И.А., Чистякова Г.Н., 2010). Таким образом, в развитии СЗРП и морфологической незрелости плода лежат изменения не только в организме беременной и плода, но прежде всего метаболизма в плаценте (Айламазян Э.К., 2005; Сидельникова В.М., 2005; Серов В.Н., 2006; Краснополь-ский В.И. и соавт., 2008).

Поэтому, разработка новых методов ранней диагностики нарушений фето-плацентарного комплекса, будь то чувствительные биохимические тесты, или новейшие инструментальные и аппаратные технологии остается актуальной задачей. К числу известных иммунохимических маркеров, возможно имеющих отношение к ФПН следует отнести эмбриоспецифические и плацентарные белки, такие как альфа-фетопротеин (АФП), ферритин (Фрт) или плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ), а также аутоантитела к органоспецифическим плацентарным белкам.

Опубликованные работы подтверждают наличие связи плацентарной недостаточности (ПН) и СЗРП с отклонениями в показателях концентраций белков фе-то-плацентарного комплекса: плацентарных гормонов, отдельных эмбриональных и плацентарных белков (Радзинский В.Е., 2001; Домрачева М.Я., 2003; Пчелин-цев В.В. и соавт., 2006; Бурлев В.А., 2007; Гутникова Л.В. и соавт., 2011; Мороз М.А., 2013).

Степень разработанности темы исследования. Литературные данные косвенно указывают на важную роль белков фето-плацентарного комплекса в развитии ФПН (Посисеева Л.В. и соавт., 2004; Бахмутова Л.А., 2009; Никулина Д.М., 2009; Лапеко С.В., 2009; Гужвина Е.Н., 2013), однако экспериментального подтверждения их участия в формировании ПН и СЗРП не существует (Мамиев О.Б., 2009; Стрижаков А.Н. и соавт., 2012). Непосредственное влияние плацентарных белков в экспериментах по моделированию и коррекции плацентарной недостаточности у беременных крыс в научной литературе не описано. В связи с этим, изучение роли отдельных специфических белковых компонентов фето-плацентарного комплекса, таких как ПЩФ в формировании ПН и СЗРП, также как поиск и отбор имунохимических индикаторов, эффективных для диагностики и прогнозирования ФПН имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель исследования - повышение эффективности диагностики и терапии плацентарной недостаточности и синдрома задержки развития плода путем комплексного иммунохимического исследования плацентарной щелочной фосфатазы.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать физико-химические и иммунохимические свойства щелочных фосфатаз из плаценты человека и крысы и разработать на этой основе способ получения и очистки этого белка из экстрактов женской и крысиной плаценты.

2. Разработать моноспецифическую тест-систему на плацентарную щелочную фосфатазу для иммунохимического анализа этого белка в крови женщин с нормальным и осложненным плацентарной недостаточностью и синдромом задержки развития плода течением беременности.

3. Изучить связь концентраций трех специфических белков фето-плацентарного комплекса: альфа-фетопротеина, ферритина или плацентарной щелочной фосфатазы в крови беременных женщин со степенью выраженности плацентарной недостаточностью и синдромом задержки развития плода.

4. Провести поиск аутоантител к плацентарной щелочной фосфатазе и другим плацентарным белкам в крови беременных женщин и определить различия в частоте их выявления при физиологической беременности и беременности, осложненной фетоплацентарной недостаточностью.

5. Разработать на крысах модель фето-плацентарной недостаточности путем индукции аутоантител к плаценте с помощью предварительной иммунизации самок крыс препаратами ПЩФ человека и крысы.

Научная новизна исследования

6. Впервые разработаны новые методы выделения и очистки значимого для диагностики ПН и СЗРП белка - ПЩФ человека (патент РФ № 2492868), а для экспериментов на животных получен очищенный крысиный аналог ПЩФ. Дана сравнительная физико-химическая и иммунохимическая характеристика ПЩФ человека и крысы.

7. Впервые разработан и внедрен в акушерскую клиническую практику принцип одновременного иммунохимического измерения концентрации ПЩФ в сочетании с определением энзиматической активности этого фермента, позволяющий вычислять новый коэффициент удельной активности К_ПЩФ равный отношению ПЩФ_{фермент}/ПЩФ_белок, отражающий степень тяжести ПН.

8. Установлена связь между уровнями трех специфических белков фето-плацентарного комплекса (АФП, ферритина и ПЩФ) в крови женщин с осложненным течением беременности и степенью выраженности негативных изменений в фето-плацентарном комплексе.

9. Впервые доказан факт появления в сыворотках крови беременнных анти-ПЩФ аутоантител, причем с частотой более высокой при ФПН, чем при ФБ.

10. Доказано, что иммунизация небеременных крыс ксеногенным белком ПЩФ с адьювантом приводит к появлению у них в крови высокого титра антител к ПЩФ человека, а в процессе их беременности вызывает индукцию аутоантител к белкам собственной крысиной плаценты и снижение массы плаценты крыс и их плодов с развитием симптомов фетоплацентарной недостаточности.

Теоретическая и практическая значимость

11. Разработан и запатентован способ выделения и очистки фермента плацентарной щелочной фосфатазы человека и крысы, позволяющий получать очищенные препараты этих белков для последующего получения моноспецифических антисывороток и моделирования иммунохимических тест-систем («Способ получения и очистки плацентарной щелочной фосфатазы», патент на изобретение № 2492868).

12. ПЩФ, очищенная запатентованным способом, может использоваться как в производстве набора для иммунохимического анализа этого фермента, так и в качестве терапевтического препарата для коррекции ПН и СЗРП.

13. Установлены закономерности изменения биосинтеза ПЩФ, Фрт и АФП и коэффициентов их отношений в крови беременных в норме и при ФПН, позволяющие усовершенствовать прогнозирование ФПН. Разработаны высокоэффективные тесты для ранней диагностики ФПН, качество которых подтверждено ROC-анализом.

14. Показано, что идентификация в крови беременной ВИЭФ-тестом анти-ПЩФ аутоантител на сроке 20–22 недели гестации требует перевода пациентки в группу риска по ФПН и ее немедленного углубленного обследования. Полученные факты расширяют представления о многообразной роли ПЩФ в процессе фе-то-плацентарного гомеостаза.

15. В экспериментах на крысах получена модель ПН и СЗРП, основанная на срыве иммунологической толерантности и аутоиммунном повреждении плаценты антителами к плацентарной щелочной фосфатазе («Способ моделирования фетоп-лацентарной недостаточности», приоритетная справка по заявке № 2015150449).

Методология и методы исследования. Методологической основой данного исследования служило системное использование методов научного познания. В работе использовались клинические, экспериментальные, инструментальные, лабораторные, биохимические, иммунохимические, статистические методы исследования. Исследование соответствует правилам и принципам доказательной медицины.

Положения, выносимые на защиту

16. На основании изучения биохимических свойств щелочной фосфатазы и похожих на нее белков из экстрактов плаценты человека и крысы разработан оригинальный запатентованный способ получения плацентарной щелочной фосфата-зы с высокой степенью чистоты и удельной активности, на которую получены антитела и сконструированы тест-системы для иммуноферментного и электроиммунного анализа этого фермента в сыворотках крови беременных.

17. Изучение в сыворотках крови беременных активности ЩФ, ПЩФ, концентрации ПЩФ, АФП и Фрт, а также коэффициентов их соотношений, таких как коэффициент удельной активности ПЩФ, может быть использовано для оценки у беременных риска развития ФПН.

18. Установлено, что уменьшение сывороточных уровней ПЩФ в крови беременных связано как с уменьшением концентрации ПЩФ, так и с ингибировани-ем ферментативной активности фосфатазы у беременных с ФПН, в связи с чем, для медикаментозной коррекции плацентарной недостаточности рекомендуются ионы магния как реактиваторы щелочной фосфатазы.

4. Методом встречного иммуноэлектрофореза в сыворотках крови беременных обнаружены аутоантитела к плацентарным белкам и доказано, что начиная с 20–22 недели гестации частота выявления аутоантител к ПЩФ в крови женщин, беременность которых впоследствии осложнилась ПН и СЗРП достоверно выше, чем при физиологической беременности.

5. Предложен способ моделирования фето-плацентарной недостаточности на животных, заключающийся в иммунизации небеременных самок крыс очищенным ПЩФ человека, что приводит к появлению в их крови не только антител к ПЩФ человека, но и перекрестных аутоантител к белкам своей плаценты, оказывающих во время беременности животного угнетающее действие на плод и плаценту крыс, которое можно скорректировать введением беременным крысам ПЩФ человека.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов проведенного исследования определяется достаточным объемом выполненных исследований, наличием групп сравнения, использованием современных методов исследования и статистической обработки полученных данных.

Основные положения работы и результаты исследования доложены на XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012); на VIII и Х Международных научно-практических конференциях «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем здравоохранения» (Астрахань, 2011, 2015); Международной научной школе для молодежи «Школа научно-технического творчества и концептуального проектирования» (Астрахань, 2011) и Региональной научно-практической конференции «Исследования молодых ученых – вклад в инновационное развитие России» (Астрахань, 2012, 2014, 2015), на Объединенном Иммунологическом Форуме (Нижний Новгород, 2013).

Апробация диссертации проведена на объединённом заседании кафедр биологической химии; анатомии человека; биологии; нормальной физиологии; патологической физиологии, перинатологии с курсом сестринского дела, пропедевтики детских болезней, поликлинической и неотложной педиатрии; акушерства и гинекологии лечебного факультета; топографической анатомии и оперативной хирургии; химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО Астраханский ГМУ Минздрава России).

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы отделений патологии беременных, новорожденных, анестезиологии и реанимации ГБУЗ АО «Клинический родильный дом» г.Астрахани. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедр общей и биоорганической химии и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии (университета).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации; получен 1 патент на изобретение и 1 приоритетная справка по заявке № 2015150449.

Личное участие автора в получении результатов. Автором проведен поиск и анализ литературы (100 %), сформулирована цель и задачи исследования, определена методология исследования (95 %). Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении исходных данных (85 %). Автором осуществлены экспериментальные исследования по моделированию ФПН у лабораторных животных (80 %). Проведена математическая обработка, статистический анализ и оценка полученных результатов (95 %). Автор непосредственно участвовал в подготовке научных статей, неоднократно представлял результаты исследования на съездах и конференциях (92 %).

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя и приложения. Список литературы включает 228 источников, из которых 163 работы - отечественных и 65 -иностранных авторов. Работа содержит 14 таблиц, иллюстрирована 34 рисунками.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Астраханского государственного медицинского университета.

Значение эмбриоспецифических и плацентарных белков в развитии нормальной и осложнённой ПН и СЗРП беременности

В патогенезе формирования асимметричной формы ЗРП второй половины беременности, для которой характерно преимущественное уменьшение окружности живота плода, важную роль выполняет компенсаторное перераспределение кровотока плода, когда артериальная кровь движется преимущественно в направлении головного мозга плода («brain-sparing effect») и обеспечивает нормальное функционирование ЦНС.

Смешанная форма ЗРП, наблюдаемая при тяжелой экстагенитальной патологии женщины на фоне беременности осложненной гестозом, продолжительной угрозой прерывания беременности или тяжелой синдромной патологии плода, характеризуется преимущественным уменьшением размеров живота за счет выраженного недоразвития подкожно-жировой клетчатки и объема паренхиматозных органов плода при одновременном уменьшении всех остальных фетометрических показателей (Бунин А.Т., 1993; Анастасьева В.Г., 1996; Медведев Б.В., Юдина Е.В., 1998; Савельева Г.М., 1999; Шабалов Н.П., 1997, 2006; Володин Н.Н., 2003; Володин Н.Н. и соавт., 2004; Стрижаков А.Н. и соавт., 2004; Серов В.Н., 2005; Стрижаков А.Н., 2011; Gluckman P.D., Harding J.E., 1997; Resnik R., 2002; Seeds J.W., 2005; Carbillon L., 2006).

Диагностика ФПН. Для диагностики ПН применяется комплекс различных методов. Клинические методы включают сбор анамнестических факторов риска, обследование беременной и плода с измерением окружности живота и высоты стояния дна матки, определения тонуса миометрия, положения плода, вычисления его пред 17 полагаемой массы, аускультативного исследования с целью оценки состояния сердечно-сосудистой системы. Например, отставание высоты стояния дна матки на 2 см и более по сравнению с этим нормативным показателем для конкретного срока беременности или отсутствие увеличения в течение 2–3 нед. позволяет предположить развитие СЗРП (Савельева Г.М., 1999; Стрижаков А.Н. и соавт., 2000; Серов В.Н. и соавт., 2002; Серов В.Н., 2005; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2005, 2007; Боровко-ва Е.И. и соавт., 2006; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2006; Мамиев О.Б., 2006; Ша-балов Н.П., 2006; Айламазян Э.К. и соавт., 2009; Стрижаков А.Н., 2011; Ott W.Y., 1998; Gagnon R., 2003).

К недостаткам клинических методов следует отнести следующее. Индивидуальные особенности размеров живота и матки у беременных зависят от многих факторов (антропометрические особенности, выраженность подкожно-жирового слоя, объем околоплодных вод, положение и количество плодов) снижают точность клинического метода диагностики. Аускультативные данные оказываются информативными только на поздних стадиях ХВГ и СЗРП и чаще проявляются уже в родах. Оценка состояния околоплодных вод до родов методами амниоско-пии и амниоцентеза не имеет массового применения из-за малой информативности первого метода и ограничений, связанных с инвазивным методом для второго. Поэтому, около 60 % случаев ПН у беременных с помощью клинических методов не диагностируется. Однако, клинический диагноз подтверждается у каждой третьей беременной, направляемой на УЗИ с подозрением на СЗРП (Савельева Г.М., 1999; Стрижаков А.Н. и соавт., 2000; Серов В.Н. и соавт., 2002; Серов В.Н., 2005; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2005, 2007; Боровкова Е.И. и соавт., 2006; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2006; Мамиев О.Б., 2006; Шабалов Н.П., 2006; Айлама-зян Э.К. и соавт., 2009; Стрижаков А.Н., 2011; Ott W.Y., 1998; Gagnon R., 2003).

Наряду с аускультативным методом в настоящее время для полноценной клинической оценки состояния плода широко используются следующие методы:

Лабораторно-инструментальные исследования. При современном комплексном обследовании беременной необходимо: 1) обнаружить основные клини 18

ческие проявления ФПН, определить степень и форму СЗРП, тяжесть ХВГ; 2) оценить степень функциональных и морфологических изменений в фетопла-центарной системе и ее адаптационные возможности; 3) установить этиологические факторы и патогенетические механизмы развития фетоплацентарной недостаточности, на основании чего выбрать оптимальный вариант лечения и разработать оптимальную акушерскую тактику (Стрижаков А.Н., 2002; Радзинский В.Е., Милованов А.П., 2004; Таранов А.Г., 2004; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2007; Милованов А.П., Кириченко А.К., 2010).

В связи с этим все большее распространение приобретают методы лабораторно-инструментальной диагностики, позволяющие выявлять нарушения на более ранних стадиях и своевременно приступить к лечебным мероприятиям (Стрижаков А.Н., 2002; Филиппов О.С., Казанцева А.А., 2003; Радзинский В.Е., Милованов А.П., 2004; Таранов А.Г., 2004; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2007).

Среди лабораторных методов в последние годы применяют определение гормональной и белоксинтезирующей функции фетоплацентарного комплекса (плацентарный лактоген, прогестерон, эстриол, кортизол, -фетопротеин, SP1, PP12 и др.), биохимическое исследование его ферментной активности (аспартата-минотрасфераза, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза и др.). Лабораторная диагностика ФПН, основанная на определении уровня гормонов, имеет свои характерные признаки, которые опережают клинические проявления недостаточности плаценты на 2–3 нед. ФПН в ранние сроки беременности в основном зависит от недостаточной гормональной активности желтого тела, сопровождается низким уровнем прогестерона и ХГ. Позже, во II и III триместрах беременности, развитие ПН сопровождается морфологическими нарушениями, что постепенно обуславливает развитие недостаточности гормонпродуцирующей функции плаценты (Болтовская М.Н. и соавт., 1999; Бурлев В.А. и соавт., 1999, 2006; Побе-динский Н.М. и соавт., 1999; Филиппов О.С., 2000; Радзинский В.Е. и соавт., 2002; Домрачева М.Я., 2003; Гагарина, А.В., 2004; Павлова Н.Г. и соавт., 2004; Москаленко Н.П., 2005; Мамедалиева Н.М., Курмангали Ж.К., 2006; Буштыре-ва И.О., 2006; Тришкин А.Г. и соавт., 2006; Краснопольский В.И. и соавт., 2008; Липатов И.С. и соавт., 2008; Орлов В.И. и соавт., 2009; Погорелова Т.Н., 2009). Напряжение, неустойчивость и истощение гормональной функции фето-плацентарного комплекса (ФПК) являются ранними доклиническими признаками плацентарной недостаточности (ПН). В связи с этим гормональная диагностика функционального состояния ФПК должна быть в обязательном порядке рекомендована всем беременным, включенным в группу повышенного риска. С целью диагностики ПН необходимо динамическое наблюдение за комплексом гормонов ФПК (Болтовская М.Н., 2001; Савельева Г.М. и соавт., 2001; Пономарева Н.А., 2005; Аржанова О.Н. и соавт., 2006; Тришкин А.Г. и соавт., 2006; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2007; Сотникова Н.Ю. и соавт., 2008; Гутникова Л.В. и соавт., 2011).

Материал и методы лабораторного исследования

Характеристика экспериментальных животных. В экспериментах использовали 46 самок белых крыс линии Wistar (таблица 3), с 4-недельного до 3–5-месячного возраста, любезно предоставленных к.м.н., старшим научным сотрудником Давыдовым А.Г. из вивария Федерального государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» (г. Астрахань). Для спаривания из этого же вивария на время отбирались 5–6-месячные самцы крыс Wistar. Масса самок крыс перед оплодотворением колебалась от 190 до 250 граммов. Для каждой серии экспериментов группы крыс включали по 5–10 животных.

Кроме того, проведены гравиметрические и морфологические исследования 309 плодов крыс линии Вистар и такое же количество последов (таблица 3).

В период экспериментальных исследований животных содержали в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» (Хабриев Р.У., 2005), принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986) и приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Для исключения реакции на новизну обстановки самок перед началом эксперимента выдерживали 10 дней в стационарных условиях вивария. Питание и питье животные получали ad libidum. Крыс содержали в виварии с естественным освещением при температуре 20–22 С в клетках площадью 0,6 м2, не более 4 самок в каждой клетке. Для серологических исследований взятие крови у самок крыс осуществляли из хвостовой вены (Гамбарян П.П., Дукельская Н.М., 1955; Хабриев Р.У., 2005).

Схема экспериментов по иммунизации крыс плацентарными белками представлена в соответствующей главе собственных исследований. Ранее не рожавшие самки крыс, после иммунизации плацентарными белками, были отобраны для экспериментов по моделированию ФПН и подвергались процедуре оплодотворения. Определялась фаза эстрального цикла, и самок в период диэструса подсаживали к самцу из расчета 4 самки на самца. Продолжительность периода спаривания не превышала 2-х недель. Отсчет сроков беременности вели с момента обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках (Гамбарян П.П., Дукельская Н.М., 1955). Внешние признаки беременности определялись с конца второй недели. У самок увеличивалась окружность живота, наблюдался усиленный рельеф сосков и поведенческие особенности.

За лабораторными животными в течение всей беременности проводили ежедневное клиническое наблюдение. Одной из групп иммунизированных самок крыс повторно троекратно на 2–3, 9–10 и 16–17 сутки беременности внутримышечно вводили препараты ПЩФ человека или экстракта крысиной плаценты (ЭКП).

На 21 день беременности, за день до предполагаемых родов, проводили эвтаназию животных с помощью этаминал-натрия в дозе 60 мг/кг, осуществляли аутопсию самок и определяли число плодов и наличие пороков развития (Гамба-рян П.П., Дукельская Н.М., 1955; Чеботарь Н.А. и соавт., 1995). Для обнаружения внешних видимых аномалий развития все плоды обследовали под бинокулярным микроскопом типа МБС (Хабриев Р.У., 2005). Взвешивание последов и эмбрионов проводили при помощи весов ВЛТ-150.

Объектом лабораторного исследования явились образцы крови и сыворотки крови беременных женщин с физиологической и отягощенной ПН и СЗРП беременностью (таблица 3). Забор крови у беременных для биохимических исследований осуществлялся на базе женской консультации ГБУЗ АО «Клинический родильный дом» г. Астрахани или в самом родильном доме путем венепункции из локтевой вены.

Свернувшаяся в пробирках кровь подвергалась центрифугированию. Сыворотки крови разливались по аликвотам в маркированные пробирки Эппендорфа по 0,5 мл и без добавления консерванта немедленно замораживались. Хранились в замороженном виде при -20 С до момента проведения анализа. Таблица 3 - Объем исследуемого материала

В качестве контрольной группы использовали 68 образцов сывороток крови полученных из областной станции переливания крови от группы женщин-доноров в возрасте от 23 до 50 лет, имевших в анамнезе срочные роды. Общее количество образцов сыворотки крови от 115 беременных и 68 доноров составило 528 образцов (таблица 3).

Комплексное лабораторное обследование включало как методы общеклинической лабораторной диагностики (общий анализ белой и красной крови, мочи, Hb, СОЭ), проведенные в клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ АО ГКРД г. Астрахани, так и углубленные биохимические методы исследования основных показателей углеводного, липидного, белкового и минерального обменов, рекомендованные Международной Федерацией клинической химии (IFCC) и выполненные в кли-нико-диагностической лаборатории Федерального Центра сердечно-сосудистой хирургии (зав. лаб. – к.м.н. Петрова О.В.) на автоматическом биохимическом многоканальном анализаторе «Microlab» с использованием стандартных наборов («Vitalab», Нидерланды) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные в КДЛ ФЦ ССХ лабораторные сведения использовались для исключения из диссертационного исследования беременных с соматической патологией (например, обнаружение антител к фосфолипидам). Там же определялась активность щелочной фосфатазы во всех 628 параллельных образцах натив-ных и прогретых при 65 С сывороток крови (ЩФ и ПЩФ в Е/л).

На основании измерения в одной и той же пробе активности ПЩФ в Е/л и концентрации ПЩФ в мкг/л вычисляли производную величину, названную нами коэффициентом удельной активности КПЩФ.

В сыворотках крови этих беременных и рожениц иммунохимическими методами в эти же сроки исследовали концентрации 3-х белков. Для количественного определения плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) применяли тест-системы для встречного иммуноэлектрофореза полученные самостоятельно, а для определения альфа-фетопротеина (АФП) и ферритина – коммерческие наборы для ИФА (ООО «Алкор Био» г. Санкт- Петербург).

Разработка технологии получения препарата ПЩФ из экстракта плаценты человека и крысы

В сыворотках крови 17 женщин из группы «ЗРП I» с беременностью, осложненной ФПН и в последствии родивших детей с ЗРП I степени (таблица 6, рисунок 9), активность ЩФ на 10-12 неделе гестации составила 119,1 ± 11,39 Е/л, то есть была на 20 % выше, чем у женщин-доноров, беременных с физиологической беременностью из группы ФП и беременных с признаками плацентарной недостаточности, но без признаков ЗРП (группа ПН без ЗРП). Однако, учитывая ошибку измерения, такой уровень фосфатазной активности от других групп статистически не отличался. Начиная с 20-22 недели, в этой группе «ЗРП I» прослеживалась медленная тенденция к гиперфосфатаземии, но активность ЩФ (125,8 ± 10,59 Е/л) статистически значимо от трех других уже рассмотренных групп не отличалась. Достоверно более высокую активность ЩФ наблюдали в III триместре: на 30-32 неделе - 198,6 ± 11,90 Е/л (р 0,01) и на 39-41 неделе гестации наблюдалось некоторое снижение уровня ЩФ - 218,4 ± 12,60 Е/л, оставаясь достоверно выше (р 0,01), чем у небеременных и беременных всех групп до 22 недель беременности (таблица 6). У беременных группы «ЗРП I» на 30-32 неделе гестации наблюдается отставание темпов биосинтеза ЩФ, что проявляется в достоверно (р 0,01) более низких значениях ЩФ по сравнению с группой «ФБ» на 30-32 недели гестации (таблица 6) и в сглаженности S-образной кривой ЩФ (рисунок 9), сходящейся с уровнем ЩФ при физиологической беременности к концу беременности (точка «Роды»).

Активность ПЩФ на 10-12 неделях гестации выявлялась у 13 из 17 беременных женщин (76,5 %) группы «ЗРП I» и в среднем составила 12,7 ± 2,51 Е/л, что достоверно выше (р 0,001) активности ПЩФ в донорских сыворотках. Начиная с 20-22 недели гестации активность ПЩФ выявлялась во всех 100 % сывороток беременных и составила: 28,6 ± 3,55 Е/л на 20-22 неделе, 85,1 ± 8,66 Е/л на 30-32 неделе и 90,4 ± 13,21 Е/л перед родами или в родах на 39-41 неделе. Достоверное снижение уровня ПЩФ по сравнению с ФБ (р 0,05) обнаружено и на 30-32, и на 39-41 неделях гестации (таблица 6). При этом на протяжении всего третьего триместра ферментативная активность ПЩФ сохраняется примерно на одном уровне (рисунок 10), достоверно более низком, чем при физиологической беременности.

Методом ИФА ПЩФ обнаружен на 10-12 неделях гестации у 11 из 17 женщин (64,7 %) с беременностью, осложненной ПН и СЗРП I степени и у всех 100 % женщин этой группы в более поздние сроки гестации. Как видно из таблица 6, концентрация ПЩФ в 17 образцах сыворотки крови беременных группы «ПН+СЗРП I» составила по срокам гестации 15,3 ± 3,22 мкг/л на 10-12 неделе, 36,5 ± 4,61 мкг/л на 20-22 неделе, 101,2 ± 11,44 мкг/л на 30-32 неделе и 112,9 ± 16,53 мкг/л на 39-41 неделе и была статистически достоверно выше (р 0,01), чем в сыворотках женщин-доноров. Достоверное снижение содержания ПЩФ по сравнению с группой ФБ (р 0,05) обнаружено только на 30-32 неделях гестации (таблица 6). При этом на протяжении всего третьего триместра концентрация ПЩФ, также как и активность ПЩФ, сохраняется примерно на одном уровне (рисунок 11), значительно более низком, чем при физиологической беременности.

Коэффициент удельной активности КПЩФ на 10-12 неделе гестации у 13 ПЩФ-позитивных женщин группы «ЗРП I» составил 0,66 ± 0,092 Е/мкг и не отличался от контрольных значений женщин доноров (таблица 6). В более поздние сроки беременности в группе «ЗРП I» коэффициент КПЩФ составил 0,78 ± 0,041 Е/мкг (20-22 нед), 0,90 ± 0,066 Е/мкг (30-32 нед) и 0,80 ± 0,049 Е/мкг (39-41 нед) и достоверно не отличался от значений КПЩФ из образцов, полученных у доноров и беременных I триместра, имевших ПЩФ-серопозивные сыворотки. Однако, к 39-41 неделе гестации (таблица 6) обнаруживаются достоверно более низкие значения КПЩФ (р 0,05), чем перед родами в группе беременных с ФБ. В последнем случае на диаграмме в группе «ЗРП I», в отличие от групп «ФБ» и «ПН без ЗРП» обнаруживается новая тенденция: быстрое и достоверное снижение КПЩФ после 30 недель и до родов (рисунок 12).

В сыворотках крови 10 женщин из группы «ЗРП II» с беременностью, осложненной ФПН и впоследствии родивших детей с ЗРП II степени (таблица 6, рисунок 9), активность ЩФ на 10-12 неделе гестации составила 112,9 ± 16,34 Е/л и достоверно не отличалась от уровня ЩФ у женщин-доноров и женщин с физиологической или патологической беременностью того же срока гестации. Начиная с 20-22 недели в этой группе беременных «ЗРП II» также намечалась тенденция к гиперфосфатаземии (рисунок 9), однако, активность ЩФ (124,6 ± 10,44 Е/л) статистически значимо от контрольных донорских значений и всех групп беременных такого же и более раннего срока не отличалась. Достоверно более высокую активность ЩФ (р 0,01), чем у небеременных и беременных первой половины беременности (таблица 6, рисунок 9) наблюдали в группе беременных «ЗРП II» только на 30-32 неделе - 181,5 ± 16,82 Е/л и на 39-41 неделе гестации -199,1 ± 13,32 Е/л. Также как и в группе «ЗРП І», у беременных группы «ЗРП II» на 30-32 неделе гестации наблюдается отставание темпов биосинтеза ЩФ, что проявляется в достоверно (р 0,05) более низких уровнях ЩФ по сравнению с ФБ только на 30-32 недели гестации (таблица 6). На графике у беременных этой группы наблюдается самая сглаженная S-образная кривая активности ЩФ (рисунок 9) из всех четырех групп беременных.

Содержание ферритина и АФП в сыворотках крови женщин с нормальным и осложненным ФПН течением беременности

Частота обнаружения аутоантител в донорских сыворотках методом встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) составила 1,5 % ААТ к Фрт, 2,9 % ААТ к АГП и 1,5 % ААТ к ПЩФ.

ААТ к Фрт из 74 женщин с ФБ обнаружены во все сроки гестации только у одной беременной (1,4 %), из 41 женщины с беременностью, осложненной ФПН у 2 (4,9 %). Единичные случаи обнаружения ААТ к Фрт в крови как доноров, так и беременных свидетельствуют о внеакушерских причинах их образования.

Частота обнаружения ААТ к белкам АГП в сыворотке крови при физиологической беременности увеличивается в процессе гестации (1,4–2,7–5,4–6,8 %) и при беременности осложненной ФПН (2,4–7,3–7,3–12,2 %). Однако существенных различий между группами и донорами не выявлено.

При физиологической беременности нарастание частоты выявления ан-тиПЩФ аутоантител происходит вплоть до 30–32 недели, достоверно отличаясь от фоновых значений частоты обнаружения аутоантител у женщин-доноров, имевших в анамнезе роды. Далее на протяжении третьего триместра до родов при физиологической беременности наблюдалось плато, в отличие от всех вариантов патологической беременности, когда к 39–41 неделях гестации происходит дальнейший рост частоты выявления ААТ. При этом различия между группами с физиологической и патологической беременностью перед родами по критерию 2 становятся статистически достоверными: аутоантитела против ПЩФ при беременности, осложненной ФПН, встречаются перед родами в 3–4 раза чаще, чем при ФБ.

Сравнивая с ФБ, достоверно более высокая встречаемость ААТ к ПЩФ установлена во всех подгруппах женщин с беременностью, осложненной ПН и СЗРП, начиная с 20–22 недель гестации (в 8–20 раз чаще).

Таким образом, нами впервые установлен факт появления антиПЩФ ауто-антител, пропорциональный степени тяжести ФПН, поэтому положительный

ВИЭФ-тест на аутоантитела к ПЩФ может служить индикатором гестации, осложненной ПН и СЗРП. Следовательно, обнаружение в крови беременной ан-тиПЩФ аутоантител ВИЭФ-тестом на сроке 20–22 недели гестации требует перевода беременной в группу риска по ФПН и ее немедленного углубленного обследования.

Для экспериментального подтверждения гипотезы об участии ПЩФ и ауто-антител к ней в патогенезе ФПН нами проведена серия исследований по моделированию аутоиммунной ПН на беременных лабораторных крысах.

Срыв иммунологической толерантности к естественному для периода беременности плацентарному антигену – ПЩФ провоцировался иммунизацией небеременных самок ксеногенным для крыс белком – ПЩФ человека, для которого нами показана частичная перекрестная иммунореактивность с ЩФ из плаценты крысы (рисунок 7).

Из литературных данных и консультаций с ведущими специалистами в области экспериментальных моделей в акушерстве нами установлено, что наиболее удобным и доступным экспериментальным животным для моделирования ПН и СЗРП являются крысы, имеющие сходный с женским тип плацентации. Однако, в связи с особенностями гуморального иммунитета, самки крыс не относятся к хорошим продуцентам антител, в отличие от кроликов, овец, коз, лошадей, широко применяемых при производстве гипериммунных антисывороток.

В предварительных экспериментах с целью получения антител к белкам плаценты нами сделана попытка иммунизации крыс различными водорастворимыми плацентарными белками человека – ХГ, ТБГ, ПЛ. Так как эти секретируе-мые белки плаценты не вызывали выраженного иммунного ответа, нами в данной работе сделан акцент на более иммуногенный мембраносвязанный тканевой белок плаценты – ПЩФ. Обнаружено, что иммунизация виргильных самок крыс экстрактом плаценты с ПАФ в течение полутора месяцев приводит к нарастанию титров ПЩФ и Фрт были почти на порядок больше, чем титров сывороточных белков беременности - ХГ, ТБГ, ПЛ (рисунок 34).

В ходе проведенных экспериментов на крысах установлено, что длительная иммунизация небеременных самок крыс ксеногенным плацентарным белком ПЩФ, приводит к появлению у них в крови высокого титра антител к ПЩФ человека, а в процессе их беременности вызывает индукцию аутоантител к белкам собственной крысиной плаценты и снижение массы плаценты крыс и их плодов с развитием симптомов фетоплацентарной недостаточности. Таким образом, сенсибилизируя небеременных самок крыс препаратом чужеродной ПЩФ нам удалось индуцировать срыв иммунологической толерантности к аутоантигенам крысиной плаценты и разработать новую аутоиммунную модель ФПН.

Кроме того, нами установлено, что в условиях экспериментальной аутоиммунной плацентарной недостаточности препараты ПЩФ человека (10 мг/кг), но не экстракта крысиной плаценты практически полностью отменяют депрессивное влияние крысиных аутоантител на плаценту и плод и предотвращают развитие плацентарной недостаточности и задержку внутриутробного развития плода. Следовательно, фермент ПЩФ как лекарственный препарат может быть перспективен для коррекции ПН и СЗРП. При этом мы предполагаем, что позитивное действие ПЩФ на экспериментальную аиФПН связано не только с нейтрализацией аутоантител к этому плацентарному белку, но и с его стимулирующим действием на плаценту и плод.

Таким образом, функция ПЩФ в организме беременной представляется неоднозначной. ПЩФ как ключевой фермент многих метаболических процессов выполняет свою прямую функцию в процессах фосфорилирования-дефосфорилирования в быстрорастущих тканях матери и плода, для обеспечения которых обычных фосфа-таз было бы недостаточно (Бунин А.Т., 1993; Бурмистров С.О. и соавт., 2001; Аржанова О.Н. и соавт., 2006; Болтовская М.Н., 2006; Боровкова Е.И. и соавт., 2006; Бу-штырева И.О. и соавт., 2006; Гагаева Ю.В. и соавт., 2006). Кроме того, накапливается все больше сведений о том, что плацентарный фермент не только выполняет роль трансмиттера при активации факторов роста, но и сам, возможно, обладает такой активностью (Беда Н.А., 2002; Коханов А.В. и соавт., 2013), что еще больше повышает интерес к этому белку.