Введение к работе
:'--!"':'ї
::тдел , ;
:ертгци.Актуальность исследования. Эндонуклеазы, в частности ДНК-эндонуклеазы, являются ферментами, расщепляющими фосфодиэфирные связи в молекулах ДНК. Наличие этих ферментов показано во всех таксонах эукариот, а также у прокариот ( Linn, 1981; Laskowsky, 1982). Показано также, что у эукариот значительная часть этих ферментов локализована в клеточных ядрах ( Sierakowska, Bhugar, 1977 ). Однако, функциональная роль большинства эндонуклеаз у эукариот остается неизученной. Если ранее предполагалось, что основная роль нуклеаз, в частности эндодезоксирибонуклеаз, состоит в катаболизме нуклеиновых кислот, то к настоящему времени данные, полученные в основном на прокариотах, показывают, что эндодезокси-рибонуклеазы - ферменты, участвующие в функционировании генома, в первую очередь - репарации и рекомбинации ДНК (Татарская, 1976; Votrin е.а., 1987).
Исследования в этом направлении приобретают особую актуальность в связи с формированием в последнее десятилетие представлений о нестабильности генома, о его динамической организации (Хе-син, 1984). Отдельные примеры, исследованные в последние годы, указывают на участие эндонуклеаз эукариот в процессах динамической организации генома, в частности - различных типах транспозиций ( Colleaux е.а., 1986; Kostriken е.a., 1983 ), интеграции ретровирусов ( Panganiban, Temin, 1984 ), реаранжировке иммуно-глобулиновых генов ( Desiderio, Baltimore, 1984; Норе е.п., 1986 ).
На участие эндонуклеаз в процессах функционирования генома и определяемых ими изменениях функционального состояния клеток в норме и патологии указывают также данные об изменениях некоторых из этих ферментов в процессах онтогенеза ( Rao, Еао, 1982 ), диф-ференцировки ( McMahon е.а., 1985 ), злокачественной трансформации клеток ( Economidou-Karaoglou е.а., 1988 ).
Вместе с тем, систематические исследования большинства известных эндонуклеаз эукариот отсутствуют, что не позволяет судить о биологической роли этих ферментов. В значительной степени это связано с отсутствием на сегодняшний день единых методических подходов к изучению свойств и функций этих ферментов у эукариот.
Одним из методологических вопросов, связанных с решенном вопроса о причастности эндонуклеаз к функционированию генома, яплл-
ется их внутриклеточная локализация. В этом отношении, в первую очередь, представляют интерес эндонуклеазы, локализованные в клеточных ядрах. Кроме того, представляется необходимым учитывать, что эндонуклеазы клеточных ядер в основной функционируют в составе хроматина, в связи с чем важным аспектом изучения этих ферментов является исследование специфики их взаимодействия с хроматином и распределения в нем.
Существенный интерес среди известных эндонуклеаз клеточных ядер представляет Са/Ыа-зависимая эндонуклеаза. Это связано с повсеместной распространенностью данного фермента ( Sierakows-ka, Shugar, 1977). а также с тем, что он является основной эндонукле-азой клеточных ядер, определяющей ыекнуклеосомную фрагментацию хроматина ( Burgoune, Hewieh, 1978 ). Кроме того, в последние годы получены данные, позволяющие предполагать ключевую роль Са/ Ыо-зависимой эндонуклеазы в процессах деградации хроматина при интерфазной гибели клеток, в частности лимфоцитов, при радиационном поражении организма (Уманский, 1982).
Шесте с тем, систематические исследования свойств фермента, его соотношений с другими эндонуклеазаыи клеточных ядер, особенностей взаимодействия с хроматином и ДНК, а также изменений в норме ц патологии отсутствуют. Это до сих пор не позволяет создать основы для оценки биологической роли Са/Ыо^-эавнснмой эндонуклеазы, ее участия в функционировании генома и, тем самым, затрудняет рациональную трактовку данных по изменениям фермента и возможностей его использования как маркера функциональных изменений клеток в норме и патологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение участия Ca/Ua-зависимой эндонуклеазы в специфическом эн-донуклеолизе ДНК и хроматина как основы для выявления биологической роли фермента, а также установления взаимосвязей меаду активностью и свойствами фермента и изменениями функционального состояния клеток в норме и патологии.
Исходя из изложенного, конкретные экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:
I. Разработка и изучение качественных и количественных параметров Ca/Lh-зависимого эндонуклеолиза ДНК в изолированных клеточных ядрах; разработка методических подходов к применению Са/М^-зависимо-го эндонуклеолиза в изолированных клеточных ядрах для выявления к
сравнительного определения Са/Мо-зависимой эндонуклеазы, а также изучения специфики участков хроиатина, подвергаемых преимущест-венноыу расщеплении ферментом.
-
Разработка технологии получения высокоочищенных и стабильных препаратов Са/Мо-зависимой эндонуклеазы; характеристика физико-химических свойств фермента и его механизма действия.
-
Изучение специфичности действия очищенных препаратов фермента на различные субстратные ДНК и ДНП; исследование возможностей и разработка условий тестирования сайт-специфичной фрагментации ДНК Са/Мсь-зависимой эндонуклеазой; характеристика факторов, определяющих специфичность фрагментации ДНК.
-
Изучение представленности Са/Мог-зависиыой» эндонуклеазы сравнительно с другими эндонуклеазами клеточных ядер, разработка иммуно-химических подходов и применение гибридомной технологии для решения данного вопроса.
-
Изучение свойств и активности фермента при изменении функционального состояния клеток в норме и патологии, в частности лимфоцитов при иммунном ответе и хроническом лимфолейкозе; сравнительное исследование активности фермента в различных лимфоидных органах и определение возможностей использования фермента как маркера лим-фопролиферативных заболеваний, в частности хронического лимфолей-коза.
Научная новизна и практическая ценность работы. При анализе распада хроматина под действием эндогенной Са/На-зависимой эндонуклеазы выявлен этап первичного эндонуклеолиза, состоящий в расщеплении особочувствительных к действию фермента участков хроматина, содержащих 5-7/6 тотальной ДНК. Анализ продуктов, выщепляемых на этапе начального эндонуклеолиза, показал, что они содержат нукле-осомы с длиной повтора ДНК, большей среднего на 10-15 н.п., а такає последовательности ДНК, суперметилируеше in vitro и обогащенные быстрометящейся РНК (в 5-7 раз по сравнению, с тотальным хроматином). Использование условий первичного эндонуклеолиза позволяет выделять крупноразмерные фрагменты хроматина, содержащие ЦНК размером в 20-40 т.н.п., что может соответствовать отдельным доменам хроматина.
Разработаны методы компьютерного анализа денситограмм и математического моделирования эндонуклеолиза хроматина, применение которых выявило неслучайный распад хроматина под действием Са/Ма-
4 зависимой эндонуклеазы. Данный подход может найти применение в анализе пострадиационного распада хроматина в интерфазно гибнущих клетках, а также при анализе взаимодействия с хроматином других эндогенных и экзогенных нуклеаз.
Разработана методика получения высокоочищенных и стабильных препаратов Са/Ыо-эависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, проведена характеристика свойств фермента. Впервые выявлено существование высокомолекулярной формы Са/Мо-зависимой эндонуклеазы (57 кД). Обнаружена зависимость механизма фрагментации ДНК от содержания дивалентных катионов, а также этапа гидролиза.
Впервые показано, что Са/Ыд-зависиыая эндонуклеаза вносит первый двухцепочечный разрыв в молекулу ДНК сайт-специфически; специфичность определяется нуклеотидньш составом и последовательностью участков ДНК, а также конформацией ДНК.
Выявлено, что Са/Ыо-зависиыая эндонуклеаза расщепляет J к-кластер иммуноглобулиновых генов в участках инициации V -J -рекомбинации, что указывает на участие данного фермента в рекомбинации ДНК у эукариот.
лредложен методический подход, основанный на технологии гибридом и направленный на выяснение вопроса о гетерогенности ондо-нуклеаз клеточных ядер и представленности отдельных ферментов. С помощью специально разработанного высокочувствительного метода детекции антител, продуцируемых независимо полученными гибридомами к эндоДНКазаы клеточных ядер, показано, что высокомолекулярная (57 кД) форма Ca/Hg-зависиыой эндонуклеазы является наиболее представленной эндонуклеазой клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
Показаны существенные различия активности Са/Ыа-эависимой эндонуклеазы, чувствительности к ионам Са + и интенсивности фрагментации хроматина в различных лимфоидных органах и популяциях лимфоцитов. Показано, что В-лиыфоциты характеризуются большей активностью фермента, чем Т-лиифоциты, в особенности это различие выражено в периферической крови.
Показано, что активность Са/Ііо-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов тимуса и селезенки мышей резко изменяется в процессе первичного иммунного ответа; изменения носят фазный, периодический характер, являются органоспецифическиыи и хорошо кор-
5 релируют с фазным характером пролиферативной и антителопродуциру-ющей активности лимфоцитов в ходе иммунного ответа. Результаты указывают на возможность рассмотрения активности Са/Мо-эависимой эндонуклеазы как одного из ферментативных маркеров иммунных процессов, а также на ее участие в изменениях функционирования генома лимфоцитов при иммунизации.
Проведены исследования фермента лимфоцитов периферической крови при хроническом лиыфолейкозе у человека и крупного рогатого скота. Установлено, что активность Са/Мо-зависимой эндонуклеазы снижается при хроническом лиыфолейкозе (ХЛЛ) в 8-Ю раз по сравнению с нормой как у человека, так и у крупного рогатого скота (КРС), причем в эксперименте на КРС показано, что изменения активности фермента предваряют формирование гематологических и клинических признаков заболевания.
Результаты показывают, что активность Са/Мо-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов может быть чувствительным маркером развития лиыфопролиферативных заболеваний. Кроме того, исследование здоровых животных, контактирующих с больными, выявляет идентичные изменения активности и указывает на' практическую значимость горизонтального (контактного) пути передачи ХЛЛ у КРС (Нах-мансон, 1987).
Показано, что при изменениях функционального состояния лимфоцитов изменения активности Са/Мо-зависимой эндонуклеазы сопряжены с изменением степени компактизации хроматина. Сравнение различных нуклеаз показало, что очищенные препараты Са/Мо-зависимой эндонуклеазы являются более чувствительным ферментативным зондом на изменение структуры хроматина при ХЛЛ, чем обычно применяемые микрококковая нуклеаза и ДНКаза I.
При исследовании механизмов снижения активности фермента обнаружены белковые факторы, ингибирующие Са/Ма^зависимую эндонукле-азу и появляющиеся в клеточных ядрах при ХЛЛ; факторы являются специфичными к данной нуклеазе, а также проявляют видо- и ткане-специфичность. Результаты выявляют существенность функций Са/Мо-зависимой эндонуклеазы в нарушениях дифференцировки лимфоцитов при развитии ХЛЛ.
Разработана гипотеза полифункциональной роли Са/Мо-зависимой эндонуклеазы, определяемой ее фиксацией в хроматине, факторами микроокружения, спецификой участков хроматина, с которыми взаи-
подействует фермент, а также различной ролью одноцепочечных и сайт-специфических двухцепочечных надрезов, производимых ферментом. Гипотеза позволяет объяснить механизмы активации фермента при интерфазной гибели лимфоцитов, его ингибирование при хроническом лимфолейкозе и определяет ряд экспериментальных подходов к дальнейшему исследованию свойств и функций Са/Ма-зависимой эндо-нуклеазы, а.также других эндонуклеаз, связанных с хроматином.
По результатам работы получены три положительных решения на авторские заявки; разработаны 3 методических рекомендации, утвержденные к публикации Ученым советом ВАСХНИЛ; моноклональные антитела к Са/Мо-зависимой эндонуклеазе включены в каталоги внешнеторговой фирмы "Биокард".
Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на двух научных конференциях НИИМЭ АМН СССР (1986, 1987), научной конференции ИМР АМН СССР (1987), научной конференции ИМГ АМН СССР (198( заседании Московской секции Всесоюзного биохимического общества (1987).
Материалы работы докладывались на ІУ и У Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979; Киев, 1986), ІУ Всесоюзной конференции по программе "Ген" (Москва, 1981), УП и IX Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Харьков, 1980; Черноголовка, 1987), У Всесоюзном симпозиуме по медицинской эн-зимологии (Махачкала, 1986), Всесоюзной конференции по применению ферментов в биохимических анализах (Паланга, 1984), Всесоюзной конференции по биохимии сельскохозяйственных животных (Ташкент, 1986), Московской конференции молодых ученых "Современные проблеми биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1983), Всесоюзной конференции "Культивирование клеток человека и животных" (Лущино, 1985), Всесоюзной конференции "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), Всесоюзной конференции по математическому моделированию и применению ЭВМ в медицине (Москва, 1984), Всесоюзной конференции по современным методам профилактики и оздоровительным мероприятиям по лейкозу крупного рогатого скота (Тарту, 1987), 14 съезде ІЕБ0 (Москва, 1984), 14 Международном биохимическом кон грессе (Прага, 1988).
Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции Института питания АМН СССР 6 июня 1988 г.
.і"уликаііии. ІІо материалам диссертации опубликовано 27 рабо"-
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, бзора литературы (главы I и П), описания методов исследования глава Ш), результатов (главы ІУ-УІ), обсуждения (глава УП), об-[его заключения, выводов, списка литературы и одного приложения. >бъем диссертации стр., включая 64 рисунка и II таблиц.