Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Системы на основе фрагментов пурпурных мембран и фоточувствительных мембранных белков - родопсинов 9
1.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальных и зрительных родопсинов 9
1.1.2. Монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетт и Ленгмюра-Шефера 12
1.1.3. Пурпурные мембраны, адсорбированные на черных липидных мембранах и липидных бислоях других типов 19
1.1.4. Самоассоциация и послойная сборка пурпурных мембран 24
1.1.5. Электрофоретическое осаждение и седиментация пурпурных мембран 28
1.2. Гибридные нано-биоматериалы на основе пурпурных мембран 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. ПМ, суспензии с КТ и пленочные структуры 50
2.2 Получение золя AgНЧ 53
2.3 Контроль геометрических параметров нанообъектов 53
2.4 Запись спектров КР и ГКР 54
2.5 Флеш-фотолиз 55
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 57
3.1. Взаимодействие пурпурных мембран с различными электродами и проводящим полимером в фотовольтаической ячейке 57
3.2. Взаимодействие пурпурных мембран с квантовыми точками на границе раздела фаз 64
3.3. Влияние металлических наночастиц на свойства бактериородопсина: исследования методами комбинационного и гигантского комбинационногорассеяния 74
3.3.1 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-ПМ 80
3.3.2 Свето- и темно-адаптированные формы бактериородопсина в системе AgНЧ-ПМ 81
3.3.3 Изменение кинетики фотоцикла бактериородопсина, индуцированное AgНЧ 83
3.4. Влияние наночастиц Ag на свойства белка БР-D96N: исследования методами комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния 84
3.4.1 Исследование белка БР-D96N методом комбинационного рассеяния 85
3.4.2 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-D96N 88
3.4.3 Роль свето-адаптированного состояния БР-D96N в фотоцикле белка 89
3.4.4 Изменение кинетики фотоцикла белкаБР-D96N, индуцированное AgНЧ 91
Заключение 93
Условные обозначения и сокращения 94
Библиографический список 96
- Структурно-функциональные особенности бактериальных и зрительных родопсинов
- Электрофоретическое осаждение и седиментация пурпурных мембран
- Контроль геометрических параметров нанообъектов
- Влияние наночастиц Ag на свойства белка БР-D96N: исследования методами комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния
Введение к работе
Актуальность. Создание и структурно-функциональное исследование
супрамолекулярных систем на основе фоточувствительных мембранных белков и
наноструктур является перспективной и активно развиваемой задачей современной
биохимии, биотехнологии и физико-химической биологии [Audette et al., 2011;
Renugopalakrishnan et al., 2014; Zaitsev S.Yu., et al., 2012; Oesterhelt D., 1971;].
Необходимо отметить хорошо известный фоточувствительный белок
бактериородопсин (БР), содержащийся в пурпурных мембранах (ПМ) галофильных
бактерий Halobacterium salinarum, являющийся аналогом зрительных родопсинов
животных. Наличие хромоформной части – ретиналя позволяет использовать энергию
света для активного перемещения протона через мембрану в результате фотоцикла
БР. Для увеличения эффективности передачи световой энергии на белок могут
использоваться различные наночастицы типа полупроводниковых квантовых точек
(КТ) или металлических наночастиц. Формирование гибридных наноструктур на
основе БР (ПМ) с наночастицами или позволяет создавать новые нано-биоматериалы
с заданными свойствами для биохимии, биотехнослогии, сенсорики и фотоники.
Однако влияние разных типов наночастиц на биологические наноструктуры типа БР
до сих пор описаны не полностью. Разработка гибридных наноструктур требует
модификации свойств белка, которая позволяет управлять и оптимизировать эффекты
взаимодействия БР с наночастицами, наноструктурированными и
полупроводниковыми средами. Детальное исследование эффеков взаимодействия белка с неорганическими структурами позволит направленно конструировать бионаногибридные системы.
Цель работы: комплексное исследование фоточувствительных мембранных белков - аналогов родопсинов животных - и создание на их основе бионаногибридных структур с заданными свойствами.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить свойства фоточувствительных мембранных белков
бактериородопсина и БР-D96N в различных условиях среды.
2. Создать фотовольтаический элемент на основе ориентированного слоя БР и
исследовать влияние проводящего полимера и нескольких типов электродов на
свойства БР.
-
Оценить влияние солюбилизированных полупроводниковых квантовых точек на фотоцикл БР в суспензии и ориентированной бионаногибридной структуре.
-
Определить характеристики фотоциклов белков БР и БР-D96N при взаимодействии с наночастицами серебра.
Научная новизна. Найдены эффекты влияния квантовых точек на фотоцикл БР в суспензии, охарактеризованы скорости образования и распада основного интермедиата фотоцикла БР – М-формы. Определена возможность регулирования параметров фотоцикла БР, предложена схема указанных биохимических и биофизических процессов. Впервые получены ориентированные пленки ПМ с квантовыми точками характеризующиеся увеличением скорости образования и распада М-формы – основного интермедиата фотоцикла БР. Исследовано взаимодействие металлических наночастиц с мембранами на примере воздействия серебряных наночастиц (AgНЧ) на пурпурные мембраны. Обнаружено, что ПМ подавляют коагуляцию серебряного золя, необходимую для формирования активных областей гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Впервые показано, что воздействие AgНЧ подавляет фотоцикл БР в ГКР-активных областях связывания с AgНЧ. В областях слабого воздействия AgНЧ на БР происходит ускорение фотоцикла и ускорения распада М-формы. Также исследовано влияние AgНЧ на мутантную форму бактериородопсинаБР-D96N и показано, что процесс распада М-формы замедляется.
Теоретическая и практическая значимость полученных результатов.
Разработана модель позволяющая оценить эффекты влияния наночастиц на биологические структуры и использовать для создания бионаногибридных структур, которые обладают оптимизированными управляемыми характеристиками. В частности, возможность регулирования фотоцикла бактериородопсина за счет различных неорганических структур дает возможность направленно конструировать наногибридные системы, например наносенсоры. Гибридные наноэлементы обеспечат "наноразрешение" для применения в биомолекулярной электронике, оптическом переключении и фотовольтаике за счет преимуществ их размера, эффективности свето- и электро-контролируемых функций, надежной структуры, стабильности и низкой стоимости производства.
В ходе выполнения данной работы была создана уникальная научная установка «Система зондово-оптической 3D корреляционной микроскопии» (), данная УНУ создавалась в рамках проекта по соглашению с Минобрнауки РФ № 14.616.21.0042 (RFMEFI61615X0042). Также, часть работ данной диссертации проводили в течение выполнения гос. контракта № 11.G34.31.0050, а также гос. задания 4.624.2014/К от 17.07.2014. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА им. К.И. Скрябина для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам «Избранные главы биохимии», «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Свойства фоточувствительных мембранных белков бактериородопсина и БР-D96N закономерно изменяются в зависимости от условий среды.
-
Параметры фотовольтаического элемента на основе ориентированного слоя БР; влияние полимера и электродов на свойства элемента.
3. Влияние солюбилизированных полупроводниковых квантовых точек на
фотоцикл БР в суспензии и ориентированной бионаногибридной структуре.
4. Характеристики фотоциклов белков БР и БР-D96N при взаимодействии с
наночастицами серебра.
Методология и методы проведенных исследований.
В ходе выполнения исследования применялись методы и подходы, хорошо
зарекомендовавшие себя в ходе предыдущих работ по созданию и исследованию
гиборидных наноструктур. Основные примененные методы: сканирующая зондовая
микроскопия, в частности атомно-силовая микроскопия в контактной моде,
комбинационное и гигантское комбинационное рассеяние, динамическое рассеяние
света, абсорбционная спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия,
электрофоретическая седиментация, инфракрасная спектроскопия, флеш-фотолиз на импульсном однолучевом дифференциальном спектрофотометре с двойной монохроматизацией измеряющего света. Полученные данные обработаны на ПК по стандартным методикам с помощью программ глобального фитирования, Origin, GRAMS, математические методы обработки статистических данных.
Личный вклад соискателя. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение экспериментов, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии.
Степень достоверности и апробация работы.
Достоверность полученных результатов обусловлена тем, что: а) весь объем экспериментальной работы выполнен на сертифицированном оборудовании, была показана воспроизводимость научных результатов (каждое измерение выполнено не менее 3 раз); б) результаты, полученные автором, согласуются с литературными данными и данными, представленными в независимых источниках по данной тематике; в) экспериментальные данные обработаны с применением современных компьютерных программ.
Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на: международном семинаре «Nano-Bio Hybrid Materials with Photovoltaic and Energy Transfer Properties» (Реймс, Франция, 2012); 9 международном симпозиуме аспирантов «Horizons in Molecular Biology» (Геттинген, Германия, 2012); третьем международном симпозиуме «Molecular Photonics» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); третьем Российско-Греческом симпозиуме Bionanotox-2012 «Biomaterials and bionanomaterials: recent problems and safety issues» (Греция, 2012); шестой международной конференции по синтетической биологии «SB6.0: The Sixth International Meeting on Synthetic Biology» (Лондон, Великобритания, 2013); международном мастер-классе «Laser Physics» (Прага, Чехия, 2013); международной конференции SPIE Nanophotonics V (Брюссель, Бельгия, 2014); международной конференции «Science of the Future» (Санкт-Петербург, Россия, 2014); 1-ой Международной Школе-конференции «Saint–Petersburg OPEN 2014» (Санкт-Петербург, Россия, 2014); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию Института биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2014); международной конференции «Nanomeeting 2015» (Минск, Беларусь, 2015); международной конференции «Advances in Functional Materials Conference 2015» (Stony Brook University, США, 2015).
Опубликованные результаты. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ: 13 статей (в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ), 18 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 106 страницах машинописного текста, в том числе включают: 42 рисунка, 3 таблицы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, условные обозначения и сокращения, библиографический список. Список использованной литературы включает 97 источников, в том числе 88 зарубежных.
Структурно-функциональные особенности бактериальных и зрительных родопсинов
Схематическое изображение пурпурных мембран, адсорбированных на нано-бислойных липидных мембранах (нано-БЛМ) (а) и электрическая эквивалентная схема фотоактивированного бактериородопсина, адсорбированного на нано-БЛМ, DPhPC - 1,2-дифитаноил-глицеро-3-фосфохолин, DPPTE - 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-фосфотиоэтанол натриевая соль, ODA – октадециламин; (б). Cm и Rm — емкость и сопротивление нано-БЛМ; Ср и Rp — емкость и сопротивление пурпурных мембран; Ip — фотоуправляемый протонный ток, генерируемый бактериородопсином. В условиях короткого замыкания падение напряжения на мембране (Vm) равно таковому на пурпурной мембране (Vp.). I — измеряемый ток. Адаптировано из [45]. Считается, что в таком случае ПМ адсорбированны периплазматической стороной на БЛМ, причем достигается высокая степень ориентации ПМ с транспортом протона из среды на БЛМ. Однако конкретных значений для степени ориентации ПМ или подобных количественных характеристик, являющихся ключевыми величинами для гибридных нано-биоструктур, ни в одной из известных в этой области работ не приводится. Удивительно, что в подобных системах авторы не наблюдают или, по крайней мере, не обсуждают возможное встраивание ПМ в БЛМ, особенно учитывая наличие достаточно большого числа молекул липидов в структуре ПМ. Однако косвенным указанием на возможность такого рода «перестройки» двух бислоев в один «смешанный» бислой является существенное уменьшение величин фотопотенциалов, регистрируемых при длительных экспериментах в таких системах. Существует большое число более ранних модификаций указанного выше метода получения системы ПМ на БЛМ, среди которых можно выделить адсорбцию ПМ (реже — везикул очищенного БР или его мутантных штаммов) на липид-импрегнированные фильтры, тонкие коллоидные или тефлоновые пленки. В целом, для характеристики свойств таких систем используются традиционные схемы регистрации изменений тока или потенциала (Рис. 1.4б), возникающих при облучении пленки светом в видимой области. В ряде современных работ в этой области [27, 28, 45] развивается идея адсорбции ПМ на БЛМ, адсорбированных, в свою очередь, на пористых металлических или полимерных подложках (так называемые «микро-БЛМ» или «нано-БЛМ»). В таких структурах [45] величина фототока составляет более 150 нАсм-2 (Рис. 1.5), однако требуется около 40 минут для адсорбции ПМ на БЛМ, что технологически не очень удобно. Другим примером достаточно простых гибридных систем на основе ПМ являются смешанные бислои липидов и ПМ, представленные в работах [27, 28]. Рисунок 1.5 - Характеристики фототока (J – плотность фототока) до и после добавления пурпурных мембран (ПМ) к бислойным липидным мембранам. Фототок до (-ПМ) и после (+ПМ) добавления ПМ к нано-БЛМ (а); (+ПМ): первый и второй переходы соответствуют включению и выключению света. Ток был зарегистрирован через 40 мин после добавления ПМ; (-ПМ): прямая на графике соответствует сигналу тока, записанному до добавления ПМ (смещена на -50 нA/см2). Никаких значительных фото-артефактов зафиксировано не было. Временная зависимость максимальной плотности тока после добавления ПМ (Джмакс-вкл.). Максимум тока наблюдается после 40 мин (б). Адаптировано из [45].
В данном случае, первым этапом является модификация поверхности ртутно-капельного электрода поверхностно-активными тиолами, вторым — перенос монослоя фосфолипидов (DOPC или DOPS) с границы раздела вода/воздух на тиол-модифицированную поверхность ртутно-капельного электрода, а третьим — перенос ПМ на сформированную таким образом гетероструктуру. При фотоактивации данной системы наблюдался отрицательный ток (до -1.45 нА), тогда как при выключении освещения — положительный сигнал (до 0.45 нА), причем в обоих случаях рН составлял 6.0. Существенно меньшие значения фототока наблюдаются при очень низких (меньше 2) и при очень высоких (больше 10) величинах рН [28].
Более технологичным подходом для создание фотоячеек на базе системы ITO/ПМ/Au является использование проводящих полимеров, что описано в работе [59]. Ориентация ПМ достигалась путем воздействия внешнего электрического поля на слой ПМ на субфазе. Ориентированный слой ПМ был перенесен на стеклянную подложку с напыленным ITO методом Ленгмюра-Шефера. Золотой электрод изготавливали испарением золота на ITO/ПМ. Гибридная система ITO/ПМ/Au характеризовалась фототоком с разностью потенциалов 5 мВ при размере образца ячейки 33 мм. В дальнейшем авторами была использована другая система для изготовления молекулярного электрода. Для создания мультислойной гибридной нано-биоструктуры использовался проводящий полимер поли(o-анизидин) (POAS), который переносили на стеклянную подложку методом Ленгмюра-Блоджетт с получением в итоге системы стекло/POAS/ПМ/POAS [59].
Таким образом, важно различать ленгмюровские пленки ПМ (или БР), как «одноуровневые» слои из одного вида молекулярно интегрированных БР, и адсорбированные пленки ПМ на БЛМ и других бислойных мембранах, как «двухуровневые» слои, состоящие из бислоя липидов, на котором находится БР-липидный слой [59, 73, 76]. Последние типы систем можно считать более адекватными моделями гибридных нано-биоструктур, поскольку они состоят из наноразмерных и молекулярно интегрированных бислоев на границе раздела фаз с заданными строением и функциями.
Электрофоретическое осаждение и седиментация пурпурных мембран
В приведенном выше эксперименте две длины волны освещения накладываться друг на друга на протяжении всего процесса, когда источник света включен. Таким образом, процесс освобождения и захвата протона происходит внутри мембраны неоднократно и очень быстро, т.е. протоны не уходят в межклеточное пространство, что обьясняет генерацию стационарного фототока в этих условиях. Следует отметить, что предложенная авторами [49] модель не является достаточно обоснованной, поскольку ряд авторов [34, 46, 78, 87] уже рассматривали одновременное освещение БР двумя источниками света с длинами волн 570 нм и 412 нм. Если использование гибридной системы КТ/БР в такой схеме действительно приводит к указанным авторами [49] специфическим параметрам, что еще требует независимых подтверждений, то это может обеспечить основу для создания новых типов многофункциональных систем.
С другой стороны, авторы [36] предложили необычный метод получения структур с чередующимися слоями КТ/БР, что дает увеличение сигнала БР на 23% по сравнению с БР-электродами без КТ. Авторами были получены 2 системы: I — немодифицированный БР и КТ (575 нм) общей структуры CdSe/ZnS; II — биотинилированный БР, который эффективно связывается со стрептавидиновой оболочкой таких же КТ. Как хорошо известно, константа связывания биотин-стрептавидин составляет 410-14 М. Система I, где КТ нанесены на поверхность пленки ПМ, характеризуется 54.0% уменьшением флуоресценции КТ по сравнению со стандартным слоем КТ на стекле. Для системы II тушение флуоресценции составляло 43.8%, т.е. небольшое изменение расстояния между КТ и БР (на 1-1.5 нм) за счет оболочки КТ приводит к заметным изменениям флуоресценции КТ. Этот эффект объясняется тем, что процесс ФРПЭ очень чувствителен к расстоянию между донором и акцептором (КТ и БР) в нанометровом диапазоне. Полученные спектры флуоресценции [36] доказывают, что только «биотинилированные» ПМ способны связывать «стрептавидиновые» КТ, увеличивая расстояние между КТ и БР до 6-8 нм. Максимальные величины фотовольтаических параметров при освещении системы II составляют 306 мВ (при включении света) и -200 мВ (при выключении света), тогда как без КТ они равны 249 и -158 мВ, соответственно [36]. Соотношение этих значений изменяется от 1.55 (система ПМ/КТ) до 1.42 (только ПМ на электроде), что совпадает с величиной, ранее полученной для ПМ-электродов в других работах (1.5). Таким образом, использование системы стрептавиин-биотин приводит к специфическому взаимодействию КТ с БР на расстоянии порядка ферстеровского радиуса, что приводит к увеличению на 23% фотовольтаичных параметров [36]. Интерес к коммерческой реализации таких систем демонстрирует заявка на патент [31], в которой описана пленочная многослойная структура на основе слоев БР и КТ. В этой работе продемонстрированна возможность получения электрического отклика (скачков потенциала) гибридных систем при фотоактивации. В работе [37] описана нанобиогибридная система, содержащая КТ (CdSe/ZnS) и БР. Показано, что при расстоянии в 3.5 нм между донором и акцептором происходит перенос 88.2% энергии КТ, а при расстоянии в 8.5 нм — 51.1% энергии. Эти данные близки к значению теоретически рассчитанного ферстеровского радиуса для системы КТ/БР, который составляет 7.94 нм. Эффективное время жизни КТ в возбужденном состоянии уменьшилось с 18.0 до 13.3 нс. Авторами обсуждаются возможности систем КТ/БР в солнечных батареях, биосенсорике, оптоэлектронике, биокомпьютерных и других технологиях [37].
Для создания альтернативной системы монослоев КТ и БР на проводящей поверхности ITO-электрода авторами [35] предложено использовать ионные самоассоциируищися монослои (I-SAM). В качестве материала I-SAM выступал хлорид полидиаллилдиметиламмония (ПДАДМАХ), который наносили на ITO-электрод методом Ленгмюра-Блоджетт. Затем наносились следующие слои (в скобках — период адсорбции): БР (5 мин), КТ (10 мин), ПДАДМАХ (5 мин). По такой схеме были получены бислойные структуры (БР/ПДАДМАХ и КТ/ПДАДМАХ) и трислои (БР/ПДАДМАХ/КТ) [35]. Показано, что бислои БР/ПДАДМАХ имеют адсорбционный максимум при 570 нм, величина которого линейно увеличивается с возрастанием числа бислоев (авторами исследовано от 2 до 12 бислоев). Однако фотовольтаический ответ пленки I-SAM с адсорбированными 12 бислоями БР/ПДАДМАХ практически соответствовал системе, состоящей из 3 подобных бислоев. С другой стороны, была получена линейная зависимость величины интенсивности максимума флуоресценции КТ (при 570 нм) от числа бислоев КТ/ПДАДМАХ. В дальнейшем таким же образом была изучена тройная система, содержащая следующую последовательность слоев: ITO-ПДАДМАХ-(БР/ПДАДМАХ/КТ)n, где n=1-6 [35]. Эти результаты свидетельствуют о линейном возрастании флуоресценции КТ, если брать только точки, соответствующие полному переносу трислоя, т.е. целым значениям n, причем авторы обнаружили 20% уменьшение флуоресценции КТ для каждого трислоя по сравнению с таковой для бислоя КТ/ПДАДМАХ. Указанный эффект подтверждается тем, что такое же 20% уменьшение флуоресценции КТ наблюдалось и в случае «неполных» трислоев типа ПДАДМАХ/БР на поверхности каждого полного трислоя. Этот эффект тушения флуоресценции объясняется переносом энергии с КТ на БР по типу ФРПЭ, что показывает возможность создания нанобиогибридных структур с контролируемой мультислойной «архитектурой» БР и КТ на поверхности I-SAM.
Thavasi и соавт. [82] опубликовали обширное сравнительное исследование БР дикого типа и его тройного (3Glu) мутанта [E9Q/E194Q/E204Q] в комбинации с широким полупроводником TiO2 и показали их пригодность в качестве эффективных биосенсибилизированных солнечных батарей. В частности, методом дифференциальной сканирующей калориметрии показана тепловая устойчивость как БР дикого типа, так и его 3Glu-мутанта, а молекулярным моделированием рассчитана благоприятная для электронного переноса привязка БР и 3Glu-мутанта к атомам кислорода в подложке TiO2. Из сравнения полученых характеристик таких солнечных элементов следует, что 3Glu-мутант показывает лучшую фотоэлектрическую производительность по сравнению с БР дикого типа, давая плотность фототока короткого замыкания порядка 0.09 мАсм-2 и фотопотенциал 0.35 В при освещенности 40 мВтсм-2 [82].
Еще одно важное направление исследований в этой области — изучение влияния на БР плазмонных эффектов поля наночастиц золота и серебра [13, 14, 25, 65, 92, 93], спектры которых перекрываются с М-формой (Рис. 1.13) [25].
Контроль геометрических параметров нанообъектов
Природные ПМ способны использовать только 0,5% солнечного света. Последние нано-биоинженерные подходы с использованием квантовых точек (КТ) позволяют повысить "светособирающую способность" ПМ. Известно [4, 19, 53, 57, 69, 96], что освещение КТ в области их поглощения вызывает некоторые специфические эффекты, в том числе Фёрстеровского резонансого переноса энергии в присутствии акцептора, такого как фоточувствительный белок. Основным преимуществом использования системы ПМ С КТ является возможность ФРПЭ, который улучшает функцию БР в гибридном материале, состоящем из ПМ и КТ [19, 52, 69, 96]. Тем не менее, неорганические нанокристаллы, находясь в непосредственном контакте с ПМ, могут оказывать некоторые эффекты на БР, которые не связаны непосредственно с ФРПЭ. Было проведено исследование влияния КТ на ПМ, в частности, на фотоцикл БР. Данный эффект имеет как фундаментальное, так и практическое значение, особенно для развития новых био-наногибридных материалов.
КТ, являясь энергетическими преобразователями, поглощают свет в широком диапазоне энергий фотонов (рис 3.5, кривая 1), могут флуоресцировать (Рисунок 3.5, кривая 2) и передавать собранную энергию БР (в ПМ) с высокой эффективностью [49] из-за широкого перекрытия полос флуоресценции КТ (рис 3.5, кривая 2) и поглощения ПМ (рисунок 3.5, кривая 3).
Из серии КТ с флуоресценцией при 470 нм, 540 (536) нм, 570 нм и 640 нм были выбраны наиболее подходящие для создания систем ПМ-КТ. Спектры флуоресценции КТ и поглощения БР представлены на рисунке 3.6.
Для КТ570 наблюдалось наилучшее перекрытие полосы флуоресценции с полосой поглощения БР (рис. 3.5). Рисунок 3.5. Спектр поглощения (1) и флуоресценции (2) КТ570, и спектр поглощения суспензии ПМ (3).
Спектры флуоресценции различных КТ и поглощения БР. Для серии КТ были измерены размеры и -потенциал (Рис. 3.7 - 3.10). По данным динамического рассеяния следует, что точки КТ540 довольно сильно агрегированы – более 80% частиц имеют размер порядка 190 нм. Это может объяснять причину довольно слабого влияния на фотоцикл БР, также причиной может может служить заряд точек. Для КТ измерения зета-потенциала дали значения -4.5 мВ, -44 мВ и +62 мВ почти в равных долях, а для КТ570 и распределение по размерам было вполне гомогенным (80% дало пик 8.7 нм) и зета-потенциал на 86% имел значение -11 мВ.
Величина -потенциала солюбилизированных КТ570 КТ470, КТ540 и КТ640 практически одинаково влияли на кинетику М-формы, образованной на короткую лазерную вспышку 532 нм, хотя полосы флуоресценции 470 нм и 640 нм плохо перекрываются с полосой поглощения БР, а КТ540 – хорошо (рис. 3.11). И по кинетическим кривым затухания флуоресценции КТ отчетливо видно, что только в случае смеси БР с КТ540 и КТ570 наблюдается уменьшение времени жизни, что может свидетельствовать о ФРПЭ (Рис. 3.12). Для точек 470 и 640 времена жизни практически не изменялись. КТ540 тушились молекулами БР лучше, чем точки КТ570, а влияние на кинетику фотоцикла БР последних было гораздо сильнее.
Кинетические измерения проводились в 100 мМ натрий-фосфатном буфере и 100 мМ KCl, pH 7.3. Точки исходно были разной концентрации (соответственно для точек 470, 540, 570 и 640 концентрация в основном растворе была 325 мкМ, 54 мкМ, 38 мкМ и 0,9 мкМ). При измерении времен жизни КТ в качестве контроля были использованы такие же концентрации точек в буфере без ПМ.
Важным результатом [95] экспериментов с фотоактивацией смесей ПМ-КТ570 является то, что энергия, собираемая КТ570, вероятно, передается на БР по механизму ФРПЭ с высокой эффективностью (рисунок 3.13). ФРПЭ подтверждается значительными изменениями в интенсивности флуоресценции раствора КТ570 ( 1 M) после добавления суспензии ПМ с различными концентрациями (от 0,25 до 6 M хромофора БР) (рис 3.13а). Выраженное снижение времени жизни фотолюминесценции КТ570 в присутствии КТ (при молярном соотношении КТ570:БР 1: 9; 1,4: 9 и 2: 9) (рис 3.13б, в) также подтверждают ФРПЭ эффект.
Помимо суспензионных систем ПМ-КТ, описанных выше, были созданы ориентированные слои ПМ, содержащие солюбилизированные КТ. Ориентированные слои получали методом электрофоретического осаждения суспензии ПМ-КТ на прозрачный ITO-электрод. Существует ряд опубликованных данных о фоточувствительных параметрах БР в присутствии различных веществ и при различных условиях, однако данное исследование является первым, которое демонстрирует, что КТ вызывают значительные изменения в кинетике поглощения ПМ (БР) при 410 нм (рис. 3.15). Средние времена увеличения поглощения 40±1 с в ПМ-КТ комплексах и 105 ±2 с в ПМ суспензии; среднее время уменьшения поглощения 4,9±0,2 мс и 5,6 ±0,4 мс, соответственно.
Средние времена увеличения фотопотенциала для ПМ-КТ комплексов были 20,5 ± 1 с и 84,0 ± 3 с в случае суспензии ПМ; средние времена снижения фотопотенциала 306 ± 50 мс и 872 ± 35 мс, соответственно. Увеличение скорости роста фотопотенциала в случае системы ПМ–КТ570 (рис. 3.16) может быть связано с ускорением образования М-формы. Эти изменения особенно заметны на стадии уменьшения фотопотенциала (рис. 3.16), которая может быть объяснена как распад М-формы, вызванный протонированием основания Шиффа ретиналя.
Кинетика лазерно-индуцированных параметров смесей ПМ: (а) Кинетика изменений оптической плотности индуцированных лазером при 410 нм (пика поглощения М-форы) (1) суспензия ПМ и (2) суспензия ПМ-КТ570 с молярным соотношением БР:КТ570 4: 1. Пунктирная линия показывает фактическую кинетическу. Сплошная линия является результатом мультиэкспоненциального фитинга. Рисунок 3.16 - (б) Кинетика лазерно-индуцированной генерации фотонапряжения (1) ориентированной пленки ПМ и (2) аналогичной пленки, полученной из смеси ПМ-КТ570. Амплитуда кривой 2 в несколько раз выше по сравнению с уровнем основного образца, так как добавление отрицательно заряженных КТ к суспензии ПМ значительно снижается степень ориентации ПМ фрагментов в смешанной пленке. Пунктирная линия показывает фактическую кинетическу. Сплошная линия является результатом мультиэкспоненциального фитинга. Кинетические изменения (рис. 3.15) могут быть отнесены к разным скоростям образования и распада М-формы за счет депротонирования и репротонирования основания Шиффа ретиналя в БР. Эффект КТ на фотоцикл БР можно объяснить несколькими факторами. Первый специфические изменения (реорганизация) в "микроокружении" поверхности мембраны из-за небольших изменений рН, вызванных адсорбцией солюбилизированных КТ. Второй -изменение мембранного потенциала ПМ из-за "эффекта поля" при адсорбции КТ на поверхность, т.к. КТ имеют отрицательный заряд (их дзета-потенциал составляет около -5 мВ). Это объяснение подтверждается хорошо известными изменениями в скорости образования М-формы и распада при адсорбции катионов тяжелых металлов на поверхность ПМ и изменениями потенциала ПМ или внешнего электрического поля [29]. В целом, воздействие на кинетические параметры фотоцикла БР можно объяснить изменениями в структуре ПМ вызванного адсорбцией КТ на поверхность, однако, конкретный механизм этих изменений остается неясным.
В целом, было обнаружено выраженное влияние КТ на свойства ПМ. Это имеет как фундаментальное значение (для изучения молекулярных механизмов фоторецепции), так и потенциальное практическое значение (в том числе для производства био-наногибридных материалов). Таким образом, были получены образцы ПМ–КТ570 способные к ФРПЭ и характеризующиеся увеличением скорости образования и распада М-формы. Эффекты, наблюдаемые в системе ПМ–КТ570 значительно сильнее по сравнению с комбинациями ПМ с другими синтезированными КТ. Выраженные изменения в кинетических параметрах фотоцикла БР можно объяснить локальной реорганизацией структуры мембраны, вызванной адсорбцией КТ на поверхности ПМ.
Авторами предлагается использовать систему ПМ–КТ570 в качестве основы для новых био-нано гибридных материалов с улучшенными параметрами, что важно с точки зрения развития бионанотехнологических подходов для формирования фотоэлектрических элементов и оптико-электронных приборов.
Влияние наночастиц Ag на свойства белка БР-D96N: исследования методами комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния
Cпектры ГКР БР-D96N и БР-ДТ существенно отличаются (рис. 3.23, спектры 2 и 1, соответственно). В частности, спектр ГКР БР-ДТ содержит главным образом линии валентных колебаний двойных (сильная линия 1528 см-1, валентные C=C колебания основной формы БР-ДТ) и одинарных связей атомов углерода (1008 см-1 и 1163 см-1). В ГКР спектре БР-D96N валентные колебания одинарных связей проявляются в виде слабой линии около 1163 см-1 и очень слабой линии 1008 см-1. Зато усилены линии деформационных колебаний С-Н в области 1250-1450 см-1. В области валентных колебаний двойных связей 1500-1650 см-1 БР-D96N присутствуют линии характерные для основного состояния белка (1528 см-1), для М-формы (1568 см-1) и линия, соответствующая валентным C=N колебаниям (1635 см-1). При этом, в отличие от БР-ДТ, в спектрах ГКР БР-D96N все три линии имеют примерно равную интенсивность. Эти спектральные признаки указывают на значительное содержание депротонированной М-формы мутанта БР-D96N. Рисунок 3.23 - ГКР спектры свето-адаптированной формы БР (1) и БР-D96N (2), и разностный спектр свето-адаптированной формы минус темно-адаптированная форма БР-D96N (3) [7]. В отличие от КР включение/выключение модулирующего синего излучения никак не влияет на вид спектров ГКР. Это означает, что и в случае БР-D96N наблюдается тот же эффект, как и в случае БР-ДТ, эффект «замораживания» состояния белка в результате воздействия AgНЧ в ГКР активных областях.
Чтобы оценить роль состояния, в котором находится белок в момент взаимодействия с AgНЧ, мы использовали для инкубации с наночастицами БР-D96N в свето-адаптированной и темно-адаптированной формах. Темно-адаптированная форма была получена путем выдерживания ПМ, содержащих БР-D96N в темноте не менее 24 часов. Инкубацию проводили также в отсутствии света. На рис. 3.23 (кривая 3) приведен разностный спектр: светоадаптированная форма БР-D96N минус темноадаптированная форма БР-D96N. Изменения наблюдаются в области деформационных колебаний C-H ретиналя и его метиленовых групп (1300-1500 см-1), а также в области валентных колебаний двойных связей атомов ретиналя (1500-1650 см-1). Изменения в области (1300-1500 см-1), по-видимому, связаны с изменениями во взаимодействиях между ретиналем и полипептидным окружением. Более информативной является область валентных колебаний двойных связей. Отрицательный сигнал в области 1528 см-1, который указывает на то, что в темно-адаптированной форме белка в основном состоянии больше, чем в светоадаптированной. Относительное содержание М-формы одинаково, на что указывает отсутствие изменений в области колебаний, соответствующих М-форме около 1568 см-1. Положительный сигнал в области валентных колебаний C=N указывает, что конформация депротонированного основания Шиффа для этих двух случаев различна. Таким образом, показана зависимость формы в которой AgНЧ фиксируют БР-D96N от формы в которой он находился в момент связывания.
Необходимо отметить, что различия в ГКР спектрах малы. Гораздо большие различия наблюдаются при сравнении ГКР спектров БР-ДТ и БР-D96N. Согласно данным ГКР, в ГКР активных областях AgНЧ фиксируют БР-ДТ преимущественно в основном состоянии. В отличие от БР-ДТ, в результате взаимодействия БР-D96N с AgНЧ, значительная часть молекул белка необратимо переходит в депротонированную М-форму. Следует отметить, что согласно данным спектроскопии поглощения в отсутствии света БР-D96N находится преимущественно в основном состоянии. Переход и «замораживание» БР-D96N в депротонированной М-форме является результатом воздействия AgНЧ в ГКР активных областях. Таким образом, в конкуренции эффекта начального состояния белка и модификации состояния в результате взаимодействия с AgНЧ, большее значение имеет модификация, обусловленная воздействием наночастиц. 3.4.4 Изменение кинетики фотоцикла белкаБР-D96N, индуцированное
На рис. 3.24 показаны результаты кинетических измерений изменения значения поглощения БР на длине волны 410 нм, после запуска фотоцикла коротким световым импульсом (532 нм). Сопоставлены данные по влиянию AgНЧ на фотоцикл мутантаБР-D96N (группа кривых 1-3) и БР дикого типа (кривые 4-6). В отличие от БР ДТ, для которого воздействие AgНЧ ускоряет фотоцикл, в случае мутантаБР-D96N фотоцикл существенно замедляется. Роль коагулянта в этом случае сказывается не столь сильно.
Кинетические измерения полосы при 410 нм БР-D96N (1-3) и БР (4-6): только белок (1) и (4), белок инкубированный с AgНЧ (2) и (5), белок с AgНЧ инкубированный с коагулянтом (3) и (6) при рН раствора 9.2 [7]. Суммируя можно заключить, что AgНЧ индуцируют процесс перехода белка в то состояние, в котором белок преимущественно фиксируется в ГКР активных областях. В случае БР-ДТ, это основное состояние. Переход в него ускоряется присутствием AgНЧ. В случае мутанта БР-D96N, это М-форма. Здесь, наоборот, процесс распада М-формы замедляется.
Таким образом, выявлен эффект влияния серебряных наночастиц AgНЧ на мутантную форму фоточувствительного белка бактериородопсина БР-D96N, содержащегося во фрагментах пурпурных мембран. Показано, что AgНЧ эффективно связываются с поверхностью ПМ. Это позволяет записать ГКР спектры БР-D96N. Обнаружено, что воздействие AgНЧ на БР-D96N в ГКР-активных областях, проявляется в замораживании фотоцикла белка. Фотоцикл этих молекул белка не инициируется и они не дают вклада в кинетические измерения методом флеш-фотолиза. На образцах свето-адаптированной и темно-адаптированной форм БР-D96N выявлен слабый эффект влияния состояния белка, в котором он находился в момент связывания с AgНЧ на вид фиксированной наночастицей формы БР-D96N. Существенно большую роль играет изменение состояния БР-D96N, индуцированного наночастицей. Обнаружено, что AgНЧ в ГКР-активных областях способны не только изменять, но и «замораживать» измененное состояние БР-D96N. Это объясняется тем, что в результате воздействия AgНЧ в ГКР-активных областях увеличивается содержание депротонорованной М-формы белка БР-D96N.