Цинк-индуцированное взаимодействие амилоида- с нуклеиновыми кислотами Хмелева Светлана Александровна

Содержание к диссертации

Введение

1. Введение 5

1.1. Актуальность темы исследования 5

1.2. Степень разработанности темы исследования 5

1.3. Цель и задачи исследования 7

1.4. Научная новизна работы 8

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы 8

1.6. Методология и методы исследования 9

1.7. Положения, выносимые на защиту 9

1.8. Степень достоверности и апробация результатов 10

1.9. Структура и объем диссертации 10

2. Обзор литературы 11

2.1. Роль амилоида- в патогенезе болезни Альцгеймера 11

2.1.1. Болезнь Альцгеймера – клинические проявления и патоморфологические характеристики 11

2.1.2. Протеолитический процессинг АРР и изоформы -амилоидного пептида 12

2.1.3. Агрегаты и олигомеры амилоида- 14

2.1.4. Гипотеза амилоидного каскада 20

2.1.5. Внутриклеточный амилоид-

2.2. Взаимодействие нуклеиновых кислот с амилоидом- 24

2.3. Роль ионов цинка в возникновении и развитии болезни

Альцгеймера 28

2.3.1. Гомеостаз цинка и болезнь Альцгеймера 28

2.3.2. Влияние оксидативного и нитрозирующего стрессов на внутриклеточный гомеостаз цинка 30

2.3.3. Взаимодействие ионов цинка с мономерной и агрегированными формами амилоида- 32 2.3.4. Цинк-индуцированная агрегация амилоида- 36

2.3.5. Роль гистидиновых остатков металл-связывающего домена в цинк-индуцированной агрегации амилоида-

2.4. Физико-химические методы характеризации агрегатов амилоида- 40

2.5. Исследование межмолекулярных взаимодействий методом поверхностного плазмонного резонанса 43

3. Материалы и методы исследования 46

3.1. Объекты и материалы 46

3.1.1. Реагенты и буферные растворы 46

3.1.2. Синтетические пептиды 46

3.1.3. Агрегаты амилоида- 49

3.1.4. Нуклеиновые кислоты 50

3.1.5. Сульфированные и несульфированные полисахариды 53

3.2. Методы исследований 54

3.2.1. Биосенсорный анализ с использованием эффекта поверхностного плазмонного резонанса 54

3.2.2. Турбидиметрия 56

3.2.3. Динамическое рассеяние света 57

3.2.4. Флуориметрия с использованием красителя «тиофлавин Т» 57

3.2.5. Электрохимический метод 58

3.2.6. Седиментационный анализ и ультрафильтрация 59

4. Результаты и обсуждение 62

4.1. Металл-связывающий домен как цинк-зависимый сайт

взаимодействия амилоида- с нуклеиновыми кислотами 62

4.1.1. Цинк-индуцированное взаимодействие пептидов, моделирующих металл-связывающий домен, с нуклеиновыми кислотами 62

4.1.2. Влияние точечных мутаций на цинк-индуцированное взаимодействие металл-связывающего домена А с нуклеиновыми кислотами 69

4.1.3. Влияние цинк-индуцированной олигомеризации модельных пептидов А16 на их взаимодействие с нуклеиновыми кислотами 74

4.1.4. Роль аминокислотных остатков гистидина в цинк-индуцированном взаимодействии А16 с нуклеиновыми кислотами 83

4.2. Эффект ионов цинка на взаимодействие нуклеиновых кислот с фибриллярными агрегатами амилоида- 86

4.2.1. Характеризация фибриллярных агрегатов амилоида- 88

4.2.2. Влияние ионов цинка на связывание нуклеиновых кислот с фибриллярными агрегатами амилоида- 96

4.2.3. Стабильность комплексов ДНК с фибриллярными агрегатами амилоида-: эффект ионов цинка 102

4.3. Связывание нуклеиновых кислот с цинк-индуцированными агрегатами амилоида- 107

5. Заключение 116

6. Выводы 118

7. Список сокращений и условных обозначений 119

8. Список цитируемой литературы 121

Благодарности

• Степень разработанности темы исследования
• Внутриклеточный амилоид-
• Агрегаты амилоида-
• Эффект ионов цинка на взаимодействие нуклеиновых кислот с фибриллярными агрегатами амилоида-

Введение к работе

Актуальность темы исследования Болезнь Альцгеймера (БА) – прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, частота встречаемости которого резко увеличивается с возрастом, начиная с 65 лет. Количество пациентов с диагнозом БА в мире постоянно растёт и сегодня составляет около 40 млн. человек (). В Российской Федерации количество больных БА c разными стадиями развития заболевания может достигать полумиллиона человек [Белоусов и соавт., 2009]. Несмотря на значительные усилия, направленные на поиск средств лечения БА, до настоящего времени не предложено лекарства, которое могло бы существенно замедлить, остановить или предотвратить развитие данного заболевания [Han et al., 2014; Кухарский и соавт., 2015]. Как правило, стратегия поиска средств терапии БА основывается на предположениях о том, какие молекулярные события являются ключевыми для развития болезни [Carter et al., 2010; Кухарский и соавт., 2015; Maloney et al., 2016]. Именно недостаточность знаний о механизмах патогенеза БА, о молекулярных патогенах болезни и мишенях их воздействия в значительной степени определяет сегодня неудачи поиска средств лечения данного заболевания [Han et al., 2014]. Это делает актуальным дальнейшее углубление знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе БА, с целью корректировки стратегий поиска терапевтических средств лечения данного заболевания.

Степень разработанности темы исследования Согласно ведущей гипотезе возникновения и развития БА, известной как «амилоидный каскад», ключевым событием в возникновении и развитии болезни является переход амилоида- (А; пептид, представленный у человека различными изоформами длиной от 38 до 42 аминокислотных остатков) из мономерного состояния в агрегированное [Haass & Selkoe, 2007]. In vivo процесс агрегации заканчивается формированием в паренхиме головного мозга "сенильных бляшек" – отложений округлой формы, состоящих из фибриллярного А и являющихся отличительным признаком БА. В последние десятилетие всё возрастающее внимание привлекает роль внутриклеточного амилоида- (вкА) в патогенезе БА [Gouras et al., 2010; Wirths & Bayer, 2012; Ji et al., 2016]. Сегодня существуют многочисленные работы, выполненные на трансгенных мышах и крысах, которые демонстрируют прямую связь между накоплением вкА в нейронах и их гибелью (суммированы, например, в [Cuello & Canneva, 2008; Wirths & Bayer, 2012]).

Предполагается, что вкА может вызывать гибель нейронов, взаимодействуя с геномной ДНК, что приводит к нарушению её нормальной экспрессии [Jimenez, 2010; Camero et al., 2013]. Присутствие вкА в клеточном ядре было показано в ряде исследований [Johnstone et al., 1996; Buckig et al., 2002; Ohyagi et al., 2005; Bailey et al., 2011; Barucker et al., 2014]. Известно, что в условиях in vitro А способен взаимодействовать с ДНК [Ahn et al., 2000; Hegde et al., 2004; Ohyagi et al., 2005; Yu et al., 2007; Barrantes et al., 2007; Geng et al., 2010;

Barrantes et al., 2012; Maloney et al., 2011; Gupta et al., 2013; Camero et al., 2013], причем именно агрегаты А, но не его мономерная форма, вовлечены в это взаимодействие [Ahn et al., 2000; Barrantes et al., 2007]. Известно также, что агрегаты A способны взаимодействовать с молекулами РНК [Ahn et al., 2000] и, таким образом, агрегаты A, локализованные в цитоплазме перикариона [Nagele et al., 2002], могут потенциально интерферировать с нормальным транспортом информационной РНК из ядра в цитоплазму, как это показано для ряда амилоидоподобных белковых агрегатов [Woerner et al., 2016].

Общепринято, что цинк занимает особое место в патогенезе БА [Bush & Tanzi, 2008; Faller et al., 2013]. Цинк находят в значительном количестве в сенильных бляшках [Lovell et al., 1998; Miller et al., 2006], а in vitro он вызывает быструю агрегацию А [Faller et al., 2013]. Ионы цинка (Zn²⁺) образуют комплексы (со стехиометрией 1:1) с металл-связывающим доменом А (N-концевой фрагмент А, включающий аминокислотные остатки 1-16), где они координированы гистидиновыми остатками Н6, Н13 и Н14 пептида [Куликова и соавт., 2015]. Внутри нейронов концентрация цинка составляет около 250 М [Colvin et al., 2008]. Хотя практически весь внутриклеточный цинк (вкZn²⁺) связан металлотионеинами (МТ), в условиях оксидативного и/или нитрозирующего стрессов наблюдается существенное высвобождение вкZn²⁺ из комплекса с МТ, приводящее к появлению свободного цинка в клеточной цитоплазме [Cuajungco & Lees, 1998; Sensi et al., 2008]. Кроме того, нитрозирующий стресс приводит к транслокации МТ в клеточное ядро и внутриядерному высвобождению вкZn²⁺ [Spahl et al., 2003]. Таким образом, в условиях оксидативного и/или нитрозирующего стрессов, которые ассоциированы с возникновением и развитием БА [Kim et al., 2015; Togo et al., 2004], цинк может быть доступен для связывания с вкА. Может ли такое связывание модулировать взаимодействие вкА с ДНК и РНК, не известно. Установление факта модулирующего эффекта Zn²⁺ на взаимодействие А с молекулами ДНК и РНК, а также деталей физико-химического механизма, определяющего такой моделирующий эффект, дополнят имеющиеся знания молекулярного механизма патогенеза БА и позволят выявить новые потенциальные мишени терапевтического воздействия для создания средств лечения этого тяжёлого заболевания.

Цель и задачи исследования Цель работы – установить, как ионы цинка влияют на взаимодействие агрегатов А с нуклеиновыми кислотами (НК) in vitro и выяснить механизм взаимодействия. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить, является ли металл-связывающий домен А цинк-зависимым сайтом взаимодействия пептида с НК, используя синтетические пептиды А₁₆, моделирующие металл-связывающий домен А.

2. Оценить роль электростатических взаимодействий в формировании цинк-зависимых

комплексов металл-связывающего домена А с биологическими полианионами, используя

НК и сульфированные и несульфированные полисахариды.

3. Выяснить, как ионы цинка влияют на связывание НК с фибриллярными агрегатами синтетического полноразмерного -амилоидного пептида длиной 42 аминокислотных остатка (А₄₂).

4. Провести экспериментальный анализ связывания НК с цинк-индуцированными агрегатами А₄₂.

5. Используя мутантные формы пептидов А₄₂ и А₁₆, выяснить роль остатков гистидина, участвующих в координации ионов цинка, в цинк-индуцированном взаимодействии -амилоидных пептидов с НК.

Научная новизна работы В работе впервые проведён экспериментальный анализ взаимодействия НК с агрегатами А₄₂ и его мутантных форм, находящихся в комплексе с ионами цинка. Установлено, что НК связываются с цинк-индуцированными агрегатами А₄₂, и что ионы цинка значительно усиливают связывание НК с предформированными фибриллярными агрегатами пептида, приводя к появлению высокоаффинных сайтов связывания на поверхности фибрилл. Впервые показано, что металл-связывающий домен А может являться цинк-зависимым сайтом взаимодействия пептида с молекулами ДНК и РНК. Обнаружено, что аминокислотная замена Н6R, влияющая на координацию иона цинка в металл-связывающем домене А, снижает как способность пептида А₄₂ агрегировать под воздействием ионов цинка, так и способность металл-индуцированных агрегатов пептида связывать НК. Впервые установлено, что металл-связывающий домен А способен взаимодействовать в присутствии ионов цинка с различными полианионами, что указывает на электростатическую природу взаимодействия.

Теоретическая и практическая значимость работы В результате выполнения диссертационной работы было установлено, что ионы цинка оказывают существенное влияние на взаимодействие агрегатов А с НК. Полученные результаты создают предпосылку для исследования взаимодействия агрегатов внутриклеточного А с геномной ДНК и информационной РНК нейронов в условиях нормального и нарушенного гомеостаза внутриклеточного цинка и указывают на внутриклеточный цинк как новую потенциальную мишень для терапевтического воздействия при лечении БА.

Методология и методы исследования В работе были использованы современные физико-
химические методы исследования биологических макромолекул: биосенсорый анализ,
основанный на эффекте плазмонного поверхностного резонанса, лазерная корреляционная
спектроскопия (динамическое рассеяние света), флуориметрия с использованием
флуоресцентных красителей, турбидиметрический и электрохимический методы,

седиментационный анализ и ультрафильтрация.

Положения, выносимые на защиту

1. Металл-связывающий домен является цинк-зависимым сайтом взаимодействия амилоида- с НК. Взаимодействие синтетических пептидов, модулирующих металл-связывающий домен, с НК критически зависит от координации иона цинка остатками гистидинов Н6 и Н13 пептида.

2. Взаимодействие металл-связывающего домена амилоида- с НК имеет электростатическую природу и предполагает формирование анион-связывающего сайта при координации иона цинка аминокислотными остатками металл-связывающего домена.

3. Ионы цинка значительно усиливают связывание молекул НК с фибриллярными агрегатами амилоида-, приводя к появлению высокоаффинных мест связывания на поверхности амилоидных фибрилл.

4. Цинк-индуцированные агрегаты амилоида- связывают молекулы НК, причём взаимодействие зависит от участия остатка гистидина Н6 пептида в координации ионов цинка.

Апробация работы Результаты работы докладывались на следующих научных конференциях: I Всероссийская интернет-конференция с международным участием «Биологические основы психических расстройств» (Казань, 15 – 16 мая 2012 г.), 12th International Conference AD/PD “Mechanisms, Clinical Strategies, and Promising Treatments of Neurodegenerative Diseases” (Nice, France, March 2015), Конференция молодых учёных ИБМХ (Москва, 26 мая 2015 г.), 20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 18-22 апреля 2016 г.).

Публикации Результаты настоящей работы представлены в 10 публикациях, включающих 3 статьи в российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежном рецензируемом профильном журнале и 5 тезисов докладов в сборниках трудов научных конференций.

Личное участие автора в получении научных результатов Основные результаты диссертационной работы получены автором лично или при её непосредственном участии.

Структура и объем диссертации Материал диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 230 источников. Диссертация содержит 37 рисунков и 7 таблиц.

Степень разработанности темы исследования

БА является наиболее частой причиной деменции в пожилом и старческом возрасте и характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств [1]. В группу риска входят люди старше 55-ти лет, причём появление этого заболевания не зависит ни от национальности, ни от социального статуса [20, 25]. Частота возникновения БА нарастает с возрастом – заболевание диагностируется примерно у 11% лиц старше 65 лет, достигая 32% у лиц старше 85 лет. Болезнь медленно прогрессирует и заканчивается летальным исходом через 5-15 лет, как правило, из-за поражения психомоторных функций и остановки дыхания [1].

Патоморфологически БА характеризуется экстраклеточными амилоидными отложениями (синильные бляшки), состоящими в основном из -амилоидных пептидов длиной 40 и 42 аминокислотных остатка (а. о.), и образованием внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, состоящих из тау-белка [82]. Впервые такие характерные включения в нервной ткани были описаны психиатром Алоисом Альцгеймером в 1907 г., который наблюдал их в постмортальных образцах головного мозга своей пациентки. Их наличие до сих пор является основным критерием для установления или подтверждения диагноза БА [1, 82]. Тем не менее, ряд других нейродегенеративных расстройств также характеризуется образованием нерастворимых амилоидных отложений. Такие болезни относят к группе заболеваний, известных как «протеинопатии» [5], в основе патогенеза которых лежат изменения структуры и/или нарушение метаболизма определенных белков или пептидов, приводящие к формированию их патогенных агрегатов с последующим образованием характерных гистопатологических белковых или пептидных отложений. Применительно к БА, роль нерастворимых амилоидных отложений как возможных патогенов остается неясной. Так, проведённые исследования не выявили сколь-либо значительной корреляции между степенью когнитивных нарушений у пожилых людей и количеством синильных бляшек [68, 134].

Другая характерная черта БА – потеря холинергических нейронов в области мозга, отвечающей за обучение, память, регуляторные функции, поведение и эмоциональные реакции. Считается, что появление амилоидных бляшек может влиять на взаимодействие между нейронами в синапсах, разрушая аксоны и дендриты сначала преимущественно в энторинальной коре (медиобазальные отделы лобных долей) и распространяясь затем на структуры гиппокампа, височную кору и базальные ганглии [1]. Дистрофичные нейриты встречаются как внутри амилоидных бляшек, так и непосредственно возле них. Они часто растянуты и скручены, а также могут содержать структурные аномалии [177]. Предполагается, что амилоидные бляшки не оказывают прямого нейротоксического воздействия на нейроны, а скорее являются резервуаром для растворимых олигомеров А, способных диффундировать в межклеточном пространстве и оказывать цитотоксическое воздействие на нейроны [77].

А является продуктом протеолитического процессинга трансмембранного белка типа 1, известного как "белок-предшественник -амилоида" (amyloid precursor protein, APP). APP и две его гомологичные формы – APLP 1 и APLP 2 (APP-like proteins) – формируют семейство белков, участвующих в молекулярных процессах, связанных с перинатальным и постнатальным развитием и межклеточной коммуникацией [10]. Также предполагается, что АРР может быть вовлечён в гомеостаз ионов металлов, таких как цинк, медь и железо [23, 58]. АРР подвергается протеолитическому расщеплению -секретазой в районе трансмембранного домена и -секретазой в области, прилегающей к трансмембранному домену с N-конца [69] (рис. 1). В то время как сайт расщепления -секретазы строго определён (Met671/Asp672), -секретаза может действовать по различным сайтам. Как результат, образуются изоформы -амилоидного пептида длиной от 37 до 43 а. о., различающиеся протяжённостью полипептидной цепи на С-конце. При этом N-концевая

Рис. 1. Схема образования различных изоформ A в результате протеолитического процессинга APP – белка-предшественника A – -, - и -секретазами. часть пептида, представленная аминокислотными остатками 1-28, относится к экстраклеточному домену АРР, в то время как оставшаяся С-концевая часть – к трансмембранному домену белка [178]. В результате действия другой секретазы – известной как -секретаза – и -секретазы происходит образование пептида, который не способен агрегировать и формировать амилоидные отложения (так называемый «неамилоидогенный» путь процессинга АРР) [111]. При совместном действии - и -секретаз также возможно образование более коротких изоформ длиной от 14 до 16 а. о., представляющих N-концевую часть А [172]. А, продуцируемый в процессе протеолитического процессинга АРР, секретируется в межклеточное пространство и циркулирует в крови и спинномозговой жидкости. Длительное время А рассматривался как «биологический мусор» [2]. Его физиологическая функция точно не определена и до настоящего времени, хотя существуют работы, указывающие на его возможную роль в разнообразных биологических процессах: регуляции ионного транспорта [104] и транспорта холестерина [223], регуляции транскрипции ряда генов [12] и синаптической активности [100], участии в системе врождённого иммунитета [187].

Изучение растворимого A , выделенного из клеток и спинномозговой жидкости, и нерастворимого A , выделенного из мозга пациентов с БА, показало, что существует множество форм A с широким спектром C- и N-концевой гетерогенности [69, 172]. В спинномозговой жидкости человека изоформа А длиной 40 а. о. (А40) является количественно доминирующей формой А, за которой следуют изоформы А38 и А42 [135, 172, 217]. Также присутствуют в незначительном количестве другие изоформы: A 28, A 33, A 34, A 37, A 39 [69]. Несмотря на то, что концентрация А40 может превышать концентрацию А42 в спинномозговой жидкости более чем в десять раз [142], в сенильных бляшках паренхимы головного мозга наиболее представленной формой А является А42 [72, 75, 91]. Предполагается, что именно изоформа А42 и её агрегация играют центральную роль в патогенезе БА [80].

Внутриклеточный амилоид-

Для мониторинга как спонтанной, так и цинк-индуцированной агрегации А и характеризации формирующихся агрегатов используются разнообразные физико-химические методы, которые позволяют оценивать размеры агрегатов, их структуру и морфологию. Одновременное использование нескольких методов, позволяющих получать взаимодополняющие данные об агрегатах А рассматривается как наиболее оптимальный экспериментальный подход к исследованию процесса агрегации -амилоидных пептидов in vitro [26].

Наиболее простым в техническом отношении методом мониторинга агрегации А является турбидиметрический метод, основанный на измерении значения оптической плотности растворов А на длинах волн 400-450 нм. Оптическая плотность в этом диапазоне длин волн определяется рассеянием света крупными частицами (мутность). Хотя метод прост и не требует специализированного оборудования, он обладает низкой чувствительностью и, как считается, позволяет детектировать образование только крупных агрегатов А [47, 221]. Это накладывает дополнительные ограничения на информативность турбидиметрического метода. Если размеры агрегатов превышают 1/10 длины волны рассеянного света (т. е. рассеяние света, определяющее мутность раствора, не является рэлеевским), то его зависимость от размера, формы, концентрации и оптических характеристик формирующихся агрегатов имеет крайне сложную форму [157]. Турбидиметрический метод, таким образом, не позволяет оценить размер агрегатов А по величине оптической плотности и является только качественным индикатором наличия агрегатов А в растворе.

Для оценки размера формирующихся агрегатов А часто используется метод динамического рассеяния света (ДРС) [26, 33, 128]. ДРС позволяет определять коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Далее из коэффициента диффузии рассчитывается гидродинамический радиус частиц (R) по формуле Стокса-Эйнштейна, которая связывает размер частицы с коэффициентом диффузии (D);

D = к&Т/в-rj-R где кв - константа Больцмана, Т - абсолютная температура, ц - вязкость жидкости. Использование формула Стокса-Эйнштейна предполагает, что частицы имеют сферическую форму. Для полидисперсной популяции частиц метод даёт распределение частиц по размеру. Это происходит с помощью компьютерной программы CONTIN, которая использует заданный математический алгоритм, позволяющий из всех возможных распределений выбрать то, которое наилучшим образом описывает экспериментально определяемую корреляционную функцию [128]. Применительно к агрегатам А, их гетерогенная (по размеру и форме) популяция, присутствующая в растворе, аппроксимируется полидисперсной популяцией сферических частиц. Как результат, средний размер агрегатов А выражается в терминах «диаметра».

Наиболее технически простым, недорогим и, как следствие, наиболее распространённым методом оценки наличия фибриллярных структур А in vitro является метод, основанный на использовании флуоресцентного красителя «тиофлавин Т» [175]. Молекула тиофлавина Т состоит из двух ароматических колец, связанных С-С связью (рис. 10).

Рис. 10. Структурная формула флуоресцентного красителя «тиофлавин Т». Стрелкой показана С-С связь, которая обеспечивает возможность свободного вращения ароматических колец красителя относительно друг друга.

Свободное вращение колец относительно друг друга приводит к тушению флуоресценции. Тиофлавин Т имеет высокое сродство к белкам и белковым агрегатам с -листовой структурой, и, в особенности, к фибриллам А с кросс--листовой структурой [9, 175]. При связывании с фибриллами А происходит фиксация положения колец молекулы тиофлавина Т относительно друг друга. Как следствие, длина волны максимума спектра возбуждения сдвигается с 385 нм на 450 нм, при этом максимум спектра испускания сдвигается с 455 нм на 482 нм, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции тиофлавина Т на 480-485 нм в десятки раз [9]. Электрохимический метод стал использоваться для мониторинга процесса агрегации А относительно недавно. Впервые возможность электрохимической детекции агрегации А40 и А42 была показана в 2005 г. в работе [208]. Метод основан на регистрации электрохимического окисления единственного остатка тирозина, находящегося в положении 10 полипептидной цепи А (Y10). Окисление тирозина приводит к появлению на вольт-амперной кривой пика при потенциале максимума около 0,6-0,7 В (отн. Ag/AgCl). При включении пептидов в агрегат часть остатков Y10 оказывается экранированной от контакта с поверхностью электрода другими аминокислотами – окисляться могут только остатки, находящиеся на поверхности белка [194] – что приводит к снижению величины сигнала окисления по мере роста количества и размера агрегатов [208].

Агрегаты амилоида-

Зависимость начения сигнала ППР-биосенсора R от концентрации пептида А16-отк в инжектируемом растворе. HEPES-буфер (10 мМ HEPES, 45 мМ NaCl, 5 мМ KCl, pH 6,8), дополненный 1 мМ Zn2+. Тёмные круги – rd-ДНК, светлые – poly(dA)poly(dT). Вставка показывает участок графика, ограниченный пунктирными линиями. приближаясь к насыщению при концентрациях выше 80 мкМ (рис. 19). Такой характер концентрационной зависимости контрастирует с ожидаемым медленным ростом R в области концентраций 0-80 мкМ, основываясь на миллимолярных значениях KD (табл. 3) в предположении, что связывание пептида с ДНК подчиняется уравнению Лангмюра (т.е. молекулы аналита взаимодействуют независимо с каждым сайтом связывания на молекуле лиганда). Действительно, в этом случае величина сигнала биосенсора R должна меняться с концентрацией [P] аналита в растворе (в данном случае – пептида А16-отк) как [136]: R / Rmax = [P] / ([P] + KD), (3) где Rmax – значение сигнала биосенсора при насыщении комплексов аналит/лиганд. Формальная аппроксимация уравнением 3 экспериментальной зависимости на рис. 19 (показана на рисунке пунктирной линией) даёт значения Rmax и KD, равные соответственно 98000 RU и 0,5 мМ (аппроксимацию проводили с помощью программы SigmaPlot (Systat Software, США), используя метод нелинейной регрессии). Полученные таким образом значения KD заметно отличаются от значений, полученных из кинетики связывания А16-отк с rd-ДНК и poly(dA)poly(dT) (табл. 3). Более того, как будет показано ниже, величина Rmax оказывается не имеющей физического смысла, если предполагать независимое взаимодействие пептидных молекул с сайтами связывания на молекуле ДНК.

Известно, что связывание одинакового весового количества белка или ДНК с рабочей поверхностью ППР-биосенсора приводит к одинаковому изменению сигнала биосенсора [56]. Это позволяет рассчитать молярное соотношение пептид/ДНК в комплексе по формуле: RPMWDNA / RDNAMWP, (4) где RP и RDNA – сигналы биосенсора при, соответственно, связывании пептида и иммобилизации ДНК, а MWP и MWDNA – молекулярные массы пептида и молекулы ДНК (1955 Да для А16-отк и 48 кДа для дуплексов ДНК длиной 75 п.о., исходя из средней молекулярной массы пары оснований 640 Да). «Количество» ДНК, иммобилизованной на рабочей поверхности оптического чипа ППР-биосенсора, во всех экспериментах лежало в пределах 900-1100 RU и может быть принято как равное в среднем 1000 RU. Таким образом, на одну молекулу ДНК в насыщении (Rmax = 98000 RU) будет приходиться около 2400 молекул пептида или 32 молекулы пептида на пару оснований. Очевидно, такое количество молекул пептида не может связаться с ДНК при условии независимого взаимодействия каждого пептида с сайтами связывания на ДНК. Даже для значения R 18000 RU, соответствующего концентрации пептида 80 мкМ, оценка молярного соотношения пептид/ДНК в комплексе в соответствии с уравнением 4 даёт около 6 молекул пептида на пару оснований ДНК – количество, которое не может быть связано непосредственно с парой оснований из-за стерических ограничений. Таким образом, стехиометрия комплексов А16-отк-ДНК (особенно формирующихся при относительно высоких концентрациях пептида – 30 мкМ и более) в совокупности с отклонением концентрационной зависимости цинк-индуцированного взаимодействия А16-отк с ДНК от модели Лангмюра и наличием концентрационного порога взаимодействия (5 мкМ пептида), указывают на то, что связывание пептида с ДНК может требовать не только образования комплексов Zn2+-А16-отк, но и олигомеризации пептида.

Что бы подтвердить важную роль цинк-индуцированных олигомеров А16-отк в связывании пептида с ДНК, был проведён сравнительный биосенсорный анализ формирования комплексов, используя пептид А16--отк с «открытыми» и пептид А16 с «закрытыми» (ацетилированными и амидированными) концами (табл. 1). Данная модификация концевых аминокислотных остатков делает пептид существенно более устойчивым к цинк-индуцированной преципитации [113] и, следовательно, цинк-индуцированной олигомеризации. Как видно из рис. 20, в присутствии 1 мМ Zn2+ пептид А16 связывается с различными молекулами ДНК (rd-ДНК, poly(dA)poly(dT) и p(dT)75) гораздо слабее, чем А16-отк, подтверждая, таким образом, важную роль олигомеризации модельных пептидов А16-отк и А16 в их цинк-индуцированном связывании с ДНК.

Олигомеризация может объяснить существенное различие в эффективности связывания пептида А16-отк с ДНК в присутствии 1 мМ ионов цинка в сравнении с медью (рис. 12), также образующей комплексы с металл-связывающим доменом А [59]. При значениях рН, близких к нейтральному, Zn2+ индуцирует агрегацию А16-отк с значительно большей эффективностью, чем Cu2+ [151]. Кроме того, в работе [112] было показано, что при рН 6,8 цинк вызывает димеризацию А16, в то время как Cu2+ – нет.

В концентрационной области ниже 20 мкМ связывание А16-отк с rd-ДНК и poly(dA)poly(dT) различается (вставка на рис. 19). Поскольку rd-ДНК имеет область со случайной последовательностью, то можно предположить, 16 8 0 12 4

Зависимость сигнала ППР-биосенсора R от концентрации пептида в инжектируемом растворе. Темные круги – А16-отк; светлые круги – А16. HEPES-буфер (10 мМ HEPES, 45 мМ NaCl, 5 мМ KCl, pH 6,8), содержащий 1 мМ Zn Иммобилизованный лиганд: А – rd-ДНК; Б – poly(dA)poly(dT); В – p(dT)75. что в силу огромного количества возможных комбинаций нуклеотидов среди молекул rd-ДНК могут оказаться такие, чьи последовательности имеют более высокую аффинностью к комплексам цинка с А16-отк в сравнении с poly(dA)poly(dT). Однако более вероятной причиной наблюдаемого различия в эффективности связывания может быть наличие в rd-ДНК некомплементарных участков, где ДНК является одноцепочечной. Действительно, rd-ДНК была получена с помощью ПЦР. При этом на последних циклах ПЦР возможно формирование дуплексов за счёт спаривания комплементарных фланкирующих участков цепей с фиксированными последовательностями, в то время как участки со случайной последовательностью могут оказаться некомплементарными. Как видно из рис. 20, однонитевая ДНК (p(dT)75) связывает А16-отк более эффективно в присутствии 1 мМ Zn2+, чем rd-ДНК и дуплекс poly(dA)poly(dT), особенно в области низких концентраций пептида.

Наблюдаемое цинк-индуцированное взаимодействие пептида А16-отк с ДНК является слабым – значения KD лежат в миллимолярной области (табл. 3). В концентрационной области 5-20 мкМ в среднем менее одной молекулы А16-отк связано с парой оснований в комплексе пептид-ДНК, а в условиях, при которых определялись значения KD (табл. 3, R 150 RU), 1 пептид приходится на 20 и более пар оснований. Можно предположить, что взаимодействие ДНК с мономерными комплексами Zn2+-А16 доминирует в этой концентрационной области. Однако, когда мономеры А16 были иммобилизованы вместо молекул ДНК на поверхности оптического чипа биосенсора (используя модельный пептид A16-G4-C), а rd-ДНК использовалась как аналит (в концентрации 1, 2 или 10 мкМ), в присутствии 1 мМ Zn2+ комплексы пептид-ДНК не образовывались (рис. 21). Наряду с предположением, что мономерные комплексы Zn2+-А16 не способны взаимодействовать с ДНК, возможна чисто техническая причина отсутствия детектируемого связывания rd-ДНК с иммобилизованными комплексами Zn2+-A16-G4-C. Например, доступность относительно небольших по размеру лигандов (A16-G4-C), иммобилизованных внутри слоя полимерного матрикса (состоящего из декстрана) на поверхности чипа СМ5, может быть ограничена для существенно больших по размеру молекул rd-ДНК. Это в совокупности со слабостью взаимодействия (миллимолярные KD) может привести к отсутствию детектируемого связывания ДНК с иммобилизованным пептидом.

Эффект ионов цинка на взаимодействие нуклеиновых кислот с фибриллярными агрегатами амилоида-

Как можно видеть, в отсутствии ионов цинка связывание r-ДНК с фибриллярными агрегатами А42 характеризуется наличием мест связывания одного типа с KD, лежащей в микромолярной области (табл. 7). Представляется наиболее вероятным, что сайтом взаимодействия в этом случае является участок 13HHQK16, включающий аминокислотные остатки с 13 по 16 полипептидной цепи А. Так, Watson et al. [214] предположили, что именно этот участок ответственен за взаимодействие другого биологического полианиона, гепарина, с А. При этом только агрегированные формы А40 были способны связывать гепарин, в то время как мономеры пептида – нет [214]. Авторы указали, что участки 13HHQK16 пептидов А в фибриллярных агрегатах расположены рядом и при нейтральных рН могут создавать протяжённую положительно заряженную область на поверхности фибриллы, которая и может служить местом связывания отрицательно заряженного полианиона. Позднее предположение о том, что участок 13HHQK16 играет важную роль во взаимодействии гепарина с агрегатами А было подтверждено с использованием мутантов А28 с одиночными, двойными и тройными заменами остатков Н13, Н14 и К16 на остатки аланина [141].

Образование комплексов между ионами цинка и пептидами А42 в составе фибриллярных агрегатов приводит к появлению мест связывания r-ДНК, различающихся по аффинности – один тип мест связывания характеризуется микромолярной KD, другой, более аффинный, значением KD порядка 10 нМ (табл. 7). Очевидно, такая «двух-модальность» цинк-зависимого взаимодействия r-ДНК с фибриллярными агрегатами А42 связана с особенностями взаимодействия Zn2+ с агрегатами пептида. Действительно, координация иона цинка остатками гистидинов Н13 и Н14 двух соседних пептидов [150] должна привести к образованию анион-связывающего сайта подобно тому, как это происходит в цинк-индуцированном олигомере А16. Это повысит плотность положительного заряда в области поверхности фибриллярного агрегата А42, которая образована соседствующими участками 13HHQK16 и обеспечивает взаимодействие агрегатов с отрицательно заряженными функциональными группами полианиона в отсутствии ионов цинка. Повышение плотности заряда должно усилить взаимодействие полианиона с агрегатом. Стабильность комплекса может в таком случае существенно увеличится, что проявляется в снижении величины KD ( с 1 мкМ до 10 нМ, табл. 7).

Известно, что наряду с взаимодействием с металл-связывающим доменом, Zn2+ также разрушает солевой мостик D23-K28 между остатками аспарагиновой кислоты и лизина (рис. 5), который стабилизирует -петлю и играет важную роль в процессе фибриллизации А, но при этом кросс--листовая структура уже сформированных фибриллярных агрегатов А42 не нарушается [150]. Разрушение солевого мостика может приводить к экспонированию остатков лизина на поверхности амилоидной фибриллы, создавая, таким образом, протяжённую положительно заряженную область, которая и выступает в качестве ещё одного места связывания отрицательно заряженного полианиона, такого как молекулы ДНК, с фибриллярным агрегатом А42. Строго говоря, имеющиеся на данный момент экспериментальные результаты не позволяют однозначно отнести измеренные константы диссоциации к конкретному типу потенциальных цинк-зависимых сайтов связывания r-ДНК. Очевидно тем не менее, что взаимодействие нуклеиновых кислот с одним из этих сайтов характеризуется высокой аффинностью (KD 10 нМ).

Таким образом, присутствие ионов цинка усиливает связывание как молекул ДНК, так и РНК с фибриллярными агрегатами А42, приводя к появлению высокоаффинного сайта связывания нуклеиновых кислот на поверхности агрегатов. Как отсутствие остатка гистидина Н6, так и введение четвертого остатка гистидина в полипептидную цепь А42 аминокислотной заменой D7H не влияли на цинк-зависимое связывание ДНК с фибриллярными агрегатами пептида.

Наряду с фибриллярными агрегатами, потенциально возможно формирование внутриклеточных цинк-индуцированных агрегатов вкА42 как следствие возрастания уровня свободного вкZn2+ в условиях оксидативного и/или нитрозирующего стрессов [7, 24, 37, 114, 124, 188, 189]. В связи с этим в рамках диссертационной работы было выполнено исследование взаимодействия нуклеиновых кислот с цинк-индуцированными агрегатами А42. Как и в случае фибриллярных агрегатов, с целью оценки роли остатков гистидина во взаимодействии молекул ДНК и РНК с цинк-индуцированными агрегатами А42, в работе использовали такие изоформы пептида, как D7H-А42 и H6R-А42.

Ионы цинка в субэквимолярных количествах по отношению к А вызывают, как известно, практически мгновенное формирование аморфных – то есть не имеющих -листовой структурной организации – агрегатов пептида [60, 203]. Аморфные агрегаты А не связывают тиофлавин Т [39, 202] и, как следствие, их формирование не может быть исследовано с помощью флуориметрического метода с использованием этого красителя. В связи с этим анализ цинк-индуцированной агрегации пептидов А42, D7H-А42 и H6R-А42 проводили методом ДРС. На рис. 34 представлены зависимости гидродинамического диаметра цинк-индуцированных агрегатов А42 и его изоформ при различных молярных соотношениях цинк/пептид. Как можно видеть, добавление ионов цинка к растворам пептидов в соотношении Zn2+/пептид = 0,5 приводит к появлению агрегатов значительного размера и дальнейшее увеличение соотношения Zn2+/пептид практически не меняет диаметр образующихся агрегатов. При этом пептиды А42 и H6R-А42 формировали агрегаты приблизительно одинакового размера, диаметром около 2-2,5 мкм, в то время как размер агрегатов D7H-А42 был в 1,5-2 раза больше. Следует отметить, что некоторая часть пептидов изначально (до добавления ионов цинка) находиться в агрегированном состоянии: метод ДРС детектировал наличие в препаратах пептидов А42, D7H-А42 и H6R-А42 агрегатов размером 265±73, 690±75 и