Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1.Воздействие факторов внешней среды на растения 11
1.2. Активные формы кислорода и пути их образования 15
1.3.Антиокислительная система защиты растений при стрессе 17
1.4.Компоненты антиокислительной системы защиты растений 23
1.5. Механизмы устойчивости растений в условиях засоления 29
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 33
2.1.Материалы и методы исследования 33
2.2.Микроразмножение и поддержание гибридов картофеля in vitro 33
2.3.Скрининг растений картофеля in vitro в условиях солевого стресса 33
2.4.Микроклубнеобразование растений картофеля в условиях солевого стресса in vitro 34
2.5.Определение общего содержания крахмала в клубнях растений картофеля 34
2.6. Определение содержания аскорбиновой кислоты в клубнях растений картофеля 34
2.7.Определение содержания белков 35
2.8.Определение активности супероксиддисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1) 35
2.9.Определение аскорбатпероксидазы (АПО; КФ 1.11.1.11) 36
2.10.Определение активности каталазы (КАТ; КФ 1.11.1.6) 37
2.11.Определение содержания перекиси водорода 37
2.12.Определение относительного содержания воды 37
2.13.Эксперименты по температурному стрессу 38
2.14.Определение содержания малонового диальдегида 38
2.15.Статистическая обработка данных 39
Результаты исследований
Глава 3. Отбор устойчивых к стрессу генотипов картофеля и их продуктивность 40
3.1.Скрининг растений-регенерантов картофеля в условиях солевого стресса 40
3.2.Продуктивность растений-регенерантов картофеля в условиях солевого стресса 48
3.3. Оценка засухоустойчивости у разнотолерантных к соли генотипов картофеля 53
ГЛАВА 4. Активность антиокислительных систем у разнотолерантных генотипов картофеля
4.1. Активность ферментов СОД, АПО и КАТ в условиях стрессорного воздействия 60
4.2. Изучение процессов перекисного окисления липидов у разнотолерантных растений картофеля при стрессе 69
4.3.Влияние кратковременного теплового шока на активность антиокислительных систем разнотолерантных растений картофеля 73
Заключение 82
Выводы 85
Список использованной литературы
- Активные формы кислорода и пути их образования
- Механизмы устойчивости растений в условиях засоления
- Определение содержания аскорбиновой кислоты в клубнях растений картофеля
- Оценка засухоустойчивости у разнотолерантных к соли генотипов картофеля
Введение к работе
Актуальность темы. В связи с глобальным изменением климата, одним из приоритетных направлений биологической науки является поиск путей предотвращения негативного влияния факторов окружающей среды на продуктивность сельскохозяйственных культур. Основная роль в этом вопросе принадлежит исследованиям биохимических и физиологических реакций растений, способствующих формированию и функционированию защитных систем при действии стрессоров [Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006].
Исследования ряда ученых направлены на развитие инновационных приемов в целях создания новых типов растений, обладающих устойчивостью и высокой урожайностью в условиях действия негативных факторов среды.
Использование биотехнологических методов, а в частности методов
клеточной технологии позволило получить ряд форм, линий и сортов
картофеля, устойчивых к ряду стрессоров [Авгонова, 2006; Алиев, 2012;
Давлятназарова, 2016]. Изучение этих растений, как модельных объектов
представляет интерес, поскольку дат возможность выявить биохимические и
физиологические механизмы, формирующие адаптацию растений в
экстремальных условиях.
Высокая температура, засуха и засоление почв приводят к развитию окислительного стресса в растениях и увеличению образования активных форм кислорода (АФК), нарушению баланса между образованием АФК и их нейтрализацией. Временное и умеренное повышение содержания АФК приводит к защитному ответу клетки на действие стрессоров различной природы [Мерзляк, 1989; Гарифзянов, 2011].
В гашении окислительных реакций основную роль играют ферменты, в
том числе ферменты супероксиддисмутаза (СОД), катализирующая реакцию
дисмутации активного кислорода на H2O2, каталаза (КАТ) и
аскорбатпероксидаза (АПО), которые являются важными составными частями антиокислительной системы защиты растений от стрессоров.
Растения в неблагоприятных условиях окружающей среды, как правило, подвергаются действию нескольких стрессов и при этом совместное воздействие стрессоров может оказывать более сильный негативный эффект или один стрессор способен подавлять действие другого.
Устойчивость к действию одного стрессора может инициировать
устойчивость и к другим стрессам, то есть растение может проявлять кросс-
адаптацию. Основой кросс-адаптации является эффективное
функционирование антиокислительной защитной системы, поскольку
окислительный стресс – это общее негативное следствие действия любого
стрессора [Abogadallah, 2010; Радюкина, 2015].
Цель исследования: Изучение некоторых биохимических показателей разнотолерантных растений картофеля при действии засоления, засухи и теплового шока.
Задачи исследования:
отбор устойчивых к солевому стрессу генотипов картофеля и оценка их продуктивности;
изучение антиокислительных ферментов (СОД, АПО, КАТ) разнотолерантных генотипов картофеля в условиях засоления и засухи;
изучение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при действии стрессоров у разнотолерантных генотипов;
изучение действия кратковременного теплового шока (ТШ) на контрастные по устойчивости генотипы картофеля.
Научная новизна. Проведена сравнительная оценка активности антиокислительных ферментов (СОД, АПО, КАТ) у разнотолерантных к стрессорному воздействию растений картофеля. Установлено, что генотипы картофеля, устойчивые к солевому стрессу, обладают механизмом локально-функционирующих систем защиты и проявляют устойчивость к нескольким стрессорам, т.е. проявляют кросс-адаптацию. Кратковременное воздействие теплового шока усиливает устойчивость генотипов картофеля к стрессу, что связано с активацией про-оксидантных систем клетки. Выявленное разнообразие ответных реакций у разноустойчивых к соли генотипов картофеля на возрастание засухи показало, что толерантные к соли генотипы картофеля характеризуются высоким показателем относительного содержания воды (ОСВ), что можно использовать как один из возможных тест-признаков устойчивости к воздействию стрессоров.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлен клон-гибрид картофеля, обладающий толерантностью одновременно к засухе и засолению. Такие генотипы могут служить донорами генов устойчивости в селекционном процессе для создания высокопродуктивных и устойчивых к стрессорам сортов картофеля. Полученный перспективный устойчивый к стрессорам и высокопродуктивный клон-гибрид №73(№396311.1 по каталогу Международного центра картофеля СИП, Перу) рекомендован для производственного испытания в различных регионах Республики Таджикистан. Подходы и методы, использованные в работе, могут быть рекомендованы для селекции на устойчивость к стрессорам других сельскохозяйственных культур.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность экспериментальных данных, которые получены на базе современных биохимических и физиологических методов исследования с использованием сертифицированного оборудования подтверждается достаточной повторностью
и воспроизводимостью. В работе представлены данные, полученные лично автором.
Материалы диссертации были доложены (или представлены) на:
Международной научной конференции памяти академика Ю.С.Насырова
«Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений». Душанбе
(Таджикистан), 2012 г.; Республиканской научной конференции,
«Экологические проблемы и рациональное использование природных
ресурсов». Душанбе (Таджикистан), 2012 г.; Республиканской научно-
практической конференции на тему: «Современные проблемы сельского
хозяйства в связи с изменением климата». Дангара (Таджикистан), 2014 г.;
Международной научно-практической конференции «Роль отрасли
семеноводства в обеспечении продовольственной безопасности». Душанбе (Таджикистан), 2015 г.; Международной научно-практической конференции «Научно-инновационные основы развития картофелеводства, овощеводства и бахчеводства». Кайнар (Казахстан), 2016 г.; Республиканской научной конференции «Достижения современной биологии в Таджикистане». Душанбе (Таджикистан), 2017 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из которых 6 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки Российской Федерации.
Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 108 страницах компьютерного текста и состоит из введения, четырх глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа содержит 18 рисунков, 9 таблиц. Список цитируемой литературы включает 174 работы, из которых 91 на иностранных языках.
Во введении представлена актуальность выбранной темы исследования, изложены цель и задачи, научная новизна и практическая значимость, а также степень достоверности и апробация работы.
В первой главе дан обзор литературы, в котором рассмотрены
имеющиеся представления о воздействии факторов внешней среды на растения,
процессы формирования активных форм кислорода при окислительном стрессе,
проанализированы существующие данные о функционировании
антиокислительной защиты растений в условиях стресса.
Во второй главе представлены объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовались 40 гибридов картофеля (Solanum tuberosum L.), представленные Международным центром картофеля (СИП, Перу), которые размножали микрочеренкованием в стерильных условиях с использованием среды Мурасиге-Скуга (МС) [Murashige, Skoog, 1962].
Для скрининга на стресс использовали in vitro растения, которые пересаживали на питательную среду MC с добавлением селективного агента полиэтиленгликоля (ПЭГ), сорбитола и NaCl в различных концентрациях. После 5-6 недель выращивания определяли процент выживаемости, высоту растений, длину корней, количество корней на одно растение.
Активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ.1.15.1.1) определяли спектрофотометрически, с использованием нитросинего тетразолия методом, описанным в работе [Giannopulitis, Ries, 1977]. При этом нитросиний тетразолий (НТС) переходит в восстановленную форму – формазан, имеющую интенсивное сине-фиолетовое окрашивание. Оптическую плотность измеряли при длине волны 560 нм на спектрофотометре (Ultrаspec-II), используя кюветы с длиной оптического пути 1,0 см. Расчет производили по количеству препарата, способного подавить реакцию восстановления нитросинего тетразоля. За единицу активности принимали 50%-ное ингибирование образования формазана.
Определение активности аскорбатпероксидазы (АПО, КФ 1. 11.1.11) проводили по [Nakano, et al., 1981] спектрофотометрически, с использованием 0,05 М К – фосфатного буфера (рН. 7,4). Реакционная смесь состояла из 50 мкл 0,1мМ ЭДТА, 50 мкл 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 50 мкл 0,1 мМ перекиси водорода, 2,55 мл 0,05 М К- фосфатного буфера (рН. 7,4-7,6) и 300 мкл растительного экстракта. Через 30 сек. измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 290 нм. Контролем служила реакционная смесь без ферментного экстракта. Неферментативное окисление аскорбиновой кислоты в отсутствии перекиси водорода не превышает 5%. В качестве меры активности АПО использовали уменьшение оптической плотности за первые 30 сек. реакции.
Для определения активности каталазы (КАТ, КФ 1.11.1.6) 0,5г листьев растирали с 5 мл 0,05М К-фосфатного буфера (рН 7,0), гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. К 25 мкл экстракта добавляли 2,9 мл фосфатного буфера и 90 мкл 3% Н2О2 и измеряли падение оптической плотности при 240 нм за 1мин. [Kumar, Khonles, 1993].
Определение содержания Н202 проводили по методу [Capaldi, Taylor, 1983]. Образцы побегов экстрагировали холодным ацетоном, 3 мл экстракта смешивали с 1 мл 0,1% диоксида титана в 20% H2S04 и смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Интенсивность жлтого окрашивания супернатанта оценивали спектрофотометрически при длине волны 415 нм. Концентрацию Н202 определяли по калибровочной кривой, построенной в пределах 100-1000 нм Н2О2.
Определение относительного содержания воды (ОСВ) определяли по методике [Barrs, et al., 1962] и рассчитывали по формуле: ОСВ = ((mсыр – mсух)/(mтург – mсух)) *100 %. Водный дефицит (ВД) расчитывали по формуле: ВД = (((mсыр – mсух) – (mтург – mсух))/(mтург – mсух))*100 %.
Устойчивость растений картофеля к тепловому шоку определяли по методу [Мацков, 1976].
Содержание малонового диальдегида определяли по методу, описанному в работе [Heath, Pusker, 1968], с применением тиобарбитуровой кислоты. Содержание МДА рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции = 156 мМ-1 см-1, после вычитания неспецифического поглощения при 600 нм.
Полученные результаты обработаны статистически по компьютерным программам Microsoft Excel, CropStat 7.2, по Лакину Г.Ф. [1990].
В последующих главах представлены результаты исследований и их обсуждение.
Активные формы кислорода и пути их образования
Кислород довольно медленно реагирует с органическими молекулами, так как сам имеет на внешних орбитах два неспаренных электрона с параллельными спинами, а органические молекулы, как правило, имеют на внешних орбитах пары электронов с антипараллельными спинами. Активация кислорода может происходить либо при поглощении энергии, необходимой для изменения спин одного из электронов кислорода, либо в ходе реакций восстановления. В первом случае образуется химически активный синглетный кислород. Во втором случае, образуются различные АФК, являющиеся промежуточными продуктами восстановления кислорода до воды в электрон-транспортных цепях: О2 + е" - О2- + е" + 2Н+ - Н2О2 + е + Н+ - Н2О -+ ОН + е" + Н+ - 2Н2О
Наименьшей стабильностью среди АФК отличаются супероксидный анион-радикал (О-2), образующийся при передаче кислороду одного электрона [Misra, Fridovich, 1972], и гидроксильный радикал (ОН-), которые интенсивно вступают в химические реакции. Супероксидный анион-радикал генерируется, в основном, за счт «паразитных» химических реакций, происходящих в начале и середине цепи дыхательных ферментов митохондрий. При этом донорами электронов служат ионы Fe3+, Cu2+, семихиноны и некоторые другие продукты дыхания [Кулинский, 1999]. Этот радикал непосредственно не является тем агентом, который обуславливает окислительные процессы в биологических мембранах, поэтому инициирование свободнорадикальных процессов связывают с другими АФК [Мерзляк, 1989]. В отличие от кислорода, для передвижения которого мембраны не представляют преграды, супероксидный анион-радикал, обладая зарядом, окружен молекулами воды, что не дает ему возможности преодолеть гидрофобный мембранный барьер. Кроме того, время полужизни радикала составляет несколько микросекунд, поэтому он быстро становится источником других АФК, дисмутируя до пероксида водорода. Протонированной формой О-2 (при слабокислых значениях рН) является гидропероксильный радикал (НО2). Он способен пересекать биологические мембраны и свободно диффундировать между компартментами клетки и реагировать с ненасыщенными жирными кислотами, некоторыми аминокислотами, такими, как гистидин, метионин и триптофан [Dat et al., 2000]. Пероксид водорода (Н2О2) образуется при последующем получении супероксидным анион-радикалом (или его протонированной формы -гидропероксильным радикалом) ещ одного электрона и представляет собой более стабильное соединение [Мерзляк, 1989]. Это соединение не является свободным радикалом, но участвует в качестве окислителя средней силы во многих реакциях. В отличие от супероксида Н2О2способен диффундировать через мембраны. Пероксид водорода может инактивировать некоторые ферменты, окисляя ихтиоловые группы. Так, Cu/Zn-супероксиддисмутаза и Fe-супероксиддисмутаза инактивируются в Н2О2 [Charles, Halliwell, 1980]. В присутствии металлов переменной валентности (в виде солей или в составе белков), пероксид водорода вступает в реакцию Фентона, приводящую к образованию наиболее опасного свободного радикала - гидроксильного радикала (ОН-). Fe2+ + Н2О2 = Fe3+ + ОН" + ОН Это очень сильный окислитель, не способный к внутриклеточной миграции и быстро вступающий в реакцию с биомолекулами.
В некоторых случаях супероксидный анион-радикал образуется в реакциях с озоном, который появляется как результат фотодиссоциации молекулярного кислорода под влиянием солнечной энергии: О3 + О2 - 2О2 + О2
АФК образуется в различных компартментах клетки. Образование синглетного кислорода связано с хлоропластами. Поглощая квант света, пигмент - фотосенсибилизатор (хлорофилл) переходит в синглетное или триплетное возбужднное состояние. Молекулы пигмента, сталкиваясь с молекулой кислорода, передают ему энергию, что меняет спин электронов в его молекуле и приводит к образованию химически активного синглетного кислорода. Стимулятором образования синглетного кислорода может быть присутствие большого количества НАДФН. Такая ситуация создатся в случае замедленного окисления НАДФН в цикле Кальвина по сравнению с его образованием. Основным источником образования АФК в хлоропластах является комплекс цитохромов b/f [Мерзляк, 1999; Чиркова, 2002; Asada, 1999; Foyer, Noctor, 2003]. В митохондриях кислород является акцептором электронов, поступающих из электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). На него передаются 4 электрона при помощи комплекса пиридиновых, флавиновых ферментов и цитохромоксидазной системы или альтернативной оксидазы.
Считается, что в ходе жизнедеятельности организма образуются свободные радикалы - промежуточные продукты обмена, которые благодаря наличию неспаренного электрона обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью и могут вносить «хаос и беспорядок» в тонко налаженную «биохимическую машину». Так, например, перекисное окисление липидов (ПОЛ) может привести к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя, что может, в свою очередь, вызвать повреждение мембраносвязанных белков [Richter et al, 1987], ПОЛ может приводить к инактивации мембранных рецепторов и некоторых ферментов, принимающих непосредственное участие в поддержании ионного гомеостаза клетки [Болдырев, 2001].
В норме в системе оксиданты-антиоксиданты сохраняют равновесие. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию, так называемого оксидативного стресса. Он выражается в избыточной продукции АФК и недостаточности антиокислительной защиты. Неконтролируемая генерация АФК и их производные вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот, ферментов, биомембран, что приводит к развитию патологических состояний [Шукурова, 2011; Suzuki et al., 1996; Rahman et al, 1996]. Свободные радикалы и АФК в основном образуются при последовательном присоединении электронов к кислороду и в процессе свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Обычный и основной путь метаболизма молекулярного кислорода - это его полное восстановление до молекулы воды (Н2О) путем принятия четырех электронов[Шукурова, 2011]. Однако при восстановлении одним электроном могут образовываться свободные радикалы и перекись водорода (Н2О2), как показано ниже:
Механизмы устойчивости растений в условиях засоления
Известно, чтовысокая температура воздуха, засуха и засоление почв являются одними из главных стрессорных факторов, в основе которых лежит осмотический стресс, как следствие нарушения водно-солевого гомеостаза растений [Кузнецов Вл. 2006; Алиев и др. 2007; Азимов, 2013].
Результаты работ К. Алиева с соавторами подтвердили мнение, что нарушение тургора клетки у картофеля является главной причиной снижения интенсивности фотосинтеза и дыхания растений, связанного с гормональным дисбалансом. Проведение гормональной коррекции на уровне целого растения восстанавливает нормальный водообмен и ведет к усилению адаптационных возможностей растений в условиях водного стресса [Алиев, 2012; Азимов, 2013; Давлятназарова, 2016].
Выявление особенностей реакции различных генотипов картофеля на действие факторов среды, несомненно, вызывает интерес, как с точки зрения разработки эффективных тест-методов для скрининга стресстолерантных генотипов in vitro, так и с точки зрения выявления потенциальных форм (генотипов) с признаками стрессоустойчивости и продуктивности.
В связи с этим, первоначально, в задачу наших исследований входил скрининггенотипов картофеля на устойчивость к солевому стрессу, полученных из Международного центра картофеля (CIP, Перу).
Для имитации стрессового эффекта in vitro была использована культуральная среда МС, дополненная осмотически активным веществом 41 хлористым натрием (NaCl). Поскольку каждый вид растений имеет свою чувствительность к хлористому натрию, используемая в литературе селективная концентрация NaCl существенно различается, в связи чем, необходимо было тестировать растения-регенеранты in vitro на разные концентрации NaCl именно для исследуемых нами генотипов картофеля. Было исследовано по 180 растений-регенерантов картофеля (всего 40 генотипов) в присутствии NaСl в концентрациях от 0,5 до 1,5%.Отбор проводился по таким параметрам как процент выживаемости, высота растений, длина и количество корней на одно растение.
Результаты исследований показали, что, при концентрации 0,5% NaCl в культуральной среде, выживаемость гибридов составила 100%. Окраска листьев варьировала от светло-зеленного до темно-зеленого цветов, почти все растения образовали вторичные побеги и корни. Высота растений составляла от 1,6 до 3,14 см. При концентрации 1,0% NaCl, выживаемость гибридовбыла в пределах от 40 до 100%, наблюдалась задержка роста и корнеобразования. Высокую степень выживаемости при концентрации 1,0% NaCl имели гибриды №73, 75, 76, у которых наблюдалось образование вторичных побегов и корней. В варианте с концентрацией 1,5% NaClтакже наблюдалось появление вторичных побегов только у гибридов №73, 75 и 76 на 40-е сутки (рис.1).
Появление вторичных побегов у клон-гибридов №73, №75 и №76 на 40-е сутки, при концентрации 1,5% NaCl в среде культивирования in vitrо. Таким образом, при увеличении концентрации NaCl в среде культивирования пропорционально усиливалось его ингибирующее действие на выживаемость пробирочных растений картофеля in vitro.
Корнеобразование и столонообразование у растений картофеля является главным фактором выживаемости, так как от этого зависит клубнеобразование и урожайность этой культуры. Поэтому, существенное значение имеет образование корней при культивировании растений-регенерантов на средах, содержащих NaCl.
Как видно из данных (рис. 2; 3) на средах, содержащих 0,5% NaCl, у некоторых исследованных гибридов наблюдалось ингибирование корневой системы. Наименьшее корнеобразование (менее 40%) отмечено у клон-гибридов№46,55, и 58. У гибридов №47 и 77 при 0,5% NaCl в среде культивирования наблюдалось абсолютное отсутствие корнеобразования.
Определение содержания аскорбиновой кислоты в клубнях растений картофеля
После 24ч воздействия солевого стресса активность каталазы у устойчивых генотипов повышалась и процент ингибирования достигал уровня 18,1 и 19,0%, а у неустойчивого генотипа активность снижалась и процентингибированиясоставлял 49,1 и 61,3% от уровня 4-х часовой экспозиции.
Несколько другая картина наблюдалась при длительном воздействии на растения засухи (ПЭГ). Так, через 4ч воздействия засухи наблюдалось ингибирование активности каталазы у всех исследованных генотипов (на 45,8-54,9%). Но после 24 часового воздействия активность каталазы изменялась неодинаково у разных по устойчивости генотипов картофеля. У устойчивых генотипов (сорт Файзабад и клон-гибрид №73) активность каталазы была несколько выше при 24ч экспозиции засухи, чем у неустойчивого генотипа (клон-гибрид №69) и процент ингибирования составлял 37,6-26,5% соответственно. При дальнейшем увеличении экспозиции активность каталазы у неустойчивого генотипа (клон-гибрид №69) практически не изменялась и была также ниже, чем при 4 ч воздействии. Вместе с тем, следует отметить, что активность каталазы у неустойчивого генотипа (клон-гибрид №69) при всех экспозициях также стабилизировалась, но была существенно выше, чем у устойчивых к засолению генотипов. При возрастающем воздействии засухи падение активности каталазы у клон-гибрида №69 составляла 54-64%.
Определение активности (СОД, АПО, каталазы) при длительной экспозиции различных по устойчивости растений (генотипов) картофеля показало, что подавление активности ферментов происходило в большей степени у неустойчивого генотипа (клон-гибрида №69), чем у устойчивых генотипов: (сорта Файзабад и клон-гибрида №73).
Обнаружено колебательное изменение активности СОД у всех исследуемых генотипов картофеля при длительном выращивании растений в условиях солевого стресса и засухи, что указывает на согласованное изменение активности фермента у устойчивых генотипов в условиях стрессорного воздействия. У устойчивых к солевому стрессу генотипов как при засолении, так и при имитации засухи не было выявлено существенного изменения активности СОД во все периоды стрессорного воздействия. Неустойчивый генотип (клон-гибрид №69) при стрессорном воздействии (засуха, NaCl) имел низкуюактивность. Полученные данные указывают на то, что стрессорные воздействия у неустойчивых генотипов приводят к сверхпродукции активных форм кислорода (АФК) и перекиси водорода, и очевидно, повышение устойчивости связано с увеличением активности СОД и сохранением достаточного пула СОД в хлоропластах [Кимова, и др., 2013; Давлятназарова, 2016].
Обнаруженные нами различия в содержании СОД при стрессорном воздействии у различных по устойчивости растений картофеля, возможно, указывают на существование разных изоформ СОД у этих генотипов или разные стрессы по-разному индуцируют гены контролирующие экспрессию этого фермента [Давлятназарова, и др., 2012].
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что в зависимости от продолжительности (динамики) стрессорного воздействия происходит, как резкое изменение активности СОД, так и е небольшое возрастание, в зависимости от уровня устойчивости генотипов к стрессору.
Активность других антиокислительных ферментов АПО и каталазы, разрушающих перекись водорода, также имели колебательный характер в динамике воздействия стрессоров. Анализ данных показывает, что активность АПО между исследованными генотипами существенно различаются в динамике стрессорного воздействия (засуха, NaCl). Так, после кратковременного воздействия стрессоров, активность АПО быстро и сильно ингибировалась у чувствительного генотипа и далее, при последующем воздействии солевого стресса и засухи, стабилизировалась. Вместе с тем, ингибирование активности АПО у устойчивых генотипов наблюдалось только в первые часы воздействия засухи, а в последующие часы воздействия стрессора она не ингибировалась. Эти результаты, видимо, указывают на особую роль АПО в защите растений от повреждения при длительном воздействии стрессоров. Это может говорить о существенном вкладе АПО в восстановительном процессе и защите растений после длительного воздействия стрессоров, которое, очевидно, характерно только для устойчивых к стрессу растений картофеля.
В защите растений от стрессорного воздействия ключевую роль играет и другой антиокислительный фермент - каталаза. Каталаза играет существенную роль в хлоропластах высших растений, где интенсивно образуется перекись водорода. Поэтому в хлоропластах высших растений функционирует мощная система антиокислительных систем, разрушающая интенсивно образующиеся в ходе фотосинтеза оксиданты.
В нашей работе после 4ч воздействия стресса отмечено ингибирование активности каталазы, но в разной степени у разных по устойчивости генотипов картофеля. Так, в листьях чувствительного генотипа картофеля отмечено значительное увеличение активности фермента во всех периодах воздействия стресса.
В то же время в листьях устойчивых генотипов (сорт Файзабад, клон-гибрид №73) активность каталазы незначительно изменялась и даже превосходила контрольный вариант. Отсюда можно заключить, что активность каталазы в основном изменялась в соответствии с уровнем устойчивости генотипов.
Необходимо отметить, что активность каталазы у устойчивых генотипов слабо варьировала по сравнению с другими ферментами (СОД и АПО) и была стабильно ниже у чувствительного генотипа картофеля, что указывает на роль этих ферментов в реакциях антиокислительных систем клетки растений.
Оценка засухоустойчивости у разнотолерантных к соли генотипов картофеля
Характер повреждения листьев при засухе, после действия теплового шока у изученных генотипов,был не одинаков. Но, по мере усиления засухи, степень повреждения листьев после теплового шока у солеустойчивого генотипа была значительно меньше, чем у солечувствительного.В процентном соотношении повреждение листьев при засухе и одновременном перегреве у контрольного варианта устойчивого генотипа (сорт Файзабад) составило 56%, 48% и 49% соответственно при 84%, 64%, 52% ПВП, а в опытном варианте после воздействия ТШ было ниже и составило 45%, 47%, 45% соответственно наивысший устойчивость показал клон-гибрид №73. Степень повреждения листьев солечувствительного генотипа к перегреву была значительно выше, чем у солеустойчивых генотипов. Так, степень повреждения листьев солечувствительного клон-гибрида №69 в контрольном варианте при 84% ПВП составило 72%, при 64% ПВП - 74% и при 52% ПВП - 67%. Однако в опытном варианте (ТШ) степень повреждения листьев была ниже, чем в контрольном. Таблица 9 - Влияние ТШ и последующего водного дефицита на степень повреждения листьев (% от общей поврежденности)
Следует отметить, что в условиях водного стресса в контрольном варианте у генотипов наблюдалось усиление повреждения листьев, особенно у неустойчивого к соли генотипа картофеля (клон-гибрид №69). Но после воздействия ТШ у всех генотипов наблюдалось уменьшение повреждения листьев: у устойчивого генотипа на 2-12%, а у солечувствительного на 25-30% от контроля. Степень устойчивости листьев к перегреву у изученных генотипов зависит от усиления почвенной засухи (ПВП).
На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что устойчивые к стрессорному воздействию (NaCl, засухи) генотипы обладают более выраженной способностью противостоять прогрессирующей почвенной засухе, чем генотипы с ослабленным признаком солеустойчивости.
Таким образом, кратковременное воздействия ТШ увеличивало устойчивость листьев к перегреву, что согласуется с данными, полученными у растений хлопчатника, но степень повреждения листьев при перегреве с последующей адаптацией к засухе зависит от устойчивости генотипов к другому стрессу [Sabehat et al., 1998]. Наибольшая устойчивость наблюдалась у клон-гибрида №73. Можно предполагать, что у этого генотипа наблюдается высокая адаптационная способность к стрессам, а кратковременное воздействие ТШ способствовало усилению устойчивости.
Очевидно, разная степень устойчивости генотипов к возрастающей засухе в условиях предварительной адаптации растений к ТШ связана с активацией про-оксидантных систем клетки. Как показывают данные, представленные на рисунке 16 и 17, у этих генотипов образование малонового диальдегида (МДА) перекиси водорода (Н2О2) различается. Так, образование МДА у устойчивого генотипа в условиях прогрессирующей почвенной засухи изменяется незначительно после ТШ. Наибольше накапливание происходит при 64% ПВП, а при 52% ПВП изменяется незначительно. Такие же результаты получены и для солечувствительного генотипа (клон-гибрид №69). Различия в уровне накопления МДА отмечались между устойчивыми и чувствительными генотипами. Особенно были заметны изменения при 52% ПВП (клон-гибрид №69).
Следует отметить, что накопление МДА у солечувствительного клон-гибрида №69 было заметно выше во всех вариантах, чем у устойчивых генотипов. У сорта Файзабад и клон-гибрида №73 при 84%, 64%, и 52% ПВП накопление МДА практически было на одном уровне, в переделах 18-21 мкмоль. А у солечувствительного генотипа (клон-гибрида №69) накопление МДА было заметно выше и составило от 21 до 32 мкмоль. 25 15 5 84% ПВП
Очевидно, устойчивость к стрессу на уровне целого растения осуществляется путм значительного накопления НАДФ+, регулирующего образования АФК и перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образования Н2О2 и другие альтернативные пути «гашения» окислительного стресса [Давлятназарова, 2016]. Проведенные исследования показали, что по уровню накопления перекиси водорода (H2O2) в условиях прогрессирующей засухи наблюдаются различия у чувствительного генотипа (клон-гибрида №69) по сравнению с устойчивым генотипом. Так, при 64% ПВП наблюдается резкое повышение уровня H2O2 у всех изученных генотипов, но у устойчивых генотипов, уровень немного выше.
При продолжении засухи (52% ПВП) уровень содержания H2O2 у солеустойчивого сорта Файзабади клон-гибрида №73 несколько уменьшается, а у чувствительного падает. То есть, наблюдаетсяразнонаправленный характер