Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физико-химические свойства металлических гидрозолей 17
1.1. Химия золота и его соединений 18
1.1.1. Степень окисления I 21
1.1.2. Степень окисления II 22
1.1.3. Степень окисления III 23
1.1.4. Степень окисления V , 23
1.2. Окислительно-восстановительные потенциалы ...23
1.3. Хлориды золота 30
1.4. Методы синтеза металлических коллоидов 33
1.4.1. Восстановление Au(III) органическими восстановителями 34
1.4.2. Механизмы формирования однородных металлических наночастиц в гомогенных растворах 35
1.4.3. Методы цитратного восстановления ...38
1.4.3.1. Цитратное восстановление по Френсу 43
1.4.3.2. Восстановление в присутствии ВМС 48
1.4.4. Зародышевые методы 54
1.4.5. Синтез на матрицах 57
1.4.5.1. Экспериментальное получение золотых несферических наночастиц 61
1.4.6. Микроэмульсионный метод 69
1.4.7. Дигестивное созревание 71
1.5. Заключение к 1 главе 74
Глава 2. Оптические свойства металлических гидрозолей 76
2.1. Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) 76
2.1,1.Экспериментальное исследование ППР золотых золей различных размеров 85
2.1.1.1. Оптические константы золота и золотых частиц .87
2.1.1.2. Расчет спектров ослабления золей 90
2.1.1.3, Экспериментальные методики 94
2.1.1.4, Зависимость положения и величины максимума ослабления от размера частиц КЗ 95
2.2. Флюоресценция 104
2.3. Резонансное светорассеяние 105
2.3.1. Экспериментальное измерение спектров светорассеяния золей золота 110
2.3.1.1. Зависимость экстинкции и рассеяния от размера и концентрации частиц 111
2.3.1.2. Анализ оптической схемы и приборной погрешности 120
2.3.1.3. Воспроизводимость 122
2.3.1.4. Адекватность компенсации поглощения 123
2.3.1.5. Зависимость экстинкции и рассеяния от размера и полидисперсности частиц 125
2.4. Динамическое светорассеяние 131
2.4.1. Измерение размеров золотых наночастиц методом ДРС 134
2.5. Заключение к 2 главе136
Глава 3. Функционализация металлических наночастиц 138
3.1. Адсорбционный способ 146
3.1.1. Конъюгирование КЗ с олигопептидами и низкомолекулярными зондами 147
3.1.2. Конъюгирование КЗ с высокомолекулярными зондами 152
3.1.3. Оптическая модель биоконъюгатов: теоретический анализ 156
3.1.4. Оптическая модель биоконъюгатов: экспериментальные исследования 168
3.1.4.1. Многослойная модель биоконъюгатов КЗ 171
3.1.4.2. Неоднородная модель адсорбции желатина на частицах золота 184
3.2, Хемосорбционный способ 189
3.2.1. Получение ДНК-маркеров 192
3.2.1.1. Функционализация КЗ 5'-тиоолиготимидином . 197
3.2.1.2. Спектрофотометри чески й контроль конъюгирования КЗ с олигонуклеиновыми кислотами 203
3.3. Активность биомакромолекул, иммобилизованных на металлических наночастицах208
3.3,1. Экспериментальные исследования активности ферментов, иммобилизованных на
наночастицах КЗ 212
3.4. Заключение к 3 главе... 214
Глава 4. Детектирование биоспецифических взаимодействий посредством коллоидно- металлических маркеров 217
4.1. Электронно-микроскопические исследования , 220
4.1.1. Электронно-микроскопические исследования поверхностных структур бактерий и белков цитоскелета 222
4.2. Светомикроскопические исследования 228
4.2.1. Свето-микроскопические исследования локализации актиновой составляющей цитоскелета 228
4.2.2.1. Темнопольная свето-микроскопическая визуализация ПРЧ 232
4.3. Пленарные решения : 241
4.3.1. Твердофазный анализ на мембранных фильтрах. 243
4.3.1.1. Экспериментальное исследование биоспецифических взаимодействий методом твердофазного анализа 244
4.4. Решения in vitro 256
4.4.1. Спектры экстинкции и рассеяния при специфической и неспецифической агрегации коллоидного золота 258
4.4.2. ДНК-функционализированные КЗ маркеры 269
4.4.2.1. ДНК-функционализированные КЗ маркеры в анализе РНК последовательностей 273
4.4.2.2. Агрегация КЗ-ОНК маркеров, индуцированная гибридизацией с комплементарными последовательностями 278
4.5. Заключение к 4 главе 283
Заключение 285
Список литературы 289
- Окислительно-восстановительные потенциалы
- Поверхностный плазмонный резонанс (ППР)
- Конъюгирование КЗ с олигопептидами и низкомолекулярными зондами
- Электронно-микроскопические исследования поверхностных структур бактерий и белков цитоскелета
Введение к работе
Золото - один из первых открытых человеком металлов, и история его изучения насчитывает как минимум несколько тысяч лет. Начало научного исследования свойств коллоидных благородных металлов традиционно связывают с именем Майкла Фарадея [ 1 ] . Тем не менее, растворы коллоидного золота были хорошо знакомы алхимикам (3 - 16 вв. н.э.), и, возможно, удивительные цветовые превращения, сопровождающие конденсацию металлов при восстановлении из растворов солей, приводили к мысли о превращении элементов - трансмутации, а свойства панацеи приписывались коллоидному золоту [2]. Во всяком случае, Филипп Ауреол Теофраст Бомбаст фон Гогенгейм, известный как Парацельс, использовал препараты питьевого (коллоидного) золота, полученного восстановлением спиртовыми настоями целебных трав, как лекарственное средство в своей врачебной практике.
В настоящее время на сайтах интернета [3] можно найти рекламу лекарственного средства от кандидоза кишечника, глистных инвазий, наркомании и алкоголизма, сахарного диабета, гипотиреоза, хронических вирусных и бактериальных инфекций и др., представляющего собой коллоидный раствор золота, серебра и меди.
В последние годы наночастицы коллоидного золота, серебра и их композиты широко используются как эффективные оптические преобразователи биоспецифических взаимодействий. В частности, резонансные оптические свойства нанометровых металлических частиц успешно применяются для разработки так называемых биочипов и биосенсоров. Подобные устройства представляют большой интерес для биологии (определение нуклеиновых кислот,
белков и метаболитов), медицины (скрининг лекарственных веществ, выявление антител и антигенов, диагностика инфекций) и химии (экспресс-мониторинг окружающей среды, количественный анализ растворов и .дисперсных систем). Особый интерес представляет обнаружение определенных последовательностей нуклеиновых кислот (генов) и конструирование новых материалов, основанное на образовании трехмерных упорядоченных структур при гибридизации в растворах с комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно связанными с металлическими наночастицами [4,5].
Помимо ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизации, под биоспецифическими взаимодействиями в данной работе будут рассмотрены межмолекулярные взаимодействия типа антиген-антитело, фермент-субстрат, лектин-полисахарид, белок А-иммуноглобулин, авидин-биотин и т.п. В качестве детектирующего агента в данных реакциях используются наноразмерные металлические частицы (метки), главным образом, коллоидного золота (КЗ), входящие в состав маркеров конъюгатов наночастиц (НЧ) с биоспецифическими макромолекулами - зондами. Кроме классического коллоидного золота со сферическими частицами - наносферами (НСф) - в качестве носителей биомолекул рассматриваются частицы коллоидного серебра (КС) и частицы несферической цилиндрической формы ' - наностержни (НСт), объединенные термином плазмонно-резонансные частицы (ПРЧ).
О протекании реакции судят по изменению оптических свойств системы: поглощения или рассеяния света (статического или динамического). Спектры поглощения и рассеяния света коллоидным золотом в оптическом диапазоне хорошо определяются в рамках теории Ми [6] и зависят от размера и формы частиц, диэлектрических параметров (световой рефракции) их локального и интегрального окружения и расстояний между частицами. Данные динамического светорассеяния (ДСР) дают характеристику
размерам частиц и супрамолекулярных комплексов (агрегатов) как функции их броуновского движения.
Таким образом, в данной работе биоспецифические взаимодействия на металлических наночастицах рассматриваются в рамках модели металлического ядра в биополимерной оболочке. В общем случае, взаимодействия между маркерами и мишенями могут приводить к двум принципиально различным сюжетам: образованию агрегатов частиц, имеющих псевдокристаллическую или аморфную структуру или изменению параметров полимерного слоя (плотности, толщины, коэффициента преломления или экстинкции). К сожалению, зачастую такие структурные перестройки в системе могут приводить к сходным изменениям ее оптических характеристик. Тем не менее, сопоставление данных каждого из рассматриваемых оптических методов: спектрофотометрии, спектронефелометрии и динамического светорассеяния - позволяет охарактеризовать структуру образующихся комплексов и динамику их формирования. Это, в свою очередь, в сопоставлении с данными независимых физико-химических методов исследования (твердофазного анализа, световой и электронной микроскопии) позволяет судить о характере межмолекулярных биоспецифических взаимодействий.
Детектирование биоспецифических взаимодействий, основанное на изменении оптических свойств системы наночастиц-носителей, можно отнести к области сравнительно новой отрасли науки - биосенсорике. Причем биосенсором является сама система либо частица-маркер (элементарный сенсор). Коллоидное золото в ряду оптических биосенсоров занимает особое место, поскольку может выступать и в роли метки в наносенсорном устройстве, и как инструмент в молекулярно-биологических исследованиях, используемый іл vitro, in situ и in vivo.
Большинство из рассматриваемых в данной работе вопросов можно также отнести к области сравнительно новой и бурно
развивающейся науки нанотехнологии, точнее, биохимии и биофизике наноразмерных структур. То, что классические объекты коллоидной химии выделяют в отдельную область наноразмерных структур, аргументировано представлено в недавних обзорах В.И. Ролдугина [7] и М. Кортье [8]. Основным принципиальным отличием нанотехнологического описания высокодисперсных систем является определение свойств отдельных наноструктурных объектов и манипулирование отдельными наночастицами. В молекулярной биологии это означает создание устройств, позволяющих распознавать отдельные молекулы. По образному выражению Кортье: «Если кремний - "камень" наномира, а ДНК - бумага, на которой записана информация, то, быть может, золото - это те "ножницы", тот инструмент, который заставляет все это работать вместе».
Актуальность
Диссертационная работа затрагивает вопросы нанотехнологии, признанной приоритетным направлением развития мировой и отечественной науки. Современные методы биоаналитической химии развиваются в сторону миниатюризации и сверхминиатюризации устройств, автоматизации процессов регистрации и алгоритмизации обработки экспериментальных данных. В этом контексте нанонаука представляет собой принципиально новую ступень. Замена только метки с флюоресцентной на коллоидно-металлическую, серебряную или золотую позволяет во много раз {до 500000) увеличить чувствительность диагностических систем [9]. При этом возможно использование коммерчески доступных иммуно- и генодиагностических наборов реактивов и стандартного лабораторного оборудования. В ряде случаев детектирование сигнала от одной частицы, в частности, спектрального сдвига резонансного светорассеяния, позволяет определить такие важные
характеристики молекулярного специфического взаимодействия, как концентрации молекул и константы аффинности [10].
Работа посвящена разработке новых методов исследования структуры различных компонентов живых организмов: поверхностных структур бактериальных клеток, белков системы цитоскелета, полинуклеиновых кислот системы посттранскрипционной регуляции генома с использованием биоспецифических взаимодействий, регистрируемых посредством металлических наночастиц с плазмонным резонансом. В область исследований входило также изучение строения, свойств и функционирования молекул и надмолекулярных структур, образующих биоспецифические комплексы (антиген-антитело, лектин-полисахарид, фермент-субстрат, авидин-биотин и др. ) на частицах коллоидных металлов.
Целью диссертационной работы было теоретическое и экспериментальное развитие методологии синтеза, биоспецифической функционализации и применения золотых наночастиц с плазмонным резонансом, преобразующих молекулярное взаимодействие «зонд-мишень» в регистрируемый оптический сигнал.
Направление исследований заключалось в разработке новых и усовершенствовании известных аналитико-биохимических методик, позволяющих максимально использовать общедоступное лабораторное оборудование без применения высокотехнологических процедур для определения физиологически активных веществ на уровне единичных межмолекулярных взаимодействий. Ход работы заключался в решении следующих конкретных задач:
1. Оптимизация технологии получения золотых наносфер и наностержней с заданными геометрическими параметрами методами одностадийной и многостадийной (зародышевый метод) реакции.
2. Развитие и практическая реализация нековалентной
функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами
(белками, лектинами, полисахаридами).
Разработка методологии контроля морфометрических параметров наночастиц и биомаркеров на основе комбинированного использования спектроскопии поглощения, дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света, динамического светорассеяния, седиментационного и электронно-микроскопического анализа
Теоретическое и экспериментальное исследование зависимости спектров поглощения и дифференциального статического рассеяния света металлическими частицами в условиях изменения общего и локального диэлектрического окружения.
Развитие технологии синтеза и оптического контроля геометрических и молекулярных {количество молекул-зондов) параметров ДНК-маркеров, получаемых ковалентной пришивкой олигонуклеотидов к поверхности золотых наночастиц. Исследование спектров поглощения и дифференциального рассеяния света при гибридизации ДНК-маркеров с комплементарными полинуклеотидами-
Развитие методологии твердофазного анализа (дот-болт тест) растворимых и корпускулярных (целых бактериальных клеток и их фрагментов) антигенов (мишеней).
Развитие метода визуализации биомаркеров методом световой микроскопии темного поля.
Положения, выносимые на защиту
1. Применение комбинированного восстановителя
(ЭДТА+борогидрид натрия) позволяет получать золи золота с
узким распределением по размерам в диапазоне средних
диаметров частиц 3-6 нм. Положение максимума экстинкции
определяет средний размер частиц с точностью около 2 нм в
диапазоне от 15 до 90 нм. Применение центрифугирования в градиенте концентрации глицерина позволяет получить фракцию золотых наностержней с минимальным количеством наносфер.
Разработка технологии нековалентной функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами адсорбционным способом, включающая оптимизацию буфера, контроль минимального защитного количества биополимера и оптимизацию конечного продукта.
Метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света является чувствительным тестом для определения среднего размера частиц, а также для оценки полидисперсности частиц и параметров их формы.
При формировании адсорбированного полимерного слоя на поверхности золотых наночастиц пик плазмонных резонансов экстинкции и дифференциального рассеяния смещается в красную область на 2-4 нм, а сами резонансы увеличиваются не более чем на 15-20%. Большее красное смещение пиков или изменение характера спектров указывают на агрегацию частиц.
Развитая технология синтеза позволяет получать маркеры с количеством однонитевых олиготимидинов Т28 примерно 150 шт. на одну золотую частицу с диаметром 15 нм. Ковалентная функционализация золотых наночастиц олигонуклеотидами приводит к неаддитивному сложению поглощения биополимера и золотого ядра в области 260 нм. Использование нитрата серебра в технологии синтеза приводит к нетипичному увеличению пика плазмонного резонанса до 4 0%.
Биоспецифическое окрашивание молекул, бактериальных клеток или их фрагментов, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, является эффективным способом быстрой качественной идентификации биологической «мишени» с помощью конъюгатов золотых наночастиц с молекулами-зондами.
7. Микроскопия темного поля позволяет эффективно различать частицы разного размера и формы в статическом и динамическом режимах анализа.
Научная новизна
1. На основании предложенной концепции совместного действия полидентатного лиганда и активного восстановителя разработан оригинальный метод синтеза ультрадисперсных золей золота с диаметром частиц 3-6 нм, защищенный патентом РФ. Метод синтеза золотых наностержнеи на «мягких» матрицах ЦТАБ оптимизирован введением оригинального этапа центрифугирования в градиенте концентрации глицерина и применением спектроскопии рассеяния для характеристики фракций препарата.
2 - В рамках единого подхода разработана эффективная технология нековалентной функционализации золотых наносфер и наностержнеи, позволяющая получать коллоидно-золотые маркеры для широкого класса биополимерных зондов (белки, лектины, полисахариды).
Разработан новый метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния для характеристики дисперсных частиц с плазмонно-резонансным поглощением и рассеянием. Экспериментально метод реализован в виде приставки к серийному спектрофотометру «Спекорд М-40». Впервые показано, что дифференциальные спектры рассеяния обладают большей чувствительностью к полидисперсности и форме золотых наночастиц.
Показано, что золотые наночастицы, функционализированные олиготимидиновым зондом, не способны к агрегации при взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами поли(А) в обычных гибридизационных условиях. Установлено, что агрегация, инициируемая замораживанием/оттаиванием подобных систем, является биоспецифической. Предложена модель
агрегации, отличная от модели перекрестных сшивок Миркина и соавт.
Впервые показано, что продольный плазмонный резонанс золотых наностержней обладает большей чувствительностью к диэлектрическому окружению, по сравнению с золотыми наносферами, что может быть использовано для создания нового типа биосенсоров.
Разработан новый способ идентификации бактерий с помощью окрашивания биоспецифическими маркерами образца, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране.
Впервые показана возможность определения белка по изменению спектров поглощения и рассеяния, обусловленному неспецифической агрегацией частиц. Предложен новый вариант определения некоторых белков с использованием конъюгатов золотых наночастиц с протеазами.
Резонансное рассеяние света в микроскопии темного поля впервые применено для сравнительного анализа трансляционной диффузии сферических частиц (90 нм) и вращательной диффузии золотых наностержней (толщина порядка 15 нм, длина около 4 0 нм).
Научная и практическая значимость
Разработанные методы синтеза металлических гидрозолей с частицами заданных размеров и формы и их функционализации с применением широкого спектра белковых и нуклеотидных зондов могут быть использованы для создания разнообразных биохимических и молекулярно-генетических диагностических и биосенсорных систем нового поколения.
Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения Российской биотехнологии" (Германия, 1996 г. ) , 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставок.
Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете, включены в методическое пособие {Карпунина Л.В., Мельникова У.Ю., Богатырев В.А., Методические рекомендации по исследованию взаимодействия лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий с фракциями корней растений. - Саратов: СГУ, 2000. - 8 с. ) . Кроме того, материалы диссертационной работы включены в программы спецпрактикумов и спецсеминаров "Физико-химические методы исследования" и "Биофизические методы исследования", руководимые автором на ФНП СГУ.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений", научный руководитель темы д.х.н., профессор СЮ. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н., профессор Н.Г. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.
Частично данная работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR300), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006), NATO Collaborative Linkage Grant (LST.CLG 975040), NATO Expert Visit Grant (LST.EV.979788). Реализация результатов отражена в ежегодных и заключительных отчетах ИБФРМ РАН.
Окислительно-восстановительные потенциалы
Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете, включены в методическое пособие {Карпунина Л.В., Мельникова У.Ю., Богатырев В.А., Методические рекомендации по исследованию взаимодействия лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий с фракциями корней растений. - Саратов: СГУ, 2000. - 8 с. ) . Кроме того, материалы диссертационной работы включены в программы спецпрактикумов и спецсеминаров "Физико-химические методы исследования" и "Биофизические методы исследования", руководимые автором на ФНП СГУ.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений", научный руководитель темы д.х.н., профессор СЮ. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н., профессор Н.Г. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.
Частично данная работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR300), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006), NATO Collaborative Linkage Grant (LST.CLG 975040), NATO Expert Visit Grant (LST.EV.979788). Реализация результатов отражена в ежегодных и заключительных отчетах ИБФРМ РАН. Проблема получения изодисперсных металлических золей в медико-биологических исследованиях не сводится только к необходимости иметь красивый однозначный маркер для электронной микроскопии или набор таких маркеров для множественного мечения. По выражению О.А. Акципетрова, у наноструктурных объектов "электродинамические и молекулярно-адсорбционные явления удивительным образом переплетаются" [11]. Необычным в ультрадисперсных системах является уже то, что в ряду частиц одинакового состава различных размеров постоянным остается только соотношение их геометрических параметров. При постоянной весовой концентрации с уменьшением размера частиц суммарная поверхность прямолинейно возрастает, а поверхность и объем каждой частицы убывают как квадрат и куб линейного размера, соответственно. Удельная поверхность КЗ может достигать 150 м /г [8] . Однако само понятие поверхности для частиц с размерами в несколько единиц и десятков нанометров имеет специфические особенности. Это касается толщины и состава поверхностного слоя. Если у золотых частиц с диаметром 1-2 нм практически все атомы являются поверхностными, то с возрастанием диаметра до -50 нм доля поверхностных атомов убывает до нескольких процентов. В связи с этим существенно изменяются и химические свойства. Наиболее наглядным примером является то, что ультрадисперсные золотые частицы растворяются в горячей достаточно концентрированной {2,5 М) соляной кислоте в отсутствие нитрат ионов с образованием хлорауратов (собственные наблюдения). Следует отметить, что процесс растворения золота, серебра и других благородных металлов играет важную роль в образовании изодисперсных металлоколлоидов, поскольку начальные этапы формирования частиц конденсированной фазы носят обратимый характер. Поверхностная химия металлических наночастиц напрямую связана с химией координационных соединений этих металлов. Особое положение золота, по мнению Кортье [8], заключается в исключительной способности противостоять окислению даже в ультрадисперсном состоянии. В связи с этим основное внимание в данной главе будет уделено именно золоту.
Следует отметить, что для нанометровых частиц физические постоянные имеют отличия от таковых компактного металла, которые зависят также от размера. Так, температура плавления золота с частицами размером 5 нм ( Аи3боо)а около 830 С, 2 нм ( Аи2оо) 350 С и 1 нм золото ( Аи3о) должно плавиться при 200 С [8]. Не остается постоянной и кристаллическая структура. По данным того же источника, среди наноразмерных кристаллов золота можно обнаружить усеченные октаэдры, икосаэдры, десятигранники Маркса и кубооктаэдры.
Особенно важным является то, что в ряду компактный металл - частица - кластер - атом благородного металла (Аи, Ад, Си) изменяется стандартный окислительно-восстановительный потенциал Е (bf /MtouUi) . Восстановительные потенциалы еще более понижаются в присутствии ПАВ и нуклеофильных лигандов таких как I2/SCN или 12/1". При этом становится возможным растворение компактного металла без царской водки и даже в присутствии NaBH4 [12].
Поверхностный плазмонный резонанс (ППР)
Промежуточными продуктами процесса нуклеации являются металл-лигандные полимерные комплексы (кластеры), состав которых связан с активностью восстановителя/ дентатностью лигандов и устойчивостью комплексов. Поверхность металлических наночастиц гидрозоля включает в состав коионного слоя лиганды восстановителя и анионы исходной соли. Металлические гидрозоли, получаемые без использования ПАВ и высокомолекулярных соединений, являются электростатически стабилизированными. Для получения золотых НСф в диапазоне 10 - 40 нм наиболее подходящим является метод Френса (цитратного восстановления ЗХВК). Наиболее устойчивые ультрадисперсные {3-6 нм) золи золота образуются при боргидрид-цитратном и боргидрид-ЭДТА восстановлении ЗХВК. Для получения изоморфных и изодисперсных золей с размерами частиц более 40 нм целесообразно использовать методики зародышевого роста. Формирование несферических стержневых наночастиц происходит в условиях фазовой анизотропности среды, обеспеченной наличием жестких или мягких матриц. Химическая анизотропия НСт усиливается при изменении состава металлического ядра частицы, добавлении легирующих металлов. Наиболее удобным способом контроля процессов образования металлоколлоидов являются методы спектроскопии поглощения и рассеяния света, поэтому следующая глава посвящена исследованию оптических свойств золей коллоидных металлов, главным образом, золота. Изучение оптических свойств золей золота и других металлов, начатое пионерскими работами Фарадея [1] , Жигмонди [18] и Ми [б], ведется уже более 150 лет. Обзор многочисленных работ по оптическим свойствам золотых частиц, суспендированных в воде, стеклянных матрицах, хлористом калии, желатине, полиметилметакрилате и других средах, а также напыленных на различные подложки, можно найти в книге [131], статье [132]. Повышение интереса к золотым ультрадисперсным золям, отмечаемое в последние два десятилетия {см., например, книгу [4 5] и фундаментальное руководство [133]), связано с многочисленными применениями КЗ в медико-биологических исследованиях. Совсем недавно новые литографические методы, так же как усовершенствования классических влажных методов химии, позволили синтезировать наночастицы благородных металлов в широких пределах размеров, форм и диэлектрического окружения. В статье [134] описывается прогресс, достигнутый в последнее время в теории оптических свойств наночастиц, в частности, методы решения уравнений Максвелла для рассеяния света от частиц произвольной формы в окружении сложного состава. Было включено описание качественных особенностей дипольного и квадрупольного резонансов плазмонной волны для сферических частиц; обсуждены аналитические и численные методы расчета сечений экстинкции и рассеяния, локальных полей и другие оптические свойства для несферических частиц. Темно-красный цвет золотых золей в жидких и твердых растворах отражает поверхностную плазмонную полосу. Широкая полоса поглощения в видимой области (приблизительно 520 нм) ППР возникает из-за коллективных колебаний электронного газа на поверхности наночастиц (6s электроны полосы проводимост для Au, Ag, Си), которые коррелируют с электромагнитным полем облучающего света, то есть возбуждением когерентного колебания полосы проводимости [135]. Поскольку плазмонные волны на высоких частотах локализованы вблизи поверхности металлов (скин-слой), резонансная поляризуемость металлических НЧ носит название поверхностной или локализованной поверхностью. Изучение ППР стало областью очень активного исследования и с научной и с технологической точек зрения, особенно когда частицы включены в ионные матриксы или стекла [136,137] . Например, в работе [138] основной интерес к ППР обусловлен применением его к фотографическому процессу. Таким образом, ППР обеспечивает значительное количество информации относительно образования резонансной полосы поглощения в металлах и был предметом обширного изучения оптических спектроскопических свойств металлических наночастиц [1,131,137,139] .
Природа ППР была рационализирована в публикации Ми 1908 г. Согласно теории Ми, полное сечение ослабления состоит из поверхностного плазмонного поглощения и рассеяния и задается суммированием по всем электрическим и магнитным колебаниям. Резонансы, обозначенные как поверхностные плазменные волны (плазмоны), были описаны количественно через решение уравнений Максвелла для сферических частиц с соответствующими пограничными условиями. Теория Ми приписывает плазмонную полосу сферических частиц дипольным колебаниям свободных электронов проводимости с энергетическим состоянием непосредственно выше уровня Ферми [140]. Все многочисленные последующие и недавние сообщения соотносят спектроскопическое поведение Au, Ag, Си НЧ с теорией Ми [138,141-145] .
Конъюгирование КЗ с олигопептидами и низкомолекулярными зондами
Несмотря на общую природу поглощения и рассеяния света металлическими частицами, а именно возникновение плазмонных волн вследствие поляризуемости, характеристика светорассеяния имеет свои отличительные особенности. К ним следует отнести сложную угловую зависимость интенсивности упруго рассеянного света (индикатрису), а также особенности взаимодействия с поляризованным светом (деполяризацию) [241].
В работе [242] спектроскопия резонансного светорассеяния (РСР) была использована для изучения взаимодействия между тиолсодержащим фармацевтическим тиамазолом с коллоидным золотом. Было отмечено, что при рН 5.2 пик РСР спектра находился при 555 нм и интенсивность его увеличивалась симбатно количеству добавляемого тиамазола вследствие лиганд-индуцуруемой агрегации КЗ, наблюдаемой также при помощи ТЭМ.
В работе [243] РСР, называемое авторами рэлеевским резонансом, в совокупности с данными поверхностно усиленного рамановского рассеяния (SERS), а также ТЭМ и темнопольной световой микроскопии (ТПСМ) предложено использовать для диагностики in vitro вируса бромной мозаики (brome mosaic virus), декорируемого изнутри капсида (28 нм) частицами КЗ (2.5 — 4.5 нм) . Оптические изменения в спектрах РСР объясняются парным взаимодействием частиц КЗ, заключенных в диссоциирующие и реассоциирующие вирусные частицы. При сближении частиц КЗ спектр РСР становится двухмодовым в отличие от одномодового, когда частицы находятся на значительных расстояниях друг от друга.
Крайбиг в 1996 г. отмечал [244], что формирование агрегатов частиц произвольного размера и формы сосредоточением малых частиц приводит к экстинкции и рассеянию света, отличным от таковых для изолированных частиц. Процесс агрегации может сопровождаться изменением спектров экстинкции и, угловой зависимости рассеяния света.
Введение новых параметров в схему измерения углового светорассеяния позволило эффективно отличать системы, содержащие только изолированные кластеры, от систем агрегированных кластеров. Это было достигнуто оценкой данных измерений света рассеянного прямо вперед, назад и под углом 90 , приводившей к отличному разрешению систем изолированных кластеров от агрегированных систем. Для измерения углового светорассеяния света системами коллоидных частиц благородных металлов обычная установка фотогониометра была изменена. Изменения в данных светорассеивания и экстинкции были качественно описаны моделью, которая принимает во внимание электромагнитное взаимодействие между металлическими кластерами в агрегате.
Заметным светорассеянием обладают также нанокольца [187]. Оптический ответ дискообразных и кольцеобразных золотых частиц изучался по анализу их сечения поглощения и рассеяния в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне. Для частиц 120 нм обнаружена строгая зависимость мод поглощения от фактических размеров частиц. В работе показаны как экспериментальные результаты, так и данные численного моделирования оптических свойств частиц в зависимости от их геометрии. Нанокольца показали также усиление резонансной спонтанной эмиссии, сфокусированной прямо вдоль оси частицы.
В работе [245] показано, что золотые и серебряные коллоиды имеют сильные цвета в результате электронных колебаний, индуцированных падающим светом, которые упоминаются как плазмонное поглощение. В работе описывается новый подход к разработке оптических датчиков, использующих светорассеивающие свойства наночастиц. Коллоидная агрегация была индуцирована авидин-биотиновым взаимодействием, которое сдвигало плазмонное поглощение в длинноволновую область. Авторы полагают, что этот сдвиг является следствием изменения светорассеяния при различных длинах волн падающего света. При проведении измерений отношения интенсивностеи светорассеяния при двух длинах облучающего света, эти измерения становятся независимыми от общей концентрации коллоидной фазы. Высокая эффективность рассеяния этими коллоидами была равнозначной интенсивности флюоресценции, нормализованной на оптическую плотность флюорофора и коллоида. Этот подход может быть использован в широком разнообразии методов приборного анализа, включая обычно используемые для обнаружения флюоресценции.
В работе [24 6], посвященной разработке визуально детектируемого генодиагностического метода твердофазного анализа вирусов гепатита "В" и "С" с использованием олигонуклеотид-тиол-золотых НЧ, основанной на технике сендвич-гибридизации (наноамплификации) и серебряного усиления, РСР использовали для оценки и мониторинга иммобилизации генных зондов на золотых наночастицах. Регистрацию РСР проводили с помощью спектрофлюориметра в режиме синхронизации возбуждения и приема (ДА, = 0).
В работе китайских ученых, опубликованной в 2001 г., спектроскопия резонансного рассеяния золотых наночастиц интерпретируется в терминах супермолекулярных межуровневых энергетических переходов [247]. "Золотые наночастицы были синтезированы по методу Френса с диаметрами от 10 до 95 нм. Каждый из золей показывал пик резонансного рассеяния при 580 нм. Механизм резонансного рассеяния для золотых наночастиц был объяснен согласно теории волнового движения наночастиц в жидкости. Принцип супермолекулярных межуровневых энергетических переходов был выдвинут и применен для объяснения взаимосвязи между диаметром и цветом золотых наночастиц в жидкости. Новый способ спектрофотометрического определения диаметра частиц предложен на основании взаимосвязи диаметров частиц со спектральными положениями максимумов абсорбции" [247].
И в заключение литобзора данного раздела отметим работу китайских же ученых, отличающуюся аналитической точностью и обстоятельностью. В ней [24 8] приводится метод количественного определения белков в растворах, основанный на резонансном светорассеянии коллоидным хлористым серебром. Чувствительность метода составляла 8 нг/мл с линейным диапазоном от 10 до 400 нг/мл белка в пробе.
Электронно-микроскопические исследования поверхностных структур бактерий и белков цитоскелета
В наших работах электронно-микроскопические исследования предпринимались, прежде всего, для выяснения морфометрических параметров частиц КЗ, что было необходимо для определения поправок оптических констант золота при вычислении спектров экстинкции и рассеяния гидрозолей КЗ {см. раздел 2.1.1) . Для этой цели строили гистограммы распределения частиц по размерам, оценивая не менее 300 частиц каждого препарата. Препараты, нанесенные на парлодиевые, укрепленные углеродом, гидрофилизированные поли-L-лизином, подложки, просматривали на микроскопах JEM 100-СХ (Jeol, Япония) или BS-500 (Tesla, Чехия). Стандартная подготовка препаратов в наших экспериментах выглядит следующим образом: - Каплю суспензии нанести на пленку "Parafilm" в объеме 20 мкл. Сверху поместить подготовленную сетку с подложкой. - Инкубировать в течение 10 - 20 мин. - При низкой концентрации частиц использовать тепловое прикрепление, удерживая сеточку пинцетом возле лампы накаливания, не допуская высыхания. - Удалить излишек жидкости, прикасаясь сеточкой к полоске фильтровальной бумаги. - Промыть сеточку на капле тридистиллированной воды, высушить и поместить в контейнер. Типичное изображение частиц коллоидного золота, получаемого по методу Френса, приведено на рисунке 4.1. Большое увеличение и хорошая контрастность изображения позволяют четко визуализировать границы объектов. Калибровку приборов по увеличению мы осуществляли по репликам с дифракционных решеток 1200 линий/мм. Поскольку используемые нами подложки отличались большой прозрачностью фона, для получения хорошего контраста и четкости изображений мы могли пользоваться самыми маленькими конденсорными и объективной диафрагмами, что, в свою очередь, обеспечивало нам максимальное разрешение. Интересно отметить, что образцы, подобные изображенным на рис. 4.1, можно использовать как тест-объекты для юстировки приборов по астигматизму, что гораздо удобней, чем получение "дырчатых" подложек. При изучении поверхностных структур бактериальных клеток рода Azospirillum [321,420], Agrobacterium [389] приготовление препаратов проводилось по аналогичному протоколу с вариантами мечения непосредственно на сетке. Тогда после этапа нанесения препарата включали дополнительные этапы блокировки мест неспецифической адсорбции 0.1% раствором БСА и инкубации на капле КЗ маркера. Альтернативно, мечение проводили в пробирках "Эппендорф" с отмывкой способом центрифугирования. На рисунке 4.2. приведена одна из первых наших электронных микрофотографий бактерии A. brasilense Sp 245, меченной конъюгатом КЗ-15 со штаммоспецифическими AT. Данная микрофотография иллюстрирует отсутствие взаимодействия AT, полученных против целых клеток бактерий, обработанных глутаровым альдегидом, с полярным жгутиком азоспириллы. Дополнительные исследования показали, что получаемые таким образом AT, специфичны только к О-антигену бактерий этого рода [421-423]. Этот иммунологический феномен недавно был убедительно доказан в .докторской диссертации Ларисы Юрьевны Матора [424].
В нашей работе в соавторстве с Чумаковым М.И. [38 9], с помощью иммуно-электронной микроскопии, в том числе, нам удалось показать, что агробактерии продуцируют прямые фибриллы как при взаимодействии с корнями пшеницы, так и в чистой культуре. Длинные прямые экстраклеточные нити непатогенных агробактерии, образующиеся как при выращивании бактерий в чистой культуре, так и при контакте агробактерии с корнями пшеницы, оказались чувствительными к обработке целлюлазой [389]. Была проведена иммуноцитохимическая идентификация поверхностных структур агробактерии с помощью меченых коллоидным золотом целлюлазы, антител к 0-специфическим липополисахаридам и антител к Vir-зависимым белкам. Показано, что специфические к УігВ2-белку антитела взаимодействуют с тонкими фибриллами, расположенными в виде пучка на одном из полюсов агробактериальной клетки с индуцированными vir-генами, но не взаимодействуют со структурами, соединяющими агробактерии в агрегатах клеток.
На рисунках 4.3, 4.4, 4.5 приведены электронные микрофотографии агробактерии, меченных различными КЗ-маркерами: целлюлазой (рис. 4.3), AT к О-специфическому АГ (рис. 4.4) и AT против V±rB2 белка (рис. 4.5). Обращает на себя внимание совершенно различный характер топографии маркеров, отражающих характер распределения экстраклеточного материала и степень его структурированности. В отличие от диффузно распределенных маркеров КЗ-целлюлаза и КЗ-АТ (О-АГ), КЗ-АТ (VirB2) локализован в области пучков пилеобразных структур на полюсах клеток (рис. 4.5).
Униформность и малые размеры маркеров, содержащих КЗ, делает их успешными при электронно-микроскопическом исследовании фибриллярных белков на уровне отдельных молекул. С помощью препарата КЗ-фаллоидин нам удалось показать, что этот маркер хорошо декорирует фибриллярный актин (рис 4.6).
