Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проведение технологических процессов гидролиза целлюлозосодержащего растительного сырья в условиях повышенных температур (до 80-90С)' имеет ряд несомненных преимуществ. При этом значительно снижается опасность инфицирования, увеличивается скорость и сокращается продолжительность гидролиза, улучшаются гидродинамические характеристики, становится возможным, комбинирование ферментативного гидролиза с тепловой обработкой сырья. Но используемые целлюлазы микромицетов не имеют необходимой устойчивости к повышению температуры. Наиболее перспективным является создание термостабильных ферментных препаратов, продуцируемых термофильными и экстремально термофильными, бактериями, целлюлазы которых возможно будут способны стабильно функционировать при температуре пастеризации (65С) и выше (до 80-90С).
Значительный интерес в этом отношении вызывает термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum и новая не изученная экстремально термофильная бактерия Anaerocellum thermoplulum gen.nov., sp.nov.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ.' Целью работы являлось изучение свойств целлю-лозолитических ферментов термофильной анаэробной бактерии Clostridium thermocellum отечественного штамма 3, новой экстремально термофильной анаэробной бактерии Anaerocellum thermophilum штамм Z 1320 и оценка возможностей полученных на их основе термостабильных ферментных препаратов при высокотемпературной конверсии целлюлозы.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Изучить закономерности биосинтеза и оптимизировать условия роста данных штаммов с целью увеличения выхода целлюлаз. 2. Оценить методы выделения препаратов целлюлаз , получить препараты, выделить гомогенный фермент. 3. Изучить молекулярные характеристики целлюлаз (удельную активность, термостабильность, адсорбционную способность, устойчивость к ингибированию продуктами реакции) и на этой основе выбрать перспективный продуцент. 4. Определить возможность высокотемпературной биоконверсии целлюлозы полученными препаратами целлюлаз.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучены основные закономерности биосинтеза целлюлаз новой анаэробной бактерией Anaerocellum tiaermophilum, выделен ферментный препарат и охарактеризованы би-
охимические свойства целлюлазного комплекса, существенные для биотехнологии. Показано, что эндоглюканаза препарата характеризуется высокой термостабильностью: период полуинактивации при 85 С равен 150 мин. Комплекс целлюлаз, гидролизующих фильтровальную бумагу, превышает по термостабильности эндоглюканазу (период полуинактивации при 85С равен 250 мин).Впервые исследован высокотемпературный (75-80) гидролиз целлюлозы препаратом целлюлаз А. thermophilum.
Показано, что эндоглюканазы отечественного штамма 3 Clostridium thermocellum входят б состав высокомолекулярных агрегатов - "целлюлосом". Предложена схема фракционирования эндоглю каназ из "целлюлосом". Очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы свойства индивидуальных эндоглюканаз, первоначально входящих в состав "целлюлосом". Обнаружено, что надмолекулярная организация целлюлазного комплекса С. thermocellum в виде "целлюлосом" обеспечивает эффективную сорбцию ферментов на кристаллическом субстрате.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Высокая термостабильность ферментов Anaerocellum thermophilum позволяет проводить гидролиз целлюлозы при 75С на 60-70% за 24 ч при внесении 1 ед/г субстрата или на 100% за 6 ч при внесении 170 ед/г субстрата. Особенно важно, что основным продуктом гидролиза является глюкоза (70-90 молярных %). Препараты целлюлаз A.thermophilum в перспективе могут быть эффективно использованы в различных биотехноло-тичеких процессах гидролиза целлюлозосодержащего сырья до глюкозы в условиях повышенных температур (75-80), особенно - после увеличения биосинтеза путем проведения генно-инженерных работ на основе ее генома.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты были представлены на Конференции молодых ученых (Пущине 1988 ), на IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пушино, 1989), на 3 Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), на 7 Всесозном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991), на Конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на заседаниях Ученого совета ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН и коллоквиумах в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 стат
и 12 тезисов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов. Основной текст диссертации изложен на 142 страницах, содержит 32 рисунка, 6 таблиц и 1 схему. В библиографии приводится 209 наименований. В приложении представлены 6 таблиц и 6 рисунков.