Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1 биохихимическиеаспектыразвитиясахарногодиабета второготипа 11
1.1.1 Роль протеинкиназы С тета в развитии инсулинорезистентности 11
1.1.2 Роль воспаления в развитии инсулинорезистентности 14
1.2 Биохимичскиеэффектыимеханизмыдействия инкретиномиметиков 17
1.2.1 ГПП-1(7-36)амид 17
1.2.2 Влияние GLP-1(7-36)амида и GLP-1(9-36)амида на коррекцию сахарного диабета второго типа 21
1.2.3 Экстрапанкреатические эффекты ГПП-1Р 25
1.2.4 Влияние ГПП-1(7-36 амид) на коррекцию артериальной гипертензии 27
1.3 Коррекциясахарногодиабета,основаннаянаприеме инкретиномиметиков 31
1.3.1 Синтетические аналоги ГПП-1 31
1.3.2 Ингибиторы ДПП-4 34
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 37
2.1 Объекты исследования 37
2.2 Животные 40
2.3 Экспериментальныемодели 44
2.3.1 Определение активности ДПП-4 in vitro с использованием рекомбинантного человеческого фермента и фермента, содержащегося в плазме крови крыс 44
2.3.2 Модель стрептозотоцин-никатинамид индуцированного сахарного диабета 47
2.3.3 Методика определения константы Михаэлиса (Кm) 50
2.3.4 Определение ингибирующей активности исследуемых веществ in vivo 51
2.3.5 Модель экспериментального метаболического синдрома 53
2.3.6 Оценка цитотоксичности КЛС-073. Микротетразолиевый тест 56
2.3.7 Оценка влияния КЛС-073 на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАРК р-38 57
2.3.8 Оценка влияния КЛС-073 на основные биохимические показатели при его длительном (360 дней) ежедневном введении лабораторным животным 60
2.3 Анализ данных 66
Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 68
3.1 Оценка активности исследуемых веществ в отношении ДПП-4 плазмы крови крыс in vitro 68
Примечание: н/и - отсутствие ингибирующего действия. з
3.2 Оценка активности исследуемых веществ в условиях патологии углеводного обмена (модель стрептозотоцин-никотинамид индуцированного сахарного диабета) 70
3.3 Результаты определения ингибирующей активности КЛС-073 в отношении активности ДПП-4: рекомбинантного человеческого и нативного крысиного 76
3.4 Результаты определения константы Михаэлиса (Кm) 81
3.5 Результаты определения ингибирующей активности КЛС-073 in vivo на интактных животных 84
3.6 Результаты оценки цитотоксичности КЛС-073. Микротетразолиевый тест
3.7 Результаты оценки влияния КЛС-073 на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАРК р-38 98
3.8 Результаты определения влияния КЛС-073 на основные биохимические показатели при его длительном (360 дней) ежедневном введении лабораторным животным 101
ГЛАВА IV. Заключение 109
Глава V. Выводы 115
Практические рекомендации 116
Список сокращений и условных обозначений 117
Список литературы 120
- Биохимичскиеэффектыимеханизмыдействия инкретиномиметиков
- Определение активности ДПП-4 in vitro с использованием рекомбинантного человеческого фермента и фермента, содержащегося в плазме крови крыс
- Оценка активности исследуемых веществ в условиях патологии углеводного обмена (модель стрептозотоцин-никотинамид индуцированного сахарного диабета)
- Результаты оценки цитотоксичности КЛС-073. Микротетразолиевый тест
Введение к работе
Актуальность исследования
В настоящее время заболевания, обусловленные патологией углеводного обмена (сахарный диабет, метаболический синдром), являются социально значимой проблемой.
Данные заболевания, в частности, сахарный диабет (СД) демонстрируют стремительную распространенность. Число больных СД в России в 2000 году составляло 2,067 млн., а в 2010 году уже было зарегистрировано 3,16 млн. случаев (Дедов И.И. и др. 2013). Ежегодно количество больных СД возрастает на 6-10% и удваивается в течение 12-15 лет (Сунцов Ю.И. и др., 2011). Примерно 90% от общего числа больных сахарным диабетом приходится на II тип болезни (СД2). Кроме того развитие СД2 сопровождается возникновением сопутствующих заболеваний: артериальной гипертензией, ангиопатией, ожирением, дислипопротеинемией.
В настоящее время для лечения СД2 используют комбинированную терапию. Золотой стандарт терапии СД2 включает прием метформина с препаратами сульфонилмочевины. Однако на фоне применения данной комбинации не достигается полного контроля гипергликемии, может отмечаться чрезмерная гипогликемия и даже наблюдается увеличение массы тела (Nauck M. et al., 2009). Кроме того применение препаратов сульфонилмочевины может способствовать развитию сердечнососудистых осложнений (Недосугова Л. В., 2013).
В связи с вышеперечисленным продолжается поиск биохимических мишеней для коррекции патологии углеводного обмена, в частности для лечения СД2.
В последние годы особое внимание во всем мире уделяется изучению роли гормонов и гормоно-подобных веществ желудочно-кишечного тракта в регуляции секреции инсулина. Одним из наиболее перспективных гормоноподобных веществ, влияющих на гомеостаз глюкозы является глюкагонподобный пептид 1 (ГПП-1), а именно его наиболее активной формы ГПП-1(7-36) амид (Green B. D., Flatt P. R., 2007). Повышение уровня ГПП-1 приводит к увеличению синтеза и секреции инсулина в кровь, замедляет опорожнение желудка, вызывает чувство сытости и снижает риск развития артериальной гипертензии. ГПП-1 ингибирует секрецию глюкагона и повышает количество клеток поджелудочной железы, стимулируя их неогенез и тормозя апоптоз (Perfetti R., Hui H. 2004; Chon S. et al, 2014). Поэтому актуальным является поиск новых веществ, реализующих свое действие посредством инкретиноподобного эффекта. В настоящее время одним из основных источников для получения биологически активных веществ являются гидробионты. В связи с богатым аминокислотным и минеральным составом гидробионты успешно применяются как средства стимулирующие работу мозга, регулирующие сахар крови, оказывающие иммуномодулирующий эффект (Zhang Y. J. et al., 2013).
Степень разработанности темы исследования
Особенностью ГПП-1 является его короткий период жизни (4-5 минут) в силу быстрой инактивации посредством фермента ДПП-4 (Hansen L. et al., 1999).
Большинство существующих на настоящей момент ингибиторов
дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4) синтетического происхождения, их применение приводит к 90-100% ингибированию фермента, что является не желательным, поскольку ДПП-4 играет роль в множестве естественных биохимических процессов организма, в частности, в активации иммунной системы и противораковом иммунитете, что
увеличивает риск развития онкологических заболеваний поджелудочной и щитовидной железы на фоне их применения (Mentlein R., 1999; Vangoitsenhoven R., et al., 2012).
Кроме того полное ингибирование ДПП-4 значительно снижает образование активного метаболита ГПП-1(9-36)амид, который подавляет продукцию глюкозы печенью за счет дефосфорилирования гликогенфосфорилазы, а также значительно потенцирует действие ГПП-1 (7-36) амид.
На сегодняшний день в мире нет зарегистрированных препаратов – ингибиторов ДПП-4 природного происхождения. Однако есть сообщение о наличии у некоторых коротких пептидов ингибирующего действия в отношении ДПП-4 (Lan V. T. T. et al. 2014).
Особый интерес для выделения комплекса биологически активных веществ для лечения диабета представляет морской еж Strongylocentrotus droebachiensis., поскольку в нем содержится широкий набор пептидов, потенциально обладающих анти ДПП-4 активностью (Liyana-Pathirana C. et al., 2002).
Цель исследования Цель исследования – изучение биологических эффектов соединений природного происхождения из морского ежа обладающих инкретиноподобным действием, с последующим установлением их механизмов действия.
Задачи исследования
-
Оценить ингибирующее действие стандартизированных экстрактов зеленого морского ежа S. droebachiensis в отношении фермента ДПП-4 плазмы крови крыс in vitro с последующим изучением реализации их влияния в условиях in vivo на модели экспериментального сахарного диабета. Выбрать наиболее перспективный стандартизированный экстракт.
-
Изучить влияние наиболее перспективного экстракта зеленого морского ежа на активность фермента ДПП-4 (рекомбинантного человеческого и нативного крысиного), установить основные кинетические показатели, отражающие характер ингибирования (Vmax, Km), определить тип ингибирования и видовые особенности активности фермента. Оценить интенсивность и сроки реализации ингибирования ДПП-4 исследуемым веществом в живом организме.
-
Изучить влияние экстракта зеленого морского ежа на уровень глюкозы, артериальное давление и атерогенный индекс в условиях экспериментального метаболического синдрома.
-
Изучить противовоспалительные свойства экстракта зеленого морского ежа, как возможного механизма восстановления функции инсулинового рецептора, снятия инсулинорезистентности.
-
Оценить возможное негативное влияние экстракта зеленого морского ежа на основные биохимические показатели при длительном (360 дней) ежедневном введении интактным лабораторным животным.
Научная новизна исследования
В ходе данной работы было рассмотрено восемь стандартизированных экстрактов зеленого морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis с точки зрения наличия у них инкретиноподобного действия, реализованного посредством ингибирования ДПП-4. С использованием современных биохимических методов выбрано одно перспективное
соединение (КЛС-073). У данного соединения был проведен углубленный анализ инкретиноподобных механизмов действия.
Была проведена валидация методики определения активности ДПП-4 in vitro с использованием рекомбинантного человеческого фермента и фермента, содержащегося в плазме крови крыс. Впервые было доказано наличие у экстракта икры зеленого морского ежа S. droebachiensis ингибирующего действия в отношении активности фермента ДПП-4 и противовоспалительной активности посредством ингибирования фосфорилирования МАРК р-38.
Впервые в условиях патологии углеводного обмена (СД2, метаболический
синдром) у стандартизированного экстракта икры зеленого морского ежа S.
droebachiensis доказано выраженное антигипергликемическое действие.
Впервые у экстракта икры морского ежа выявлен антигипертензивный эффект, связанный с увеличением синтеза оксида азота в эндотелии сосудов.
Научно-практическая значимость
Валидированная методика оценки ингибирующей активности веществ в отношении дипептидилпептидазы 4-го типа с использованием рекомбинантного человеческого фермента внедрена в научно-производственную практику ООО «Технология лекарств» как метод скрининга новых кандидатов в лекарственные средства. Материалы диссертации вошли в учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр биологической и общей химии и фармакологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
Методология и методы исследования
Методология исследования включала оценку биохимических эффектов и механизмов действия соединений природного происхождения, обладающих инкретиноподобным действием «in vivo» и «in vitro».
Модели «in vivo» включали исследование влияния стандартизированных экстрактов на основные биохимические звенья патологии углеводного обмена в условиях экспериментальной модели сахарного диабета второго типа у мышей, метаболического синдрома у спонтанно гипертензивных крыс (крысы линии SHR), оценку ингибирующего действия в отношении фермента ДПП-4 при однократном внутрижелудочном введении крысам.
Биохимические механизмы действия стандартизированного экстракта устанавливали в условиях in vitro на заранее валидированных методиках с использованием в качестве хроматогенного субстрата глицил-L-пролин-п-нитроанилида.
Клеточная линия аденокарциномы легкого человека (A549) была использована для оценки возможного цитотоксического действия стандартизированного экстракта. Для анализа влияния на ЛПС-индуцированное фосфорилирование MAP-киназ использовали клеточную линию моноцитов человека U937 с последующим разделением белков клеточного лизата методом гель-электрофореза и определения фосфорилированных форм белков p38 методом Вестерн-блот.
Положения, выносимые на защиту
1. Установлено ингибирующее действие стандартизированного экстракта
икры морского ежа S. droebachiensis КЛС-073 в отношение активности ДПП-4 плазмы крови крыс. Применение КЛС-073 в условиях экспериментального сахарного диабета оказало выраженное антигипергликемическое действие.
-
Изучено влияние перспективного экстракта зеленого морского ежа КЛС-073 на основные кинетические показатели, отражающие характер ингибирования ДПП-4 (Vmax=0,0105 о.е./мин, Km=0,842 мМ). Определен тип ингибирования – конкурентный. Доказано, что в отношении рекомбинантного человеческого фермента ДПП-4 КЛС-073 проявляет более выраженное ингибирующее действие. Введение экстракта КЛС-073 в организм экспериментальных животных привело к равноэффективному ингибированию ДПП-4 в дозах 10-100 мг/кг (на 25% в течение суток после введения).
-
В условиях экспериментального метаболического синдрома у КЛС-073 установлено выраженное антиатерогеное и антигипергликемическое действие. Показана способность КЛС-073 оказывать антигипертензивный эффект за счет увеличения синтеза NO.
-
В условиях in vitro, на модели LPS-индуцированного воспаления установлена противовоспалительная активность КЛС-073 – ингибирование фосфорилирования МАРК р-38, что ведет к восстановлению функции инсулинового рецептора, снятия инсулинорезистентности.
-
В условиях длительного (360 дней) ежедневного введения КЛС-073 аутбредным мышам в дозах 2-20 мг/кг было установлено отсутствие у стандартизированного экстракта влияния на основные биохимические показатели крови, что позволяет предположить его относительную безопасность при длительном применении.
Степень достоверности и апробация материалов исследования
Степень достоверности определяется достаточным для статистической обработки данных количеством экспериментальных животных 145 крыс и 460 мышей в экспериментах in vivo, постановкой нескольких параллелей в экспериментах на клеточных линиях и in vitro.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на XVII Международном съезде «Phytopharm 2013», 61-ом Международном конгрессе «International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research 2013», IV Всероссийской конференции с международным участием «Профилактическая медицина 2014», Российской научной конференции «Фармакология экстремальных состояний 2015», XIX Международном съезде «Phytopharm 2015».
Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании от 28 мая 2015 года
Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Личное участие автора в выполнении исследования
Исследования были выполнены на базе кафедры биологической и общей химии СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Автор лично осуществлял планирование экспериментов и их непосредственное выполнение, статистическую обработку полученных результатов, обсуждение, написание статей, тезисов и докладов, диссертации и автореферата.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 148
страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами, 30 схемами и рисунками. Список литературы включает 203 источника.
Биохимичскиеэффектыимеханизмыдействия инкретиномиметиков
В 1929 году, La Barre выделил глюкозо-снижающий элемент из экстракта кишечника и назвал его инкретин (INtestine seCRETion Insulin) (Zenz E. and Barre J. 1929). В настоящее время к инкретинам прежде всего относят два соединения, глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (ГИП, GIP – gastric inhibitory polypeptide) и глюкагоноподобный пептид 1 (ГПП-1, GLP-1 – glucagone like peptide).
С точки зрения предупреждения развития сахарного диабета второго типа и опосредованных с ним заболеваний наиболее важную роль играет ГПП-1 (Cho Y.M. et al., 2014).
Небольшое количество ГПП-1 может синтезироваться в клетках поджелудочной железы, но в основном он вырабатывается L клетками кишечника. L клетки это эндокринные клетки открытого типа, апикальной частью направленные в просвет кишечника. Это позволяет клеткам взаимодействовать с питательными веществами, которые в свою очередь инициируют клеточный механизм стимуляции секреции ГПП-1 (Parker H.E. et al., 2010). Для углеводов пищи данный механизм включает в себя натрийзависимый транспортер глюкозы 1 (sodium glucose transporters 1 – SGLT1). Этот транспортер перемещает одну молекулу глюкозы, и два иона натрия. Приток натрия генерирует внутриклеточную деполяризацию, что приводит к секреции ГПП-1 в кровяное русло.
Белки пищи стимулируют секрецию ГПП-1 через аминокислотзависимую деполяризацию, хотя сигнальные механизмы и различаются в зависимости от аминокислот. Жиры – через активацию экспрессии GPRs в L клетках. GPR119 соединен с Gs, и тем самым стимулирует продукцию цАМФ, что проявляется как в L клетках, так и в -клетках поджелудочной железы (Vitam Horm. 2010). В настоящее время эндогенные лиганды к GPR119 еще не определены, хотя считается, что ими являются такие фосфолипиды и амиды жирных кислот как лизофосфотидилхолин, N-олиодопамин и др., (Ahren B. et al., 2010).
В целом синтез ГПП-1 представляет собой продукт альтернативного процессинга проглюкагона (Mojsov S. et al., 1986). До синтеза проглюкагона, процессинг обоих веществ идет параллельно (Tucker J.D. et al., 1996). Затем в зависимости от активности прогормонконвертазы 1(PC 1) или PC2 синтезируется либо глюкагон, либо ГПП-1 (рис. 5).
В норме активность PC1 наиболее выражена в кишечнике, PC2 – в поджелудочной железе. Однако при патологических состояниях, в частности длительное повышение уровня глюкозы крови, возможен синтез GLP-1 в поджелудочной железе, за счет активации PC1 (McGirr R. et al., 2005). Кроме того синтез ГПП-1 клетками поджелудочной железы отмечается и при повреждении клеток (Thyssen S. et al., 2006), благодаря чему замедляется прогрессирование СД2 (Whalley N.M. et al., 2011).
В организме человека продуцируются две формы ГПП-1 – ГПП-1(7-36)амид и ГПП-1 (7-37). На долю ГПП-1(7-36)амида приходится более 66% циркулирующего ГПП-1 (Mojsov S. et al., 1990). Оба гормона проявляют схожее действие однако, ГПП-1 (7-36)амид проявляет более выраженное биологическое действие, в частности в отношении секреции инсулина, ингибирует секрецию глюкагона, что не отмечается на фоне введения ГПП-1 (7-37) (Orskov C. et al., 1993).
Уровень ГПП-1 в крови поднимается после приема пищи (с 10-20 пМ до 30-60пМ) (Diakogiannaki E., Gribble F.M., Reimann F. 2012). Повышение уровня ГПП-1 в свою очередь приводит к увеличению содержания инсулина в крови. Также ГПП-1(7-36)амид замедляет опорожнение желудка, вызывает чувство сытости и имеет эффекты на сердечно-сосудистую и нервную систему (Drucker, D.J. et al., 2006). ГПП-1(7-36)амид также ингибирует секрецию глюкагона (Dunning B.E. et al., 2005) и повышает количество клеток поджелудочной железы, стимулируя их неогенез и тормозя апоптоз (Perfetti, R., Hui, H. 2014) .
Особенностью ГПП-1 является его короткий период полураспада (4-5 минут), в силу быстрой инактивации посредством усечения его N концевого дипептида ферментом дипептидилпептидазой 4-го типа (ДПП-4) (рис. 6).
В результате образуется менее активный метаболит ГПП-1 (9-36) амид, который не способен активировать ГПП-1Р по причине отсутствия концевого дипептида (Knudsen L.B., Pridal L., 1996), однако, он способен потенцировать действие ГПП-1 (7-36) амида (Deacon C. F. et al. 2002). Кроме того ГПП-1 (9-36) амид подавляет продукцию глюкозы печенью, предположительно за счет дефосфорилирования гликогенфосфорилазы (Tomas E., Stanojevic V., Habener J. F. 2010).
В свою очередь ГПП-1 (9-36)амид метаболизирует с образованием пентапептида ГПП-1 (32-36 амид). В настоящее время не известен его точный механизм действия, однако, установлено наличие у него антигипергликемических свойств (Elahi D. et al. 2014.). 1.2.2 Влияние GLP-1(7-36)амида и GLP-1(9-36)амида на коррекцию сахарного диабета второго типа
Известные биохимические механизмы действия ГПП-1 реализуются за счет специальных рецепторов - ГПП-1Р, которые представляют собой трансмембранные гетеротримерные G-белок опосредованные рецепторы (Mayo K. E. et al. 2003.). Впервые ДНК крысиного и человеческого ГПП-1Р были клонированы и секвестрированы в 1990г. Оба рецептора состоят из 463 аминокислот и проявляют 90% идентичность аминокислотной последовательности. Расхождения наблюдаются лишь в 42-х аминокислотных позициях (рис. 7).
Данные рецепторы экспрессируются во многих органах и тканях. Так рецепторы к ГПП-1 были обнаружены на и клетках поджелудочной железы, в легких, сердце, почках, желудке, кишечнике, гипофизе, узловых ганглиях блуждающего нерва, в ряде отделов центральной нервной системы, включая гипоталамус и ствол мозга (Baggio L. L., Drucker D. J. 2007). Активация ГПП-1Р ведет к увеличению внутриклеточного содержания Са, а также к активации аденилатциклазы и фосфолипазы С, РКС, PI3, Epac2 и МАРК сигнальных путей (Thorens B. 1992; Wheeler M. B. et al. 1993). Агонисты ГПП-1Р оказывают несколько эффектов в отношении поджелудочной железы, однако, основное действие - стимуляция глюкозозависимой секреции инсулина (Аметов А. С. 2006; Mojsov S., Weir G. C., Habener J. F. 1987.).
Точные механизмы при помощи которых ГПП-1 стимулирует секрецию инсулина только при повышенном уровне глюкозы в плазме остаются не ясными (Аметов А. С. 2008). Инкретин стимулирует образование цАМФ при участии РКА, хотя ингибиторы РКА не полностью отменяют действия ГПП-1 на секрецию инсулина. РКА-зависимая стимуляция инсулина была описана для фактора обмена гуанин нуклеотида (GEF), в частности для цАМФ-GEF II (Epac2) (Ozaki N. et al. 2000) и снижение экспрессии Epac2 существенно ослабляет эффекты ГПП-1 на секрецию инсулина (Kashima Y. et al. 2001). Также была описана роль рецепторов сульфонилмочевины (SUR) в модуляции ГПП-1-зависимого закрытия К+ АТФ-зависимых каналов (КАТР). Хотя ГПП-1 стимулирует образование цАМФ в SUR1-/- островках, инсулинотропное действие инкретина заметно уменьшалось у SUR1-/- мышей, вероятно, из-за дефекта в цАМФ-зависимом пути регулирования экзоцитоза инсулина (Nakazaki M. et al. 2002; Shiota C. et al. 2002.). Эти данные согласуются с регулирующей ролью для SUR1 в цАМФ-зависимой регуляции Са2 + индуцированного экзоцитоза. В отличие от этого, ГПП-1 сохраняет инсулинотропное действие у мышей с дефектом по основной субъединице АТФ- чувствительных К+ каналов (Kir6.2-/- мыши), что является дополнительным доказательством дивергенции инкретиновых сигнальных путей и сложности регуляции KATP в клетках (Miki T. et al. 2005.). В отличие от других веществ, действующих на секрецию инсулина главным образом за счет KATP каналов, ГПП-1 также восполняет запасы внутриклеточного инсулина с помощью стимуляции экспрессии гена проинсулина (Drucker D. J. et al. 1987; Александров А. А. 2011.). Эти эффекты опосредованы через увеличение транскрипции гена проинсулина и стабильности мРНК путем цАМФ-зависимых и РКА-независимых механизмов. Фактор транскрипции PDX-1 является важной мишенью для действия ГПП-1 на экспрессию генов инсулина (рис. 8).
Определение активности ДПП-4 in vitro с использованием рекомбинантного человеческого фермента и фермента, содержащегося в плазме крови крыс
Определение ингибирующей активности исследуемых веществ проводили как было описано выше (см. пункт 2.3.1.1). Для определения использовали плазму крови полученную от аутбредных крыс-самцов возраста 10-12 недель с массой тела 200-250 г. Кровь забирали постмортально. Эвтаназия осуществлялась с помощью СО2-камеры. Животные находились там до полной потери сознания, затем животное извлекалось, вскрывалась грудная полость, и осуществлялось полное стерильное обескровливание шприцем из полостей сердца.
Кровь забирали в пробирки, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Отобранные пробы крови центрифугировали при 1800 g в течение 20 мин для получения плазмы при температуре +4С. Замороженную плазму хранили при -20 С.
Перед началом количественного определения активности ДПП-4 образцы размораживали. Определение ингибирующей активности исследуемых веществ проводили как было описано выше (см. пункт 2.3.1.1). Был использован коммерчески доступный фермент дипептидилпептидаза-4 человеческая (Dipeptidyl Peptidase IV, human) (Sigma-Aldrich, Австралия). В качестве контроля использовали специфический ингибитор (8)-этилпиперидин-3-карбоксилат ((S)-Ethyl piperidine-3-carboxylate; S-ЭПК) (Sigma-Aldrich, Китай), а также ситаглиптин (препарат Янувия «Мерк Шарп и Доум Б.В.», Италия).
Экспериментальный сахарный диабет (СД) моделировали согласно методическим рекомендациям (Руководство..., 2012) однократной инъекцией стрептозотоцина (Sigma, США) (60 мг/кг внутрибрюшинно) с предварительным, за 15 минут, введением никотинамида (внутрибрюшинно, 210 мг/кг). Животные были распределены на 14 экспериментальных групп по 10 штук в каждой. Контрольная группа 2а в качестве плацебо получала кукурузное масло, 2б раствор метилцеллюлозы. КЛС-071, КЛС-072 и КЛС-073 растворяли в кукурузном масле, Метформин и Ситаглиптин в 0,25% водном растворе метилцеллюлозы. Объекты исследования вводили животным ежедневно в течение 14-ти дней, начиная с 10-го дня после индукции патологии. Объемы для введения не превысили предельно допустимые для данного вида животных (Макаренко И.Е. и др., 2013). Схема исследования представлена в таблице 6.
Оценка действия исследуемых веществ (ИВ) включала в себя определение уровня глюкозы крови в динамике (до, на 5 и 10 день введения) и постмортальное определение концентрации восстановленного глутатионы (ВГ), малонового диальдегида (МДА) и стабильных метаболитов азота (СМОА).
Определение глюкозы проводили при помощи глюкометра OneTouch Horizоn фирмы «Lifescan», США. Для этого по ходу хвостовой вены животного делали прокол, подносили прибор с вставленной тест – полоской, автоматически прибор отбирал 1,5 мкл крови. Метод определения глюкозы электрохимический, в основе которого биосенсорный глюкозо – оксидазный принцип. Линейный диапазон измерения 1,1 – 33,3 ммоль/л.
МДА определяли в сыворотке крови. Принцип метода основан на реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, Оптическую плотность раствора определяли на планшетном спектрофотометре при длине волны 532 нм. Предварительно методика определения была валидирована в условиях нашей лаборатории. Линейный диапазон методики - 0,67 – 3,77 мкмоль/л анализируемого раствора. Предел обнаружения 0,045 мкмоль/л. С целью попадания в линейный диапазон перед измерениями пробы разводили в 6 раз.
ВГ определяли в гемолизате эритроцитов. Для определения ВГ использовали метод, основанный на способности кислоторастворимых тиоловых группировок при взаимодействии с 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) (реактив Элмана) образовывать окрашенное соединение – тио-2-нитробензойную кислоту. Оптическую плотность раствора определяли на планшетном спектрофотометре при длине волны 412 нм. Предварительно методика определения была валидирована в условиях нашей лаборатории. Линейный диапазон методики - 0,1 – 0,8 ммоль/л анализируемого раствора. Предел обнаружения 0,02 ммоль/л. Уровень стабильных метаболитов азота (СМОА) определяли в плазме крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Принцип метода основан на реакции NO с раствором хлорида ванадия (III), 10%-ном реактивом Грисса и 5% HCl. Количество NO определяли по продукту реакции (нитрат калия) спектрофотометрически при длине волны 525 нм. Предварительно методика определения была валидирована в условиях нашей лаборатории. Линейный диапазон методики 60 – 600 мкмоль/л. Предел обнаружения 5,4 мкмоль/л.
Эксперимент проводили в 96-луночных планшетах. В качестве источника фермента ДПП-4 использовали плазму крови аутбредных крыс.
Для проведения исследования использовали следующие сток-концентрации субстрата: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 мM. В ячейки без ингибитора вносили 20 мкл плазмы крови и различные количества субстрата таким образом, чтобы в ячейках концентрация субстрата составила 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,2 и 1,8 мкмоль/мл.
В ячейки с ингибитором вносили 20 мкл плазмы крови, 20 мкл раствора ингибитора различной концентрации и сток-растворы субстрата различной концентрации таким образом, чтобы концентрация в ячейках субстрата составила 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,2 и 1,8 мкмоль/мл.
Затем во все ячейки добавляли такое количество буферной смеси, чтобы объм реакционной смеси составил 100 мкл (объм рассчитывали по формуле Vбуф.=100 – 20 – Vингиб – Vсубстр.). Далее реакционную смесь перемешивали в течение 30 с при 350 об/мин и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37С. В течении этого времени измеряли оптическую плотность реакционной смеси при 405 нм каждые 5 минут.
Оценка активности исследуемых веществ в условиях патологии углеводного обмена (модель стрептозотоцин-никотинамид индуцированного сахарного диабета)
Введение никотинамида, за счет антиоксидантной активности способствует цитопротекторному действию (главным образом панкреопротекторному), в следствии чего образование свободных радикалов не ведет к апоптозу. Тем не менее, состояние окислительного стресса в клетке ведет к нарушению внутриклеточного сингилинга инсулина, в следствии чего формируется инсулинорезистентность. Следовательно в условиях данной модели у животных развивается периферическая инсулинорезистентность с частичным сохранением функции поджелудочной железы (Ковалева М.А. и др., 2012).
Таким образом данная модель характеризует биохимические нарушения, развивающиеся не только при инсулинонедостаточности, но и при инсулинорезистентности, что наблюдается и у большинства людей после стадии манифестации сахарного диабета второго типа.
Экстракты (КЛС-071; КЛС-072 и КЛС-073) вводили в дозах 0,2, 2 и 20 мг/кг. Препараты сравнения (метформин, ситаглиптин) в дозе 100 мг/кг. Исследуемые экстракты, в связи с их липофильностью, растворяли в кукурузном масле, препараты сравнения в растворе метилцеллюлозы. Уровень глюкозы крови животных определяли до индукции патологии (0 день), за 4 часа до первого введения препаратов (10 день исследования), затем на 15 и 24 день исследования. Таким образом период введения исследуемых веществ животным составил 15 дней. Результаты определения влияния исследуемых веществ на уровень глюкозы крови экспериментальных животных представлены в таблице 3.2. Таблица 3.2 Динамика изменения уровня глюкозы в периферической крови экспериментальных животных (М±т, ммоль/л) № п/п Группа п10 20 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1010 День исследования 0(доиндукциипатологии) 10(4 часа до1-го деньвведенияпрепаратов) 15 24
Из данных таблицы 3.2 видно, что моделирование патологии, как и ожидалось, вызвало развитие гипергликемии, о чем свидетельствует статистически значимое увеличение концентрации глюкозы в периферической крови на 10-й день эксперимента (до первого введения препаратов) во всех группах, по отношению к интактной группе животных.
Применение обоих препаратов сравнения в течение двух недель привело к снижению уровня глюкозы крови, что подтверждает механизм формирования патологии на данной модели.
У КЛС-071 и КЛС-072 во всех тестируемых дозах не было отмечено эффектов в отношении нормализации уровня глюкозы крови натощак. Введение КЛС-073 в дозах 2,0 и 20 мг/кг привело к статистически значимому, по сравнению с контролем, снижению уровня глюкозы периферической крови. Важно отметить, что использование доз экстракта 2,0 и 20 мг/кг оказали равноэффективное действие. Следовательно доза 2,0 мг/кг является близкой к выходу на плато биологической активности КЛС-073.
Одним из характерных патобиохимических нарушений, ассоциированных с развитием сахарного диабета является активация перекисного окисления липидов и нарушения в антиоксидантной системе. С целью оценки влияния исследуемых экстрактов на состояние антиоксидантной системы и перекисного окисления липидов было выполнено определение восстановленного глутатиона (ВГ) в эритроцитах, малонового диальдегида (МДА) и уровня стабильных метаболитов азота (СМОА) в плазме крови животных. Определение проводили постмортально на 24-й день исследования. Результаты исследования представлены в
Как видно из данных таблицы 3.3 на фоне экспериментального стрептозотоцин-индуцированного диабета, как и ожидалось, у животных развивался окислительный стресс, о чем свидетельствует статистически значимое уменьшение концентрации ВГ, увеличение МДА и СМОА в контрольной группе. Данные изменения свойственны развитию сахарного диабета второго типа у людей (Шаманшурова З.М., 2009), а также регистрируют при использовании других экспериментальных моделей СД (Liu L. et al., 2012).
На фоне применения препаратов сравнения метформин и ситаглиптин, а также исследуемой субстанции КЛС-073 (в дозах 2,0 и 20 мг/кг) была отмечена нормализация уровня ВГ и МДА, что свидетельствует о наличии у данных веществ выраженной антиоксидантной активности.
Экстракт КЛС-071 в максимальной дозе (20,0 мг/кг) проявил слабовыраженный антиоксидантный эффект, заключающийся в небольшом увеличении уровня ВГ. Значения МДА и СМОА не отличались от контрольной группы. Введение экспериментальным животным КЛС-072 во всех тестируемых дозах не оказало действие на антиоксидантную систему крови экспериментальных животных.
На фоне введения животным экстракта КЛС-073, наряду с нормализацией процесса перекисного окисления липидов, было отмечено значительное увеличение концентрации СМОА, выше уровня контрольных животных. Аналогичная картина наблюдалась при применении специфического ингибитора ДПП-4 ситаглиптина. В условиях развития сахарного диабета одним из основных неблагоприятных факторов является вазоконстрикция, которая ведет к повышению артериального давления, спазму периферических сосудов и как следствие к развитию диабетической стопы, ретинопатии и других сосудистых осложнений. Увеличение синтеза СМОА является одним из механизмов антигипертензивного действия инкретиномиметиков. Данный эффект описан для инкретиномиметиков (Liu L. et al., 2012) и является одним из основных механизмов их антигипертензивного действия (Pereira D. M. et al., 2013; Hirata K. et al., 2009). Установление данного эффекта у КЛС-073, позволило предположить у него наличие антигипертензивного действия. Таким образом по результатам проведения первых этапов исследования был сделан вывод о наличии у КЛС-073 ингибирующего действия в отношении фермента ДПП-4. Данное действие было реализовано в экспериментальной модели сахарного диабета: введение экстракта животным оказало выраженное антигипергликемическое действие, положительное влияние развитие перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантно системы. КЛС-073 был признан перспективным экстрактом для проведения дальнейших исследований.
Результаты оценки цитотоксичности КЛС-073. Микротетразолиевый тест
Однако, несмотря на то, что в исследовании in vitro все три экстракта оказали ингибирующее действие в отношении ДПП-4, реализация данного действия в живом организме нашла подтверждение только для КЛС-073. Данный стандартизированный экстракт оказал выраженное антигипергликемическое действие, а также положительное влияние на состояния процессов перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы в условиях экспериментального сахарного диабета второго типа на мышах (Макаренко И.Е. и др., 2015 (2)).
При углубленном изучении кинетических характеристик реакции ингибирования ДПП-4 с помощью КЛС-073, внесение в систему ингибитора (КЛС-073) не повлияло на максимальную скорость реакции (0,0105 о.е./мин против 0,0105 о.е./мин без добавления ингибитора). При этом расчетное значение Кm на фоне использования КЛС-073 увеличилось с 0,486 без ингибитора, до 0,842 при внесение в систему КЛС-073. Таким образом были получены свойственные конкурентным ингибиторам кинетические характеристики – увеличение Кmпри одинаковой Vmax. Важно отметить, что в отличие от контрольного вещества КЛС-073 проявляет более выраженную ингибирующую активность в отношении рекомбинантного человеческого фермента. Что вероятно обусловлено различиям в составе ферментов, и делает применение КЛС-073 для человека потенциально более перспективным (Misumi Y. Et al.1992).
Специфическое ингибирующее действие КЛС-073 в отношении ДПП-4 также было подтверждено in vitro. Внутрижелудочное введение стандартизированного экстракта в дозах 1 и 10 мг/кг в течение первых 6 часов оказало равноэффективное действие, снижая активность ДПП-4 в среднем на 25%. Данный эффект сохранялся в течение суток, через 24 часа после введения превосходил действие ситаглиптина в дозе 10 мг/кг (15%) и был сопоставим с ситаглиптином в дозе 100 мг/кг.
Важно отметить, что аналогичное действие наблюдалось и при введении КЛС-073 в дозе 100 мг/кг. Следовательно можно предположить, что доза экстракта 10 мг/кг является дозой выхода на плате ингибирующего действия в отношении ДПП-4, что подтверждается результатами оценки антигипергликемического действия экстракта в экспериментальной модели сахарного диабета на мышах.
Согласно литературным данным, в морских ежах содержится большое количество триптофана (Liyana-Pathirana C. et al. 2002). Для триптофан-содержащих трипептидов свойственен конкурентный тип ингибирования в отношении ДПП-4 (Lan V. T. T. et al. 2014), данный тип ингибирования был доказан и для КЛС-073. На основании чего было сделано предположение о наличии у исследуемого экстракта ингибирующего действия за счет входящих в его состав триптофан-содержащих пептидов. Однако пептиды не стабильны, быстро разрушаются под действием ферментов желудочно-кишечного тракта. Кроме того КЛС-073 представляет собой липофильный экстракт, у которого было выявлено действие в отношении ингибирования ДПП-4 при внутрижелудочном введении животным, следовательно, можно предположить сложную природу активного вещества экстракта, вероятно включающего в себя триптофан-содержащие пептиды, связанные с липидным компонентом.
Реализация биологических эффектов ингибирования ДПП-4 при помощи КЛС-073 также была подтверждена в условиях экспериментального метаболического синдрома у крыс линии SHR. Применение экстракта привело к значительному снижению глюкозы крови по отношении к контрольным животным. Оказало дислипидемическое действие, что свойственно для инкретиномиметиков (Koren S. et al., 2012). Также на фоне введения животным КЛС-073 отмечалось снижение повышенного артериального давления. Данный эффект также свойственен для инкретиномиметиков, реализуется посредством увеличения синтеза NO в эндотелии сосудов, что также было установлено для КЛС-073 (Макаренко И.Е. и др., 2015 (2)).
На основании наличия у КЛС-073 большого количества простаноидов (в количестве 300-400 пг/мг экстракта), было сделано предположение о возможности КЛС-073 оказывать противовоспалительное действие. Поскольку простоноиды в живом организме являются предшественниками резолвинов, которые обладают выраженным противовоспалительным действием даже при их применении в наномолярной концентрации (Hellmann J. et al., 2011). Данное предположение было подтверждено в условиях экспериментального LPS-индуцированного фосфорилирования МАРК р-38. Таким образом в ходе данного диссертационного исследования у КЛС 073 было установлено выраженное антигипергликемическое действие. Данное действие реализуется посредством противовоспалительной активности и обратимого ингибирования ДПП-4, способствующего образованию активного метаболита ГПП-1 (9-36) амид, который потенцирует действие ГПП-1 (7-36) амид и подавляет продукцию глюкозы печенью, за счет дефосфорилирования гликогенфосфорилазы (Tomas E., et al., 2010).