Введение к работе
Актуальность проблемы. Инициирование свертывания крови при деструкции тканей было обнаружено более полутора века назад/когда de Blainville в 1834 году наблюдал ускорение свертывания крови при её контакте с кусочками органов. Избыточное поступление разрушенных тканей в кровяное русло призодит к одному из наиболее частых неспедифических нарушений гемокоагуляции - дисееминированвоку внутри-сосудистому свертывали» (ДВС), которое осложняет многие патологические процессы, имеющие место при уирургических, агувэрских, гинекологических (В.И. Кулаков, 1982; ЬІІБзлуда, 1976; 3.Д «едорова, 1970; АД. Макацария, 1983),терапевтических (В. А Люсов,1976), инфекционных заболегаюшх, злокачественных опухолях (А К Филатов, 1953), шоке, омэгах (В.Д Бадуда, 1981), поеттранефузионных. осложнениях (R А Горбунова, 1981).
Для профилактики и лечения диссемгаированного внутрисосудистого свертывания необходимо детальвое изучение на молекулярном уровне структуры биологических мембран и механизма их взаимодействия с факторами свертнвавдэй системы плазмы крови. В настоявше время изучен биохимический состав мембран, способных активировать сЕертызавдую систему крови (J. A Hay vera", 1984; A Rehemtulla, 1991), определены кянзтические параметры зктиЕации "внутреннего" (В. Osterud, 1977; J. Rosing, 1988; F.ADcn&rose, 1979) и "внеинего" путей свертывания крови (S. D. Foriran, 190S; S. A Selverberg:, 1977; Е. Bjorklid, 1Э75; М. Zur, 1980). Однако для понимания молекулярных механизмов перехода
_ 4 -мембранных структур, обладающих гемокоагуляционной акгивностьэ, ,из латентной ь активную форму, необходимо исследование данамичесюи конформационных изменений как плазменных факторов свертывания, так и самих биологических мембран.
Общепринято, что проявление тромбопластической активности (инициирование внешнего пути через фактор УП) для соматических юеток возможно в результате травматического воздействия на ткань . Большинство исследователей изучают этот вопрос путем регистрации количественных изменений в системе ферментативного каскада гемокоагуляшш, происходящих после повреждения плазматических мембран, отдельных изолированных клеток, тканей, органов. Изменения в структуре мембран на уровне липид-белок при этом, как правило,.не исследуются.
Цель исследования. Ставилась цель изучить фазовое состояние и динамические свойства липидного и белкового компонентов липопротеидных комплексов, обладающих громбопластической активностью, а также корреляцию между деструкцией тканей, биологических мембран и инициированием свёртывания крови.
Задачи исследования:
-
исследовать корреляцию между деструкцией тканей и инициированием свёртывания крови.
-
Шлучить референтную плазму и разработать тест-систему, специфически чувствительную к мембранным структурам, обладающим тромбопластической активностью.
-
Исследовать тромбрлластическую активность нормальных и опухолевых тканей.
-
Изучить структуру и молекулярный механизм тепловой, протеолитической и химической инактивации тканевого тромбопластина из головного мозга человека.
-
изучить влияние деструкции на динамические свойства клеточных мембран.
Научная шзкака. В результате исследований расшрен перечень нозологических форм заболеваний, при которых для диагностики деструкции тканей можно применять, определение в крози активности 5'- нуклеотидазы, содержания ц-АЫЕ, ЩФ, ШР-регистрируемых парамагнитных центров, величины коэффициента церулоплазиин/трансферрин и значений времен ЯМР-1Н (Т1.Т2) релаксации.
Разработана тест-система для определения
троа5ошга.стической активности мембранных структур. Установлено, что тромбэндастическая активность мембран ыокет ингибироваться нативными компонентами тканей.
Изучена ; динамическая структура препарата тканевого тро;д5опластика из головного мозга человека; исследован молекулярный ыэгакизм его тепловой, протеолитической и хшнческой инактивации.
Изучено звганне деструкции на фазовое состояние и динамические свойства липидного и бгдкового компонента кэкбран, обдвлеяцих тромбопластической актинностыш
Заработаны требования к потенциальным лечебным препаратам, которые ыогут быть использованы в качестве ингибиторов тканевого тро\55опластина.
Практическая я теоретическая цгГЕгоеть шелэдованхя. Полученные данные позволяют шире применять использованные нами маркёры в практической работе лечебных учереждений для
- 6 -лабораторной диагностики деструктивных процессов в организме человека и. для контроля за эффективностью лечения.
Используемые в нашей работе методы определения деструкции тканей внедрены в городской противотуберкулезной больнице и научно-практическом объединении "Онкология" г. Казани,
lb материалам данной работы под руководством диссертанта защищена кандидатская диссертация (К гос. регистрации - 01.8. SO. 045100, Москва, 1993 г.) с практической направленностью на тему "Оценка активности костно-суставного туберкулеза по маркёрам альтерации тканевых структур".
Разработанная тест-система по определению
тромбопластической активности мембран может использоваться клиническими лабораториями в амбулаторных и стационарных условиях.
Выявленная способность димексида ингибировать летальный эффект тканевого тромбопласгина in vivo (получено положительное решение по заявке аз 4907534/14(010494) на патент "Применение димексида в качестве вещества, ингибиругацего активность тканевого тромбопдастина") может быть использована для поиска лечебных средств по профилактике и лечению нарушений гемостаза в клинической практике.
Оолученные результаты затрагивают фундаментальные вопросы теории свертывания крови и могут быть использованы при изучении молекулярных механизмов инициации гемокоагуляции.
Положения, вьдекгаеые на зацету. 1. Пусковым моментом тромбопластической реакции является контакт фактора VII с поверхностью апопротеид Ш-содержашей клеточной мембраны. Если это сопровождается повреждением
- 7 -клеток, то увеличивается число контактирующих с плазмой крови центров связывания и активации фактора VII. Фпсфолипиды при этом реорганизуются из бмамеллярной в гексагональную (НИ), мкцеллярную или в какую-то иную лиотропную мезофазу и возрастает подвкыгость яирнокислотних радикалов липидов. Удельную тромбоїіластическую активность мембраны, помимо числа центров связывания фактора VII определяет специфичность ориентации фосфолипадов вокруг алояротевда Ш. Это зависит как от динамического ^информационного состояния апояротеида III, так и от состава самое пограничных фосфолипидов.
-
Клеточные мембраны не следует рассматривать как чисто механическую матрицу с определинкой мозаикой зарядов, на поверхности которой идеї свёртывание, т.к. нормальные и опухолевые клетки обнаруживают способность к регуляции гемокоагуляции. Регуляция происходит не только за счёт физической перестройки плазматической мембраны в результате изменения фазового состояния, диффузии, флуктуации плотности, вращгния, "флип-флопа" липидов и белков, но и за счет синтеза de novo белковых и лилидных факторов, экспрессируемых на поверхность клетки и активно воздействующих на реакции свёртывающей и противосвёртдаающей систем крови.
-
Схема, описывающая инициирование диссеминироваяного виутрисосудистого свёртызаяия, мояет быть представлена как "деструкция тканей - тромбопдасгин- и фосфолипидемия-иницаирование свёртшашга". Трсмбопласгичес;ая активность фрагментов мембран кожт ингибироваться нативкыш компонентами тканей. Свёртывание крови и отлокенпе фибрина г тканях возможно и без повреждения клеток. Инициирующим моментом этого процесса является увеличение проницаемости сте-
- 8 -нок сосудов к контакт плазмы с поверхностью клеток, расположенных экстраваскулярно.
Апробацяя работы. Материалы докладывались на: VII Республиканской конференции молодых ученых (Казань, 1987), выездном заседании Центрального совета Всесоюзного биохимического общества (Казань, 1988), Всесоюзной конференции "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве" (Еазань, 1988), научно-практических конференциях по внелегочвому туберкулезу (Тула, 1988; Иваново, 1989; Калининград. 1991; Казань. 1992). международной конференции "Клеточная патология и фармакология" (Budapest , 1988), XXIV конгрессе Ампера (Poznan , 1988), 9-ом специализированном коллоквиуме Ампера "Магнитный резонанс в полимерах" (Prague, 1989), XIX Европейском конгрессе по '^молекулярной спектроскопии (Dresden . 1989), втором Всесоюзной совещании "Длффузия молекул" (Казань, 1990).
Дублкеззри. По теме диссертация олу&шковано 35 работ, 3 работы принята в печать.
Структура и объем работы. Выполненное исследование является частью плановой научней работы кафедры биохимии КГШ им. СЕ Мурашова по изучению ключевых реакций системы гемостаза (номер государственной регистрации 0188.0077072).