Введение к работе
Актуальность проблемы. Благодаря развитию современных методов визуализации биологических объектов (биоимиджинга), основанных на использовании флуоресцентных меток, флуорофоры стали одним из важнейших инструментов многих научных направлений. В настоящее время спектр флуоресцентных меток достаточно широк. Условно можно выделить три основные группы: 1) флуоресцентные белки; 2) органические красители; 3) флуоресцентные нанокристаллы - квантовые точки (КТ). Наиболее перспективными для развития методов биоимиджинга являются полупроводниковые КТ типа ядро/оболочка CdSe/ZnS, обладающие уникальными оптическими и фотофизическими свойствами, такими как широкий спектр поглощения, узкая симметричная полоса эмиссии, значительный стоксов сдвиг, высокая яркость, а также высокая устойчивость к фотовыцветанию. Положение максимумов в спектрах флуоресценции КТ строго зависит от их размеров, при этом для возбуждения нанокристаллов всех цветов достаточно одного источника излучения.
Перечисленные свойства КТ открывают широкие перспективы для их использования в качестве флуоресцентных маркеров для многоцветной визуализации биологических объектов in vivo. Однако главным фактором риска применения КТ является недостаток информации об их взаимодействии с живым организмом. На сегодняшний день остаются малоизученными биораспределение КТ как интактных наноразмерных объектов (при отсутствии адресного агента на поверхности), аспекты их взаимодействия с мишенями на разных уровнях организации живой материи, а также пути и скорости элиминации из организма млекопитающих. Имеющиеся исследования выполнены, в большинстве случаев, методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и касаются исключительно распределения кадмия, введенного в организм в составе КТ. При этом указанный метод не позволяет выявить различий между интактными КТ и частицами, которые были подвержены деградации до составляющих компонентов. Подтверждением целостности структуры КТ является сохранение ими способности флуоресцировать. Следовательно, существует необходимость в разработке комплексного подхода, основанного на использовании различных флуоресцентных методов, который позволил бы регистрировать специфическую флуоресценцию КТ на уровне целого организма in vivo, в органах и тканях ex vivo, а также в биологических пробах для получения полной картины метаболизма.
По-прежнему остается открытым вопрос о ключевых факторах, определяющих поведение нанокристаллов в организме животного. Большинство исследователей связывают характер биораспределения КТ исключительно с их размером и свойствами покрытия, однако вопрос о степени возможного влияния агрегатного состояния КТ на их биологические эффекты in vivo в литературе практически не освещен. Кроме того, в большинстве экспериментов использовалось преимущественно внутривенное введение КТ. Однако не менее важным вопросом является зависимость кинетики биораспределения КТ от способа поступления частиц в организм. При этом in vivo распределение при парентеральном введении или введении частиц в пищеварительный тракт изучалось лишь в единичных публикациях.
Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы исследования биораспределения интактных КТ как для целей биоимиджинга, так и для оценки общей биологической безопасности наночастиц.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение биораспределения и стабильности квантовых точек с разными полимерными покрытиями в организме мелких лабораторных животных в зависимости от способа введения.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработка методологического подхода для комплексной оценки биораспределения интактных КТ;
-
Исследование распределения и возможных путей экскреции КТ при разных способах введения (внутривенном, внутрибрюшинном и внутрижелудочном);
-
Исследование химической стабильности и влияния КТ на различные органы и ткани животных в зависимости от модификации их поверхности при разных способах введения;
-
Исследование влияния агрегатного состояния КТ на их распределение и токсические свойства.
Научная новизна. Предложен методологический подход, основанный на использовании комплекса флуоресцентных методов, для прижизненной неинвазивной визуализации и ex vivo мониторинга содержания интактных КТ в тканях экспериментального животного. Впервые показана возможность визуализации КТ в тканях методом флуоресцентного имиджинга с временным разрешением.
Проведен комплексный анализ особенностей биораспределения и путей экскреции интактных КТ с разными типами модификации поверхности в зависимости от способа поступления в организм: исследован внутривенный, внутрибрюшинный и внутрижелудочный пути введения. Впервые получены данные о зависимости биораспределения и токсических свойств КТ от их агрегатного состояния на момент введения. Показана перспективность использования КТ с двойной оболочкой на основе полимерного и кремнийорганического слоев для флуоресцентного биоимиджинга in vivo, что обусловлено высокой стабильностью их флуоресценции в условиях среды живого организма.
Практическая значимость работы. Предложенная методологическая модель визуализации распределения КТ в органах экспериментальных животных может служить основой для разработки стратегии скрининга полупроводниковых наночастиц, включающего получение первичной информации об их фармакокинетических свойствах (абсорбции, распределении, метаболизме, экскреции). Подобный скрининг позволит проводить эффективный отбор перспективных КТ как потенциальных объектов для целей биоимиджинга.
Идентификация КТ в тканях флуоресцентными методами с временным разрешением является перспективной альтернативой спектральным методам детекции КТ по интенсивности флуоресценции, в особенности в случаях высокого фонового сигнала тканей и органов.
Полученные результаты по биораспределению и токсическим свойствам КТ могут внести существенный вклад в понимание механизмов взаимодействия наночастиц с тканями животных в условиях in vivo.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: II International symposium «Topical problems of biophotonics - 2009» (Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 2009), Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009), XIV International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics «Saratov Fall Meeting-2010» (Saratov, 2010), 3rd Nanotechnology International Forum RUSNANOTECH 2010 (Moscow, 2010), III International symposium «Topical problems of biophotonics - 2011» (St.-Petersburg - Nizhny Novgorod, 2011), VI Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, 2011), Вторая международная научно-практическая конференция «Высокие технологии,
фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (230 ссылок). Диссертация содержит 152 страницы печатного текста, включает 62 рисунка и 14 таблиц.