Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Механизмы гибели клеток печени. Участие митохондрий в клеточной гибели 11
1.2. Са -зависимая неспецифическая проницаемость внутренней мембраны митохондрий 18
1.2.1. Возникновение и развитие представлений о неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий 18
1.2.2. Митохондриальная Са2+-зависимая ЦсА-чувствительная пора
1.2.2.1. Общая характеристика 21
1.2.2.2. Предполагаемые механизмы образования и функционирования ЦсА-чувствительной митохондриальной поры 24
1.2.2.3. Физиологическая и патофизиологическая роль ЦсА-чувствительной поры митохондрий 1.2.3. Са -зависимая ЦсА-нечувствительная митохондриальная пора, индуцированная свободными жирными кислотами 30
1.2.3.1. Общая характеристика и предполагаемый механизм образования 30
1.2.3.2. Физиологическая и патофизиологическая роль ЦсА-нечувствительной поры, индуцированной жирными кислотами и Са2+ 34
1.3. Образование а,одиоловых жирных кислот в клетках печени и их влияние на митохондрии 36
2. Материалы и методы исследования 40
3. Результаты и их обсуждение 47
3.1. Изучение эффектов а,одиоловых кислот как индукторов ЦсА 9+
нечувствительной Са -зависимой неспецифической пермеабилизации
митохондрий печени з
3.1.1. Влияние а,одиоловых кислот в присутствии ЦсА на оптическую плотность суспензии митохондрий печени, нагруженных ионами кальция и стронция 47
3.1.2. Влияние ГДК в присутствии ЦсА на способность митохондрий удерживать ионы кальция и стронция 50
3.1.3. Влияние ГДК в присутствии ЦсА на разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий печени, нагруженных ионами кальция 52
3.1.4. Зависимость скорости набухания митохондрий от концентраций добавляемых ГДК и хлорида кальция 54
3.1.5. Сравнение эффектов различных а,ю-диоловых кислот, отличающихся длиной ацильной цепи, как индукторов ЦсА-нечувствительной пермеабилизации митохондрий печени, нагруженных ионами кальция 55
3.2. Условия необходимые для проявления действия ГДК 57
3.2.1. Энергизация митохондрий и наличие Са2+ в матриксе как одни из необходимымых условий индукции поры ГДК 57
3.2.2. Влияние высокомолекулярных ПЭГ на пермеабилизацию митохондрий, индуцированную ГДК и ионами кальция 61
3.3. Влияние некоторых физиологических модуляторов на процесс индукции поры ионами кальция и ГДК 62
3.3.1. Влияние природных разобщителей окислительного фосфорилирования на открытие поры, индуцированное Са2+ и ГДК 63
3.3.2. Влияние адениновых нуклеотидов на кальций-зависимую пермеабилизацию митохондрий печени, индуцированную ГДК 67
3.3.3. Влияние Mg и спермина на набухание митохондрий печени, индуцированное Са2+иГДК 70
3.3.4. Влияние бычьего сывороточного альбумина (БСА) на набухание митохондрий печени, индуцированное Са и ГДК
3.4. Влияние ионной силы среды инкубации на процесс индукции ГДК и Са неспецифической поры в митохондриях печени 74 9+
3.5. Индукция ГДК и Са неспецифической пермеабилизации митохондрий приводит к выходу цитохрома с из митохондрий
3.6. Индукция а,одиоловыми кислотами Са -зависимой пермеабилизации липосом 83
Заключение 90
Выводы 94
Список литературы
- Митохондриальная Са2+-зависимая ЦсА-чувствительная пора
- Физиологическая и патофизиологическая роль ЦсА-нечувствительной поры, индуцированной жирными кислотами и Са2+
- Влияние ГДК в присутствии ЦсА на разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий печени, нагруженных ионами кальция
- Влияние Mg и спермина на набухание митохондрий печени, индуцированное Са2+иГДК
Митохондриальная Са2+-зависимая ЦсА-чувствительная пора
Явление индукции проницаемости внутренней мембраны митохондрий было известно еще с 50-х годов XX века. Было показано, что добавление избыточного количества Са2+ к суспензии изолированных митохондрии в присутствии неорганического фосфата (Фн), жирных кислот, приводит к высокоамплитудному набуханию органелл (Raaflaub, 1953а; Brenner-Holzach and Raaflaub, 1954; Hunter and Ford, 1955; Tapley, 1956; Lehninger, 1959). Таким образом, факт индукции проницаемости внутренней мембраны митохондрий был известен еще до появления знаменитой хемиосмотической теории Митчелла, совершившей переворот в области биоэнергетики (Mitchell, 1961). Однако необходимо отметить, что до 70-х годов считалось, что индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий - это лишь, так называемый, in vitro артефакт (то есть характерен только для изолированных митохондрий), и он не играет существенной роли в патофизиологических процессах, происходящих в живом организме (Hunter and Ford, 1955). Кроме того, было распространено мнение, что наблюдаемое набухание органелл является результатом неспецифического повреждения их внутренней мембраны фосфолипазами (Waite et al, 1969; Pfeiffer et al., 1978). Было показано, что Ca вызывает активацию фосфолипазы А2: в результате гидролитической активности которой в мембране накапливаются «дефекты» - лизоформы фосфолипидов и свободные жирные кислоты, которые и являются основной причиной изменения проницаемости митохондриальной мембраны (Pfeiffer et al, 1978; Pfeiffer at al, 1979; Beatrice et al., 1980; Broekemeier at al, 1985; Broekemeier and Pfeiffer, 1995; Rustenbeck et al, 1996). Однако эта гипотеза о липидной природе поры не могла ответить на вопрос, почему происходит быстрое высокоамплитудное набухание митохондрий, если накопление дефектов в мембране, связанных с активностью фосфолипазы А2 происходит постепенно.
Лишь к концу 70-х годов прошлого века было показано, что набухание органелл, индуцированное различными агентами, является следствием открытия неспецифической поры в мембране митохондрий диаметром 2-3 нм, которая может пропускать молекулы с молекулярной массой более 1500 Да (Hunter et al., 1976; Hunter and Haworth, 1979a, b; Haworth and Hunter, 1979). Открытие такой поры способствует быстрому переносу протонов внутрь митохондрий, что ведет к деполяризации внутренней мембраны и разобщению окислительного фосфорилирования. При этом вода с растворенными в ней низкомолекулярными веществами вследствие коллоидно-осмотического давления устремляется внутрь митохондрий, что ведет к набуханию органелл (Crompton, 1999; Halestrap et al, 2002, 2009; Zorov et al, 2009).
Явление открытия Ca -зависимой неспецифической поры во внутренней митохондриальной мембране получило название «Mitochondrial Permeability Transition Pore» (пора митохондриального перехода проницаемости) (Zoratti and Szabo, 1995). А термин «permeability transition» (переход проницаемости) впервые был введен в конце 70-х г. прошлого века (Hunter et al, 1976; Hunter and Haworth, 1979a, b; Haworth and Hunter, 1979) для описания высокоамплитудного набухания митохондрий, наблюдающегося при перегрузке органелл Са2+.
Считается, что процесс открытия поры в митохондриях подчиняется закону «все или ничего». То есть митохондрии являются либо «нормальными», либо набухшими и какое-либо промежуточное состояние отсутствует. Предполагается, что открытие поры даже в части митохондрий популяции в итоге приведет к тому, что переходу проницаемости будут подвержены все митохондрии данной популяции (Bernardi, 1999).
Первые предположения об участии этого феномена в клеточной патофизиологии были высказаны около 25 лет назад (Crompton and Costi, 1988). Но лишь с начала XXI века общепризнано, что открытие неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий является важнейшим звеном в процессе инициации гибели клетки (Bernardi et al, 2006; Rasola and Bernardi, 2007).
В конце 80-х годов прошлого века было обнаружено, что циклоспорин А (ЦсА)-циклический ундекапептид, используемый в качестве иммунодепрессанта, способен ингибировать открытие митохондриальной поры в субмикромолярных концентрациях в присутствии различных индукторов (Fournier et al., 1987; Crompton et al., 1988; Broekemeier et al, 1989; Solem and Wallace, 1993). С этим открытием связано начало нового периода в изучении митохондриальных пор. Открытие этого ингибитора, который не влиял на активность фосфолипазы А2 (Broekemeier and Pfeiffer, 1989), утвердило концепцию о белковой природе митохондриальной поры.
Недавно было установлено, что в митохондриях возможно открытие другого типа пор, нечувствительного к ингибирующему действию ЦсА (Sultan and Sokolove, 2001а; 2001b; Mironova et al., 2001). После этого было принято выделять пору «классического» митохондриального перехода проницаемости (или ЦсА-чувствительная пора) и пору «неклассического» перехода проницаемости (ЦсА нечувствительную) (Sultan and Sokolove, 2001a, b). Далее изучение этих типов проницаемости митохондрий пошло разными путями, которые, однако, пересекаются.
Физиологическая и патофизиологическая роль ЦсА-нечувствительной поры, индуцированной жирными кислотами и Са2+
Большие однослойные липосомы, загруженные сульфородамином Б (СрБ) формировали из фосфатидилхолина согласно процедуре, описанной выше, за исключением того, что (7) буфер содержал 50 мМ СрБ вместо 40 мМ КС1 и (2) полученные липосомы были очищены от внешнего СрБ на колонке, забитой сефадексом G-50 (10 1 см), и уравновешены буфером, содержащим 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5), 50 мкМ ЭГТА и 40 мМ КС1.
Выход СрБ из липосом определяли по увеличению интенсивности флуоресценции вследствие диссоциации димеров сульфородамина Б после разбавления красителя во внешней среде. Флуоресценция СрБ измерялась на спектрофлуориметре «Ocean Optics USB 2000» («Ocean Optics, Inc», США) (длина волны возбуждения - 565 нм; длина волны флуоресценции - 586 нм). Флуоресценция сульфородамина в водной среде была устойчивой в течение нескольких часов и имела линейную зависимость от концентрации СрБ в диапазоне 10"8-10"6 М. В экспериментах липосомы, загруженные СрБ добавляли к 2 мл буфера (10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 50 мкМ ЭГТА, и 40 мМ КС1), а затем измеряли флуоресценцию образцов до и после различных добавок. Для оценки максимального уровня флуоресценции при полном высвобождении СрБ во внешнюю среду, в конце каждого эксперимента к образцу добавляли 0.1% тритон Х-100 (ТХ-100). Количество липосом, добавляемых к образцу, было откорректировано так, чтобы максимальная флуоресценция была всегда на одном уровне. Молярная концентрация фосфолипида в образцах, измеренная модифицированным методом Бартлетта (Bartlett, 1959) составляла 30-50 мкМ. Жирные кислоты добавлялись к образцам в виде спиртового раствора, конечная концентрация этанола не превышала 1%. В данной концентрации этанол сам по себе не приводил к выходу СрБ из липосом.
Влияние ГДК и Са на изменение температуры фазового перехода фосфолипидных мембран было изучено с помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины с применением метода цифрового анализа гармонических сигналов (Kharakoz, 2007; Асташев и др., 2014). Эксперименты проводились на липосомах, сформированных согласно процедуре, описанной выше, за исключением того, что (7) вместо лецитина использовали фосфолипид дипальмитоил фосфатидилхолин (ДПФХ), (2) концентрация ДПФХ была выше (4,07 мМ) и (3) операции по приготовлению липосом проводились при 45С. В экспериментах оценивались температурные зависимости удельной скорости звука и удельного поглощения звука липосомами при различных условиях их инкубирования. Измерение проводилось при постоянной скорости изменения температуры 0,3С/мин. Состав буфера аналогичен описанному выше. ГДК добавлялась к липосомам в виде спиртового раствора, конечная концентрация этанола не превышала 1%.
Измерение размеров наночастиц (в данном случае липосом), основанное на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа характерного времени флуктуации интенсивности рассеянного света, производилось методом динамического рассеяния света (ДРС) с помощью лазерного анализатора Zetasizer Nano ZS («Malvern Instruments», UK). Эксперименты проводились на липосомах, сформированных из фосфатидилхолина (лецитина) согласно процедуре, описанной выше. Молярная концентрация фосфолипида в образцах составляла 50 мкМ. Состав буфера аналогичен описанному выше. ГДК добавлялась к липосомам в виде спиртового раствора, конечная концентрация этанола не превышала 1%. Все эксперименты проводились при постоянной температуре 25С.
Полученные данные были обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента с помощью пакета прикладных компьютерных программ «Statistica». Для оценки значимости различий использовался уровень вероятности Р 0,05.
В работе использовалась 3-рч[-Морфолино]пропансульфоновая кислота (МОПС), а,о додекандиоловая кислота (ДДК), а,ю-тетрадекандиоловая кислота (ТДК), а,ю-гексадекандиоловая кислота (ГДК), рутениевый красный, олигомицин, янтарная кислота, пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты, циклоспорин А, очищенный от жирных кислот бычий сывороточный альбумин (БСА) фракции V, трис(гидроксиметил)аминометан (Трис-ОН), хлорид тетрафенилфосфония, спермин тетрагидрохлорид, цитохром с, яичный фосфатидилхолин (лецитин), сульфородамин Б, («Sigma», США), ротенон, ЭГТА («Serva», Германия), полиэтиленгликоль молекулярной массой 35 кДа, сахароза, АТФ, АДФ, 2,4-динитрофенол, КС1 («Пика» Швейцария), СаС12, SrCl2, MgCl2 ("Merck", Германия), ДПФХ («Avantilipids, Inc.», США). Использовались растворы олигомицина (2 мг/мл), ротенона (2 мМ), ДДК (50 мМ), ТДК (20 мМ), ГДК (20 мМ), пальмитиновой, олеиновой и линолевой кислот (20 мМ) и циклоспорина А (1 мМ) в дважды перегнанном этаноле; АТФ и АДФ (100 мМ) и 2,4-динитрофенола (5 мМ) - в бидистиллированной воде, полиэтиленгликоля (10 мМ) в среде инкубации. При проведении экспериментов в контрольных пробах к митохондриям добавлялись растворители в том же объеме, как и в опытах с исследуемыми веществами. Во всех случаях растворители не изменяли исследуемые параметры митохондрий.
Влияние ГДК в присутствии ЦсА на разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий печени, нагруженных ионами кальция
Известно, что одним из механизмов, препятствующих индукции жирными кислотами поры в митохондриях, является связывание их специальными белками, в частности, БСА (фракция V) (Zoratti and Szabo, 1995; Sultan and Sokolove, 2001a). Нами установлено, что БСА ингибирует набухание митохондрий, индуцированное Са и ГДК. Однако при одинаковом молярном соотношении БСА/жирная кислота эффект БСА гораздо менее выражен в случае индукции поры ГДК, чем пальмитиновой кислотой (рис. 24 и 25). индуцированного ГДК и Са (а); пальмитиновой кислотой и Са (б) в отсутствии (сплошная линия) и присутствии (пунктирная линия) БСА. Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са ), 20 мкМ ГДК, 40 мкМ Пальмитиновой кислоты (Пальм), 8 мкМ БСА (б) и 17 мкМ БСА (а). Представлены данные типичного эксперимента, полученные на одном препарате митохондрий. Аналогичные результаты были получены еще в трех независимых экспериментах.
Зависимость амплитуды набухания митохондрий печени (в % от максимальной) от молярного соотношения БСА/жирная кислота (ЖК). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования» и в подписи к рис. 24. Добавки: 1 мкМ ЦсА, 200 мкМ хлорида кальция; 20 мкМ ГДК, 40 мкМ пальмитиновой кислоты (Пальм), 4, 8 и 17 мкМ БСА. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (п = 3).
Как известно, БСА на порядок хуже связывает а,ю-диоловые кислоты, чем их монокарбоновые аналоги (Tonsgard and Meredith, 1991). Следовательно, наблюдаемое нами различие в ингибирующем действии БСА может быть связано с тем, что БСА имеет более низкое сродство к ГДК, чем к пальмитиновой кислоте. Следует отметить, что в цитозоле клеток печени имеется специальный низкомолекулярный белок (L-FABP), способный связывать как монокарбоновые жирные кислоты, так и другие гидрофобные соединения. Известно, что этот белок с наибольшим сродством связывает более гидрофобные лиганды (Furuhashi and Hotamisligil, 2008). Можно предположить, что ГДК как соединение, менее гидрофобное, чем пальмитиновая кислота, будет с меньшим сродством связываться с L-FABP и, следовательно, в присутствии этого белка более эффективно индуцировать открытие поры в митохондриях печени. 3.4. Влияние ионной силы среды инкубации на процесс индукции ГДК и Са неспецифической поры в митохондриях печени
В настоящей работе предполагалось выяснить, как изменится кинетика процессов, сопровождающих индукцию проницаемости митохондрий печени ГДК и Са (набухание органелл, выход Са из матрикса, изменение А\/ и скорости потребления кислорода) при замене сахарозной среды инкубации на среду инкубации с высокой ионной силой, составленную на основе хлорида калия.
Как видно на рис. 26, при замене сахарозной среды инкубации КС1-средой небольшое снижение оптической плотности суспензии митохондрий наблюдается уже при внесении Са , и в этом случае последующее добавление ГДК приводит к существенному снижению оптической плотности суспензии. В случае инкубации органелл в сахарозной среде, снижение оптической плотности суспензии органелл наблюдается лишь после последовательного добавления Са и ГДК (рис. 26, кривая а). Следует отметить, что амплитуда набухания органелл, индуцированная
Са и ГДК, больше при их инкубации в сахарозной среде, чем в KCl-среде (рис. 26 и таблица 6). Мы предполагаем, что снижение амплитуды набухания при индукции проницаемости митохондрий, инкубируемых в KCl-среде, может быть связано с экранированием отрицательных поверхностных зарядов на внутренней мембране митохондрий (Wojtczak and Nalecz, 1979).
На рис. 28 представлены данные экспериментов по влиянию Са и ГДК на А\/ митохондрий печени, инкубируемых в сахарозной и КС1- средах. Как показано на рисунке (кривая а), при инкубации митохондрий в сахарозной среде, А\/ сниженный после внесения Са , повышается почти до максимального уровня в течение нескольких минут и не изменяется как минимум 20 мин вплоть до последующего добавления 100 мкМ ДНФ. Добавление 20 мкМ ГДК после внесения Са приводит к быстрому падению А\/ (рис 28, кривая б). При
инкубации митохондрий в KCl-среде А\/, сниженный после внесения Са , повышается в меньшей степени и снова снижается в течение последующих 10 мин (рис 28, кривая в). В этом случае добавление ГДК через 3 мин после внесения Са также приводит к быстрому падению А\/ (рис 28, кривая г). Следует отметить, что при инкубации митохондрий как в сахарозной среде, так и в КС1 9+ среде в присутствии Са ГДК полностью снижает А\/, так как последующее добавление ДНФ в концентрации 100 мкМ не влияет на концентрацию ТФФ+. [ТФФ+], мкМ 1,8 и 2 4 6 8 101214161820222426283032
Кинетика выхода ТФФ из митохондрий печени при добавлении Са и ГДК в сахарозной (кривые а я б) я КС1- (кривые в я г) средах инкубации. Условия эксперимента и состав сред инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования» и в подписи к рис. 26. Среда инкубации была дополнена 1,6 мкМ хлоридом тетрафенилфосфония (ТФФ+). Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК, 100 мкМ
ДНФ. Кривая а и в - без ГДК; кривые б и г - ГДК добавлен через 3 мин после Са . Представлены данные типичного эксперимента, полученные на одном препарате митохондрий. Аналогичные результаты были получены еще в трех независимых экспериментах.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при инкубации 9-І митохондрий печени в сахарозной среде, выход Са из митохондрий (рис. 27, кривая б) и падение А\/ (рис. 28, кривая б) наблюдаются только при добавлении ГДК и сопровождаются набуханием органе л л (рис. 26, кривая а). В отличие от этого при инкубации митохондрий в KCl-среде выход Са (рис. 27, кривая в) и падение А\/ (рис. 28, кривая в) происходят в отсутствие ГДК, но только в присутствии этой жирной кислоты наблюдается набухание органелл (рис. 26, кривая б). Как известно, индукция неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий может быть в двух состояниях: высокопроводящем, сопровождающимся набуханием органелл в сахарозной среде, и низкопроводящем, когда проницаемость только для ионов Н , Са , К не сопровождается набуханием (Ichas and Mazat, 1998; Bodrova et al., 2000). Можно полагать, что при инкубации митохондрий в KCl-среде выход Са и падение А\/, не связанные с действием ГДК, вызваны индукцией проницаемости внутренней мембраны органелл для Са + и К+.
В следующих экспериментах было изучено влияние применяемых нами сред инкубации на характер потребления кислорода митохондриями печени при 94- 94 последовательном добавлении Са и ГДК. Как видно на рис. 29, в отсутствие Са одна из а,одиоловых кислот - ТДК в концентрации 0-500 мкМ увеличивает до двух раз скорость не сопряженного с синтезом АТР дыхания митохондрий печени (кривая 2). В аналогичных условиях ГДК в концентрации 20 мкМ в сахарозной и в КС1- средах инкубации увеличивает скорость дыхания митохондрий не более чем на 10% (рис. 29, кривая 1).
Влияние Mg и спермина на набухание митохондрий печени, индуцированное Са2+иГДК
Нами установлено, что влияние ГДК как индуктора Са -зависимой ЦсА-нечувствительной поры в митохондриях печени регулируется с помощью физиологических модуляторов. Показано, что деэнергизация митохондрий, вызванная действием разобщителей окислительного фосфорилирования (ненасыщенными жирными кислотами), эффективно препятствует индукции поры ГДК и Са2+ (разд. 3.2.1. и 3.3.1.). Предполагается, что это связано с ингибированием энергозависимого транспорта Са2+ в митохондриальный матрикс. предполагается, связано с их способностью связывать Са . Поликатион спермин -известный блокатор классической ЦсА-чувствительной поры - в физиологической концентрации 1 мМ ингибировал и ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий печени, индуцированное последовательным добавлением Са2+ и ГДК (разд. 3.3.3.). Необходимо отметить, что подобным эффектом обладал и Mg . Нами предположено, что ингибирующее влияние ионов магния и спермина обусловлено их способностью экранировать отрицательные поверхностные заряды на внутренней мембране митохондрий, в том числе, образованные карбоксильными группами ГДК. Вместе с тем отмечено, что действие спермина может быть связано с его влиянием на транспорт кальция через внутреннюю мембрану митохондрий (Salvi and Toninello, 2004). БСА, способный связывать свободные жирные кислоты и тем самым препятствовать индукции Са2+-зависимой поры, ингибировал и ГДК-индуцированное набухание митохондрий (разд. 3.3.4.). Однако при одинаковом молярном соотношении БСА/жирная кислота ингибирующий эффект БСА был менее выражен при индукции поры ГДК, чем пальмитиновой кислотой. Это различие, по всей видимости, обусловлено тем, что БСА хуже связывает а,одиоловые кислоты, чем их монокарбоновые аналоги (Tonsgard and Meredith, 1991). 9+
Показано, что характер индукции поры Са и ГДК изменяется в зависмости от ионной силы окружающего раствора (разд. 3.4.). Установлено, что при инкубации митохондрий печени в сахарозной среде, выход Са2+ из митохондрий и падение А\/ наблюдаются только при добавлении ГДК и сопровождаются набуханием органелл. В отличие от этого при инкубации митохондрий в КС1 9+ среде выход Са и падение А\/ происходят в отсутствие ГДК, но только в присутствии этой жирной кислоты наблюдается набухание органелл. Предполагается, что при инкубации митохондрий в KCl-среде выход Са и падение А\/, не связанные с действием ГДК, могут быть вызваны индукцией
Выяснено, что при индукции поры ГДК и Са наблюдается освобождение цитохрома с из межмембранного пространства органелл, выход которого увеличивается с повышением ионной силы среды инкубации до физиологической (разд. 3.5.) и сопровождается блокадой транспорта электронов по дыхательной цепи (разд. 3.4.) вследствие элиминирования цитохрома с из дыхательной цепи. Кроме того, учитывая, что цитохром с, вышедший во внешнюю среду способен запускать процесс гибели клетки, предположено, что накопление а,одиоловых кислот в клетках печени может рассматриваться как один из факторов их гибели при различных патологических состояниях, связанных с нарушением метаболизма липидов.
В опытах на модельных мембранных системах - липосомах установлено, что а,о диоловые кислоты (среди них наиболее эффективно ГДК), подобно монокарбоновым жирным кислотам, способны индуцировать выход флуоресцентного зонда СрБ из везикул, что свидетельствует об пермеабилизации (разд. 3.6.). Отмечается, что ГДК/Са - индуцированный выход СрБ из везикул не связан с изменения фазового состояния мембраны липосом.
Таким образом, механизм Са -зависимой пермеабилизации липосом, индуцированной ГДК отличается от механизма хемотропного фазового перехода, который, как было показано ранее, лежит в основе пальмитат/Са индуцированной пермеабилизации липосом (Agafonov et al., 2003; 2007). В то же 9+ время выяснено, что добавление Са к липосомам, модифицированным ГДК, индуцирует слияние и/или агрегацию везикул, которая, как предполагается, сопровождается перестройкой мембраны липосом, образованием пор слияния и выходом СрБ из везикул.
Нами предположено, что описанный механизм формирования липидной поры при участии Са и ГДК реализуется и в митохондриях печени. Вероятно, ГДК в присутствии Са способна вызывать слияние внешней и внутренней мембран митохондрий, результатом чего может быть образование поры слияния. Это, в свою очередь, приводит к набуханию митохондрий. Такое слияние внешней и внутренней митохондриальных мембран в присутствии ГДК и Са , как предполагается, может происходить в зоне контактных сайтов митохондрий, где есть естественное сближение двух мембран.
