Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
Глава 1.1 Структура и функция рибосомы 8
Глава 1.2 Взаимодействие белковых факторов с рибосомой 19
Глава 1.3 Staphylococcus aureus 22
Глава 1.4 SaHPF – фактор инактивации рибосомы 24
Глава 1.5 Функциональные и структурные гомологи белка SaHPF 26
Глава 1.6 Предсказание структуры белков методами структурной
биоинформатики 29
Глава 1.7 Определение структуры белка методом ЯМР 34
Глава 1.8 Крио-электронная микроскопия макромолекулярных комплексов Заключение 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 41
Глава 2.1 Оборудование и реагенты 41
Глава 2.2 Использованные микроорганизмы и плазмиды 43
2.2.1 Клонирование С-концевого домена SaHPF 43
Глава 2.3 Использованные в работе буферы 45
Глава 2.4 Использованные в работе методы 47
2.4.1 Разрушение клеток 47
2.4.2 Осаждение клеточных фракций 47
2.4.3 Хроматографическая очистка белка 48
2.4.4 Определение степени чистоты и однородности раствора белка 49
2.4.5 Хранение и концентрирование образца 50
Глава 2.5 Выделение и очистка белка для эксперимента по ЯМР 50
Глава 2.6 Выделение, очистка и кристаллизация белка 52
Глава 2.7 Выделение и очистка белка для димеризации рибосомы 53 Глава 2.8 Димеризация рибосомы 53
2.8.1 Получение димеров рибосомы 53
2.8.2 Проверка стабильности димеров рибосомы 56
2.8.3 Подготовка фракций димеров рибосомы для криоэлектронной микроскопии 57
Глава 2.9 Предсказание структуры белка 58
Глава 2.10 Молекулярно-динамическое моделирование белка 58
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 59
Глава 3.1 Получение плазмиды со вставкой гена С-концевого домена SaHPF 59
Глава 3.2 Выделение и очистка белка SaHPF для кристаллизации и димеризации рибосом 60
Глава 3.3 Выделение и очистка белка SaHPF и С-концевого домена SaHPF для определения структуры методом ЯМР 63
Глава 3.4 Димеры рибосомы S.aureus 65
Глава 3.5 Результаты предсказания структуры белка SaHPF и анализ ее молекулярной динамики 72
Глава 3.6 Структура C-концевого домена белка SaHPF, полученная методом ЯМР 77
Глава 3.7 Криоэлектронная микроскопия димеров рибосомы 79
выводы 84
заключение 85
список использованной литературы 86
- Staphylococcus aureus
- Клонирование С-концевого домена SaHPF
- Выделение и очистка белка для димеризации рибосомы 53 Глава 2.8 Димеризация рибосомы
- Выделение и очистка белка SaHPF и С-концевого домена SaHPF для определения структуры методом ЯМР
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Во всем мире ежегодно умирает большое количество людей от болезней, вызываемых патогенным организмом Staphylococcus aureus. Способность организма противостоять антимикробным соединениям и неблагоприятным условиям среды делают его одним из опаснейший организмов в окружении человека. В данной работе исследован белок SaHPF (Staphylococcus aureus hibernation-promoting factor), который включается в жизнедеятельность бактерии при неблагоприятных условиях среды. Ранее проведенные исследования показали, что белок обнаруживается во фракциях димерных рибосом, которые становятся в таком комплексе функционально не активными и прекращают энергозатратные процессы синтеза белков (Ueta et al., 2010; Ueta et al., 2013). Структурные данные о белке и взаимодействиях между белком и рибосомой позволят понять, каким образом происходит связывание между ними и в дальнейшем разработать подходы для блокирования подобных контактов, что в свою очередь должно привести к истощению бактерии в неблагоприятных условиях и в конечном итоге к гибели патогена.
В настоящее время, исследования посвященные рибосоме рассматриваются множество различных аспектов, в том числе акцентируются на уточнении структурных данных самой структуры рибосомы из разных организмов (Melnikov et al., 2012; Khatter et al., 2015, Khusainov et al., 2016), в поисках специфического строения (Ben-Shem et al., 2011); особенностей образования комплекса рибосомы с белковыми факторами и тРНК кода (Rozov et al., 2016); процесса синтеза полипептидной цепи, роли специфических белков в данном процессе (Melnikov et al., 2016) и влиянию мутаций (Mailliot et al., 2016). Также исследования связаны с изучением механизмов взаимодействия рибосомы с различными группами антибиотиков (Garreau de Loubresse et al., 2014), с условиями регуляции активности рибосомы при стрессе (Starosta et al, 2014) и др.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение структуры и биохимических свойств белка SaHPF S.aureus.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Выделение, очистка и кристаллизация белка SaHPF.
2. Предсказание и анализ структуры белка SaHPF методами структурной
биоинформатики.
3. Подбор условий для определения структуры белка методом ЯМР.
4. Получение димеров рибосомы S.aureus с помощью SaHPF для
определения структуры комплекса рибосома-SaHPF методом криоэлектронной
микроскопии.
Научная новизна. Предсказана и определена структура белка SaHPF методами структурной биоинформатики, ЯМР и криоэлектронной микроскопии. Проведен анализ структуры SaHPF, который выявил участки повышенной подвижности в молекуле белка, отвечающие за димеризацию рибосомы. Полученные фракции димеров рибосомы S.aureus с SaHPF позволили определить структуру димерной рибосомы и установить особенности взаимодействия между
4 белком и рибосомой. Было показано, что белок SaHPF в растворе находится в димерной форме, связь между молекулами белка образуется за счет взаимодействия С-концевых доменов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для разработки соединений регулирующих работу белок-синтезирующего аппарата S.aureus. Результаты дают представление о структурных особенностях взаимодействия белка с рибосомой в виде димерной частицы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Структура белка SaHPF представлена двумя доменами и петлей,
соединяющей их.
2. Белок в растворе представлен в димерной форме, связь между молекулами
образуется за счет С-концевых доменов.
3. Взаимодействие белка с рибосомой происходит в полости 30S
субъединицы, при этом белок частично блокирует участки A, P и E, предотвращая
связывание ряда антибиотиков с данными участками.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных высокоточных приборах; опубликованием полученных данных в отечественных и зарубежных журналах, с рецензированием ведущими учеными в данной области.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международных и всероссийских конференциях: на ежегодных конференциях Казанского федерального университета – Итоговой научно-практической конференции Казанского Федерального Университета (Казань, Россия, 2016), и I Международной школе-конференции «Биомедицина, материалы и технологии XXI века» (Казань, Россия, 2015), на Международной школе-семинаре «Computer-Aided Molecular Design» (Казань, Россия, 2016), на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2016» (Москва, Россия, 2016), на V съезде биохимиков России (Дагомыс, Сочи, Россия, 2016), BIOMEMBRANES 2016: Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases International Conference (Долгопрудный, Россия, 2016), Международной конференции «Трансляционная медицина» (Казань, Россия, 2016).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно–исследовательских центров. Исследования выполнены при поддержке грантов: Определение пространственной структуры белка инактивации рибосомы (HPF) бактерии Staphylococcus aureus методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения (грант РФФИ - 2016-2018 гг.), структурные основы белоксинтезирующего аппарата бактерии Staphylococcus
5 aureus (Грант РНФ - 2016-2018 гг.). Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы исследования, планировании, организации и реализации ее экспериментального решения, интерпретации полученных результатов.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 научные работы в журналах, рекомендуемых ВАК и входящими в базу данных Scopus, WOS.
Общая структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводы, заключения и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок, 2 таблицы. Библиография включает 142 наименований.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н., ведущему научному сотруднику НИЛ «Структурная биология» кафедры биохимии и биотехнологии Юсупову Марату Миратовичу за постановку проблемы, внимательное отношение к работе, обсуждение результатов и чуткое руководство; к.б.н. доценту кафедры биохимии и биотехнология Акберовой Наталье Ивановне за внимание к работе и помощь в проведение биоинформатических экспериментов, сотруднику лаборатории «Структура рибосомы» IGBMC Университета Страсбурга (Франция) PhD Хусаинову Искандеру за помощь в постановке экспериментов и ценные рекомендации. Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам НИЛ «Структурная биология» и кафедры биохимия и биотехнология за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
1. Объекты исследования
В работе были использованы клетки E.coli штаммов BL21DE3
(экспрессионный штамм) и DH5 (компетентный штамм). Была использована
плазмида pGS21a с векторами вставки полноразмерного sahpf (570 пар
нуклеотидов) и С-концевого домена sahpf (180 пар нуклеотидов). Клетки E.coli
штамма BL21DE3 с плазмидой pGS21a с вектором вставки полного sahpf были
получены от доктора Поликанова. С-концевой фрагмент белка, содержащий 60
аминокислот был получен путем ПЦР с праймерами pr-АА60: 5’-
ATAGAAATTATTCGTTCAAAAGAATTC-3’ и pr-ATG 5’-
CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’, где в качестве матрицы использовалась ДНК SaHPF::pGS21a. Для амплификации использовали набор Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, США). ПЦР смесь состояла из Іхбуфера Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase, 2мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из нуклеотидов, 100 нг ДНК Sahpf: :pGS21a 2мМ каждого из праймеров, 1 ед. фермента (Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase). Температурный режим составлял один цикл первичной денатурации 95 С длительностью 3 минуты, далее следовали 30 циклов денатурации 95С в течение 30 секунд, отжига при 60С в течение 30 секунд и полимеризации в течение 4 минут при 72С. Для достройки фрагментов после 30 циклов был введен дополнительный цикл 5 минут при 72С.
6 Фрагменты, полученные в ходе ПЦР очищали с помощью набора GeneJet PCR Purification Kit (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Очищенные фрагменты ДНК фосфорилировали, для этого 200 нг ДНК фрагментов помещали в 1х буфер для полинуклеотид киназы бактериофага Т4 (СибЭнзим, Новосибирск, Россия) и добавляли 2 мМ АТФ (NEB, США), смесь доводили до 20 мкл деионизованной водой и инкубировали при 37С. Фермент инактивировали прогреванием смеси до 70С в течение 10 минут. Лигазная смесь объемом 20 мкл состояла из 1хбуфера для лигазы Т4 бактериофага (ThermoFisher Scientific, США), 50 нг фосфорелированных фрагментов в предыдущем буфере, 1ед. лигазы Т4 бактериофага (ThermoFisher Scientific, США). Смесь инкубировали при 22С в течении 30 минут, после чего реакцию останавливали нагреванием смеси до 70С в течении 10 минут. После инактивации лигазы 10 мкл лигазной смеси использовали для трансформации клеток Е.coli DH5. Культуры, полученные из клонов, с удаленным N-доменом, использовали для выделения ДНК с помощью набора GenJet Plasmid MiniPrep (ThermoFisher Scientific, США). Для определения размеров вставки препараты плазмид обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI. Результаты рестрикционного анализа проверяли методом электрофореза в 1% агарозном геле по сравнению с исходной конструкцией Sahpf::pGS21a.
Методы, использованные в работе
2. Разрушение клеток
Замороженную фракцию клеток размораживали на льду. К одному грамму клеток добавили 2 мл буфера А (или (Р) А), PMSF и PIC. Все тщательно ресуспендировали на льду. Разрушение клеток проводили двумя способами:
1. Раствор клеток переносили в стеклянную посуду. Стеклянную посуду
помещали в лед. Разрушали клетки с помощью ультразвука на оборудовании
Bandelin Sonopuls (Германия). Для разрушения использовали следующие
параметры: сила 40%, цикл 2, время 3 мин. Охлаждали клетки в течение 5 минут.
Повторяли 3 раза.
2. Разрушали клетки под давлением на оборудовании Constant Cell Disruption
System (Великобритания). Перед этим оборудование охлаждали до 4С с помощью
проточного водного насоса. Для разрушения использовали следующие параметры:
давление 1,2 кбар. Повторяли 3 раза.
3. Осаждение клеточных фракций
Осаждение фракций разрушенных клеток проводили методом
центрифугирования. Первое центрифугирование проходило в течение 30 мин при 25000 об/мин и 4С в роторе УА 25.50 на центрифуге BECKMAN Avanti J-25 (Калифорния, США). Надосадочную жидкость аккуратно отбирали и переносили в ультрацентрифужные пробирки (обязательно должны быть заполнены на 90%!) и помещали в ротор Ti 50.2 (Ti 45) и центрифугировали в течение 45 мин при 45000 (43000) об/мин и 4С на ультрацентрифуге BECKMAN Optima XPN (Калифорния, США). В ходе второго центрифугирования аккуратно отбирали надосадочную жидкость и хранили пробирку на льду.
4. Хроматографическая очистка белка
Хроматографическая очистка белка включала в себя две стадии: аффинная хроматография и эксклюзионная хроматография.
7 Аффинная хроматография проводилась двумя способами.
1. Для очистки белка использовали смолу Ni-NTA Superflow (для ЯМР
эксперимента).
2. Для очистки белка использовали колонку HisTrap HP (GE Healthcare), 5 мл,
на хроматографической установке AKTA purifier (для димеризации рибосомы).
Эксклюзионная хроматография проводилась с использованием колонки Superdex 75 10/300 на хроматографической установке AKTA purifier:
промыли насос и колонку буфером, в котором должен быть белок для проведения эксперимента (в случае ЯМР пробовали несколько буферов; в случае димеризации рибосомы буфер (Р) Д)
наиболее чистый и концентрированный образец белка после аффинной хроматографии в объеме 0,5-0,75 мл вносился на колонку с помощью шприца
- белок элюировали со скоростью 0,4 мл/мин
5. Выделение и очистка белка для эксперимента по ЯМР
Для экспериментов по ЯМР клетки растили в среде М9 (минимальная синтетическая среда) с добавлением изотопов. Клетки из стока высевали растиранием на чашку с агаризованной средой LB с антибиотиком ампициллин (100 мкг/мл). Клетки растили в течение ночи при 37C. Колонию клеток из чашки переносили в 100 мл среды М9 с антибиотиком ампициллин (100 мкг/мл) для роста прекультуры в инкубаторе при качании (200 об/мин) и 37С до достижения оптической плотности среды А595 = 1-2 o.e. Далее прекультуру клеток переносили в 1 литр среды М9 с антибиотиком ампициллин (100 мкг/мл) до итоговой оптической плотности среды А595 = 0,1 o.e. Культура клеток росла в инкубаторе при качании (200 об/мин) и 37C до достижения оптической плотности среды А595 = 0,6 o.e, после в нее добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ. После добавления ИПТГ клетки продолжали растить в тех же условиях в течение 20 часов, по истечении которых осаждали центрифугированием (8000 g, 15 минут, 4C). Осажденные клетки разрушали, осаждали клеточный дебрис и проводили хроматографическую очистку белка. После эксклюзионной хроматографии белок концентрировали с использованием концентратов с размером пор 3 кДа. В готовый образец белка добавляли азид натрия до итоговой концентрации 0,1%.
6. Выделение и очистка белка для димеризации рибосомы
Клетки (с плазмидой, несущий ген SaHPF) из стока высевали растиранием на чашку с агаризованной средой LB с антибиотиком ампициллин (100 мкг/мл). Клетки растили в течение ночи при 37С. Колонию клеток из чашки переносили в 100 мл среды LB с ампициллин (100 мкг/мл) для роста ночной прекультуры в инкубаторе при качании (200 об/мин) и 37С. Далее прекультуру клеток переносили в 1 литр среды LB с ампициллин (100 мкг/мл) до итоговой оптической плотности среды А595 = 0,05 – 0,1 o.e. Культура клеток росла в инкубаторе при качании (200 об/мин) и 37С до достижения оптической плотности среды А595 = 0,3, после в нее добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ. После добавления ИПТГ клетки продолжали растить в тех же условиях в течение 4 часов, по истечении которых осаждали центрифугированием (8000 g, 15 минут, 4С).
8 Осажденные клетки разрушали, осаждали клеточный дебрис и проводили хроматографическую очистку белка.
7. Определение степени чистоты и однородности раствора белка
После аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии анализ чистоты образца осуществлялся с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. После эксклюзионной хроматографии однородность белка в растворе проверялась с помощью динамического светорассеивания на оборудовании Dynamic Light Scattering.
Электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в пластинах геля размером 78 см толщиной 0,75 мм в аппарате «Mini Protean» фирмы BioRad. Разделяющий гель содержал: 13,5% акриламид, 375 мМ трис-HCl, pH 8,8; 0,1% ДСН. Концентрирующий гель содержал: 4,5% акриламид, 125 мМ трис-HCl, рН 6,8; 0,1% ДСН. Для полимеризации на 1 мл раствора добавляли 1 мкл ТЕМЕД и 10 мкл 10% персульфата аммония. Электродный буфер для электрофореза в денатурирующих условиях, содержал 250 мМ трис, 1,92 М глицин, 1% ДСН, pH 8,3. Буфер для нанесения белковых образцов содержал 120 мМ трис-HCl рН 6,8, 40% глицерол, 0,09% БФС, 10мМ ДТТ, 4% ДСН. К анализируемому образцу добавляли данный буфер (1/5 часть от объема образца) и прогревали при температуре 99С в течение 5 минут. Режим электрофореза: напряжение 120 В до вхождения образцов в разделяющий гель, затем 180 В – до выхода красителя из геля. После электрофореза гель фиксировали и окрашивали в растворе, содержащем 10% уксусной киcлоты, 20% этанола и 0,5% кумасси. Фоновую окраску отмывали в растворе содержащем 10% уксусной киcлоты, 20% этанола.
8. Получение димеров рибосомы
Для димеризации рибосомы образец рибосомы был получен от доктора Хусаинова И.Ш.. Рибосома находилась в буфере (Р) Д. Для димеризации рибосомы был проведен поиск условий инкубации (буфер, температура, время) и различных концентраций белка. Лучшими для получения большого количества димеров рибосомы были следующие условия: 30 минут, 37C при молярном соотношении рибосомы и белка 1:10 в 50 мкл буфера (Р) Д в 1,5 мл эппендорфах. Для димеризации рибосомы фракции замороженной рибосомы размораживали на льду в течение 2-3 часов, перед проведением инкубации с белком. Смешивали растворы рибосомы и белка в молярном соотношением 1:10, добавляли буфер (Р) Д до объема 50 мкл и ставили на инкубацию в термостат на 30 минут при 37C . После завершения инкубации раствор вносили на градиент сахарозы 5-30%.
Градиент сахарозы готовили следующим образом: вначале в пробирку для градиента сахарозы с помощью шприца наносили раствор с меньшим процентом сахарозы, 5%. После нанесения раствора с меньшим процентом сахарозы, шприц с большим процентом раствора сахарозы, 30%, опускали на самое дно пробирки и постепенно из шприца выдавливали раствор с большим процентом сахарозы. При аккуратной работе граница между растворами очень четко различима. Затем пробирку помещали на машинку для формирования градиентов – Gradient Master и перемешивали. Параметры для Gradient Master выбирали исходя из следующих параметров: размер колпачка пробирки, природа раствора, процентность градиента и тип ротора, в котором будет происходит центрифугирование. По размеру
9 колпачки для пробирки различаются на длинные и короткие, выбор длинного колпачка позволит внести больше образца поверх градиента. Растворы с готовыми градиентами хранили при 4С в течении 3 часов (максимально 36 часов).
На первом этапе был проведен препаративный сахарозный градиент с
использованием ротора SW28 на ультрацентрифуге в течение 15:30 часов при
скорости 17100 об/мин и 4С. Пробирка для препаративного сахарозного градиента
имеет объем 34-35 мл, по 17 мл для каждого из растворов сахарозы (30% и 5%) и 1
мл для нанесения образца. Препаративный градиент способен разделить до 5 мг
рибосом, при нанесении большого количества, разделение рибосом с различным
коэффициентом седиментации происходит хуже. В нашем случае на градиент было
нанесено 2,5 мг рибосом (8 инкубируемых фракций). Результаты
центрифугирования анализировали с помощью комплекта оборудования BIO-RAD: Econo PUMP, Econo UV Monitor, Model 1327 Econo-Recorder, Model 2110 Fraction Collector. Вначале промывали оборудование теплой H2O, потом холодной. Настраивали параметры оборудования: скорость тока раствора 2 мл/мин, чувствительность измерения раствора 2 условных единиц, сбор фракций по 0,5 мл. Чем ниже скорость, тем аккуратнее отбираются фракции из пробирки. Параметры измерения раствора влияют на рисунок профиля градиента. Чем меньше объем собираемых фракций, тем точнее можно разделить рибосомы с различным коэффициентом седиментации на границе пересечения. После настройки оборудования необходимо обнулить параметр измерения H2O при скорости, которая используется для тока раствора. После обнуления микропипетку насоса (насос выключен!) опускаем на дно пробирки и включаем насос. Перед выходом раствора из шланга насоса, включаем коллектор фракций. Фракции, полученные в ходе сбора на коллекторе фракций, измеряются на NanoDrope (Делавэр, США) при длине волны 260нм. Исходя из показателей поглощения при 260нм, строится график градиента.
Фракции димеров рибосом подвергали диализу, в ходе которого происходит
избавление от сахарозы в растворе. Диализ проводили в буфере (Р) Д в диализных
мешочках в соотношении 1 мл раствора рибосомы к 100 мл диализного буфера в
течение 3 часов, потом буфер необходимо заменить на новый и диализовать в
течение 2 часов. Чем больше время диализа, тем больше вероятность полного
замещения буфера. После диализа раствор в диализных мешочках
концентрировали в концентраторах – Amicon Ultra, 50 KDa. Полученные
концентрированные растворы димеров очищали от примесей в следующем
сахарозном градиенте. Вследствие уменьшения количества рибосомы
продуктивным является проведение аналитического сахарозного градиента с использованием пробирок на 11-12 мл, ротора SW41 и центрифугирование на ультрацентрифуге в течение 15 часов при 16000 об/мин и 4С. Аналитический сахарозный градиент лучше разделяет образцы, содержащие молекулы различной седиментации. Сконцентрированные растворы рибосом измеряли на NanoDrope при длине волны 260 нм, полученное значение делили на коэффициент экстинкции (15 o.e. = 1 мг). Рекомендуемая, эмпирически выявленная нагрузка на градиент – 0,33 мг рибосомы S. aureus.
После центрифугирования, градиенты подвергали такому же анализу, как было описано выше при работе с препаративными сахарозным градиентом. Отличие в скорости тока раствора – 1 мл/мин, измерение раствора при 0,5
10 условных единиц (так как количество рибосом стало меньше, то чувствительность поглощения должна быть выше, чтоб можно было зарегистрировать наличие молекул).
Собранные фракции 100S рибосом после второго сахарозного градиента диализовали в буфере (Р) Д и использовали для следующих экспериментов или хранили в растворе сахарозы.
9. Проверка стабильности димеров рибосомы
100S (димеры) фракции рибосом проверяли на стабильность при хранении в
буфере (Р) Д при 4С и при заморозке в жидком азоте и дальнейшем хранении при
-80С. Для этого фракции рибосом подвергали аналитическому
ультрацентрифугированию. С помощью данного метода определяются все примеси
в растворе по коэффициенту седиментации. Для аналитического
ультрацентрифугирования очень важным является знание концентрации образца в
растворе. Значение концентрации рибосомы в растворе перемеряется в ходе
предварительного центрифугирования, которое проводится на ультрацентрифуге
при выбранном температурном режиме и при строгом его соблюдении. Для
центрифугирования использовали растворы рибосом объемом 400 мкл и буфер, в
качестве контроля, 420 мкл. Условия хранения буфера полностью совпадали с
условиями хранения анализируемого образца. Центрифугировали в течении ночи
при 4С и 15000 об/мин. Результаты аналитического ультрацентрифугирования
визуализировали с помощью программного пакета SedFIT
[]. Для этого необходимо
знать характеристику своего буфера, данные по которому можно найти на
следующем сайте . Данные характеристики позволяют
исключить влияние буфера на результаты эксперимента. В данном ряду
экспериментов тяжело рассчитать влияние сахарозы на коэффициент
седиментации, так как полностью избавиться от нее невозможно.
10. Подготовка фракций димеров рибосомы для криоэлектронной
микроскопии
Фракции димеров рибосомы в растворе сахарозы были заморожены в
жидком азоте и хранились при -80С. Перед использованием образцы
размораживались на льду и с помощью концентраторов происходила смена буфера
и концентрирование димеров до нужных значений, определяемых
экспериментальным путем. В статье (Khusainоv et al, 2016) мономеры рибосом для криоэлектронной микроскопии были использованы в концентрации 80 нМ, следовательно для димеров нужно использовать концентрацию 20 нМ.
Образцы димеров рибосомы в сахарозном градиенте объемом по 0,5 мл разморозили, перенесли в концентраторы объемом 4 мл, объем доводили буфером (Р) Д и концентрировали. Расчетная концентрация сахарозы в растворе димеров рибосомы после концентрирования составила 3%. Измеряли концентрацию рибосомы на спектрофотометре в кварцевых кюветах. Получили концентрацию димера рибосомы 20нМ (~ 0,075 мг/мл) для криоэлектронной микроскопии. Образцы рибосомы объемом по 4 мкл наносили на специальную подложку (медная сетка покрытая слоем углерода). Нанесение образца рибосомы на подложку происходит в боксах Vitrobot при 4С. После нанесения капли образца на сетку, лишнюю жидкость удаляли, чтобы оставить тонкий слой растворителя и сразу погружали в жидкий этан. Жидкий этан обладает высокой теплоемкостью и, в
11 отличие от жидкого азота, не закипает при контакте с сеткой. Затем образец на подложке перемещали в жидкий азот. В таком виде образец хранили до сканирования криоэлектронным микроскопом.
11. Предсказание структуры белка
Для предсказания структуры белка использовали следующие программы: Robetta, Quark (Xu et al., 2012), SWISS-MODEL, I-Tasser (Yang et al., 2015), Phyre2 (Kelley et al., 2015). В программах использовали базовые настройки. Анализ качества предсказанных моделей проводился с помощью программы Qmean (Benkert et al., 2011).
12. Молекулярно-динамическое моделирование белка
Равновесная молекулярная динамика предсказанной модели была проведена в программе NAMD 2.8 (Phillips et al., 2005) с использованием силового поля Charmm 36 (Best et al., 2012). Подготовка файлов для молекулярной динамики проводилась в программе VMD (Humphrey et al., 1996). Структура белка была помещена в ячейку с водой, заряд системы был нейтрализован добавлением ионов NaCl. Размеры ячейки составили 68х84х80 ангстрем. На первом этапе энергия системы белок-вода-ионы была минимизирована в течение 40000 шагов. На следующем этапе комплекс нагревали до 300 К с шагом 1 градус на 100 шагов динамики. Система, после нагрева, была поставлена на эквилибрацию кинетической и потенциальной энергий в течение 200000 шагов. После завершения подготовительного этапа была проведена равновесная молекулярная динамика подготовленной системы длительностью 100 нс (100000000 шагов) при 300 К. Анализ молекулярной динамики проводился с помощью программы VMD и статистического пакета bio3D в среде R (Skjrven et al., 2014; Grant et al., 2006).
Staphylococcus aureus
В большинстве случаев экспрессируемый белок должен содержать в своем составе обогащенные по ядрам атомы, в зависимости от задачи это могут быть 15N, 13С и другие атомы, поэтому необходимо контролировать условия среды роста клеток. Для этого были разработаны различные среды, источниками атомов в которых выступали только вещества с молекулами, состоящиеми из нужных изотопов. Например, для роста клеток в систмеме E. coli с 15N используют соли 15NH4Cl, а для 13С применяют молекулы глюкозы, где все атомы С имеют массу 13. Еще одним важным фактором является растворимость белка, чем больше белка в растворе, тем выше соотношение сигнал/шум в спектрах, а значит, требуется меньше времени на эксперимент. Некоторые эксперименты длятся долгое время, поэтому важным критерием является стабильность белка в растворе.
Первоначальным этапом исследований методом ЯМР является соотнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам. Чем больше размер белка - тем больше сигналов в спектре, что приводит к перекрыванию сигналов, поэтому для решения данной проблемы были разработаны подходы трехмерной спектроскопии ЯМР, которые сделали возможным перименение даннго метода к решению структуры белков (Clowes et al., 1993; Sattler et al., 1999; Cornilescu et al., 1999; Schwieters et al., 2003; Vranken et al., 2005). Основные эксперименты для соотнесения сигналов в спектрах ЯМР белков: HNCA, HNCO, HN(CO)CA, HN(CA)CO, CBCANNH, CBCA(CO)NNH, (H)CC(CO)NH, HCCH TOCSY (полная корреляционная спектроскопия). Следующим этапом, после расшифровки сигналов, являются эксперименты по ядерному эффекту Оверхаузера (ЯЭО), который позволяет определять взаимодействующие через пространство магнитные ядра из различных частей молекулы, отстоящие друг от друга на расстоянии до 5 . В результате получается массив данных с информацией о расстояниях между атомами, диэдральных углах и других параметров, с помощью которых, используя методы молекулярной динамики возможно установление пространственной модели белка. Глава 1.8 Крио-электронная микроскопия макромолекулярных комплексов
Крио-электронная микроскопия – структурный анализ образцов, замороженных в стекловидной форме льда, является одним из методов для определения трехмерных структур биологических молекул и молекулярных комплексов (Merino et al., 2016). Стекловидная (аморфная) форма льда образуется при мгновенной заморозке воды, которая препятствует образованию кристаллической решетки льда, так как при образовании кристаллической структуры льда происходит повреждение молекулы (Cheng et al., 2015). За последние два десятилетия эта методика была успешно использована для определения структур с разрешающей способностью 10 , а в некоторых случаях и 5 . Были определены структуры вирусов с икосаэдрической оболочкой и структуры рибосом. Недавнее развитие электронных микроскопов с возможностями автоматического сбора данных и надежных детекторов прямого обнаружения электронов (McMullan et al., 2014), а также новые мощные алгоритмы обработки изображений (Brilot et al., 2012), значительно расширило число биологических макромолекул, исследование которых возможно с использованием крио-ЭМ. Кроме того, новые технологические и вычислительные разработки были успешно использованы для определения, с относительно высоким разрешением, пространственных (3D) структур белков и белковых комплексов. С помощью этих новых достижений, крио-ЭМ в ближайшее время будет в состоянии определить 3D структуры с почти атомным разрешением (Binshtein and Ohi, 2015).
На данном этапе развития крио-ЭМ были улучшены микроскопы (высокое напряжение, устойчивые системы линз (Glaeser et al., 2011), стабильные криопроводники), технологии визуализации (прямой детектор электронов (Faruqi and McMullan, 2011; Li et al., 2013; Milazzo et al., 2011)) и вычислительные технологии (вычислительные кластеры, алгоритмы для обработки изображений (Bai et al., 2013; Campbell et al., 2012; Li et al., 2013)). Значительные усилия были приложены для упрощения и автоматизации
сбора изображений и использования программного обеспечения для их обработки (Lyumkis et al., 2010). Однако еще остаются спорные моменты в крио-ЭМ, такие как отсутствие простых и удобных в использовании объективных критериев качества и разрешения карт плотности.
Метод основан на детекции электронных пучков проходящих через образец и реконструкции полученных изображений с помощью вычислительных алгоритмов в пространственную модель молекулы (рис.9). Условия получения образца для крио-ЭМ предполагают нахождение молекулы в нативном состоянии, в процессе заморозки детекция происходит при очень низких температурах получаемых с помощью жидкого азота.
При нанесении образца на подложку очень важно учитывать его концентрацию, чтобы на карте плотности молекулы удалось различить их друг от друга. Например, при работе с димерами рибосом, важным является способность отличить димеризованную частицу рибосомы от мономерной рибосомы, от которой не удалось избавиться в ходе предварительной очистки. Еще одним важным фактором при пробоподготовке образца для криоэлектронной микроскопии является ориентация молекул в пространстве. Разнообразие ориентаций молекул в растворе позволит увидеть ее со всех сторон. Для достижения этих условий, слой растворителя должен быть достаточно тонким, чтобы исследуемые частицы не наслаивались друг на друга (иначе полученные проекции молекул будет невозможно обработать как отдельные частицы), при этом достаточно толстым, чтобы частицы могли свободно вращаться и диффундировать в этом растворе. Если все условия соблюдены, то в момент замораживания единичные частицы в растворе будут ориентированы по-разному, что даст разнообразие в полученных проекциях. Тогда получится исследовать частицу со всех сторон.
Клонирование С-концевого домена SaHPF
При сравнении положений струткур HPF и RMF в комплексе с рибосомой (Polikanov et al., 2012) и модели белка SaHPF, можно предположить, что первый домен белка SaHPF в структуре рибосомы займет позицию, схожую с HPF, а именно будет взаимодействовать с участками связывания тРНК, и белков IF1 и IF3; второй домен может занять позицию, характерную для RMF, то есть взаимодействовать с белками S7, S11 и S18 30S субъединицы. Таким образом, белок SaHPF благодаря выявленным структурным свойствам его доменов и петли может занять все вышеперечисленные участки в структуре рибосомы S.aureus.
Предсказание in silico структуры белка SaHPF позволило предположенить, почему не удалось получить кристаллы целого белка и его спектры в ЯМР экперименте. Это может объясняться большой подвижностью петли и С-концевого домена белка по сравнению с N-концевым доменом. Предсказанная структура также показала границы для С-концевого домена, что послужило дополнительной информацией для выбора размера фрагмента гена Sahpf для определения структуры методом ЯМР.
Как уже было сказано выше (глава 3.2), определение структуры полноразмерного белка SaHPF методом ЯМР не удалось. Были получены спектры только для N-концевого домена белка. Но наибольший интерес для исследования представлял С-концевой домен, так как совокупные первичные результаты крио-электронной микроскопии, ЯМР и биоинформатического анализа показали, что он участвует в димеризации. Поэтому был отдельно клонирован, экспрессирован ген C-концевого домена белка SaHPF, белок выделен и очищен. Результаты эксперимента по определению пространственной структуры С-концевого домена методом ЯМР, проведенные Усачевым К.С. в лаборатории ЯМР Института физики К(П)ФУ показали, что белок находится в димерной форме (рис. 27).
Пространственная модель С-концевого домена белка SaHPF представленная в виде димера по результатам определения структуры методом ЯМР, полученная Усачевым К.С. в лаборатории ЯМР Института физики К(П)ФУ. А. Домены окрашены по вторичным структурам: желтый цвет - -слой, фиолетовый - -спираль. Первая римская цифра – номер молекулы, вторая – нумерация -слоев в молекуле. Б. Окраска доменов по цепям. Подписаны -слои на переднем плане, между которыми образуются связи, подобная пара -слоев на задней стороне рисунка.
Домен представлен четырьмя -слоями и -спиралью. В пространстве молекулы С-концевого домена расположены следующим образом (рис. 27-Б): справа – первый -слой первой молекулы домена (синий цвет), далее четвертый-третий-второй -слои второй молекулы домена (красный цвет) и -спираль второй молекулы домена (красный цвет); слева (с задней стороны рисунка) – первый -слой второй молекулы домена (красный цвет), далее четвертый-третий-второй -слои первой молекулы домена (синий цвет) и -спираль первой молекулы домена (красный цвет).
На рисунке 28, показаны аминокислотные остатки димеров С-концевых доменов. С помощью экспериментов по спектроскопии ЯМР исследуемого белка было показано наличие стэкинг взаимодействия между F160 (во втором -слое) разных молекул, водородные связи между Y175 и гидрофобное взаимодействие между I173 двух молекул домена (в третьем -слое). На рисунке 27-Б показано, что есть две пары связей между двумя доменами: 1--слой первого домена и 4--слой второго домена, 1--слой второго домена и 4--слой первого домена.
С-концевой домен белка SaHPF: слева – смоделированные в атомарную электронную плотность, полученную в ходе определения структуры димеров рибосомы методом криоэлектронной микроскопии, С-концевые домены двух молекул SaHPF; справа – аминокислотные остатки С-концевых доменов двух SaHPF, взаимодействующие между собой.
Полученные фракции димеров нанесли на специальные сетчатые подложки и сканировали с помощью криоэлектронного микроскопа. Первичное сканирование отобразило наличие димеров в замороженных образцах (рис. 29).
Изображение, полученное криоэлектронным микроскопом в ходе сканирования димеров рибосомы S.aureus. Красным выделены структуры рибосомы в димерной форме, синим выделены хорошо различимые мономеры рибосомы (в том числе и в димерах рибосомы) На рисунке 29 кроме димеров рибосомы видны структуры мономеров, а так же части рибосомы. Однако надо понимать, что молекула димера рибосомы находилась в свободном движении, прежде чем была быстро заморожена, именно этим и объясняется наличие на рисунке частиц внешне непохожих на димеры, так как они оказались под другим углом на данной микрофотографии. Однако также не стоит исключать примеси мономеров и субъединиц.
Эксперименты по криоэлектронной микроскопии проводились Хусаиновым И.Ш. в Институте генетики, молекулярной и клеточной биологии (IGBMC, Страсбург, Франция). В результате криоэлектронной микроскопии были получены изображения димеров рибосомы S. aureus, которые в дальнейшем подверглись обработке с целью установления пространственной структуры. Было выбрано два пути анализа: димеры вместе (рис. 30-Б, слева) и мономеры димера по отдельности (рис. 30-Б, справа). Анализ изображений димеров в итоге дал пространственную структуру димера с разрешением 11 (рис. 30-В). Анализ изображений мономеров димера позволил улучшить разрешение структуры до 3,7 (рис. 30-Г), которые в дальнейшем были сконструированы в димерную частицу (рис. 30-Д).
Выделение и очистка белка для димеризации рибосомы 53 Глава 2.8 Димеризация рибосомы
S.aureus является причиной множества заболеваний (пневмония, менингит, эндокардит и др.), в том числе нозокомиальных инфекций (Murray et al., 2002; Le Loir et al., 2003; Fridkin et al., 2005). Некоторые штаммы S.aureus производят суперантиген ЦСТ-1, отвечающий за синдром токсического шока (Murray et al., 2002), который может являться причиной смерти в течение быстрого времени (Chen et al., 2007). S.aureus может вызывать очень серьезные заболевания, в том числе перитонит, остеомиелит, септический артрит, инфекции костей, суставов и органов (Murray et al., 2002; Fridkin et al., 2005).
S.aureus является стойким патогеном благодаря комбинации различных бактериальных иммунных стратегий (Kluytmans et al., 1997; Cole et al., 2001). S.aureus могут расти в диапазоне рН от 4,2 до 9,3 и концентрации соли до 15% (Le Loir et al., 2003). Бактерии могут выживать до 46 часов на стекле, после воздействия 17 или 7 часов солнечного света или ультрафиолетового излучения, соответственно; в течение 60 дней на мясных продуктах; до 7 дней на монетах, или от 30 мин до 38 дней на коже (Cimolai, 2008). S.aureus выработал ряд регуляторных механизмов, чтобы контролировать синтез своих многочисленных факторов вирулентности в зависимости от хозяина, стресса и изменения окружающей среды (Lowy, 1998).
В исследовании (Ueta et al., 2010; Ueta et al., 2013) описаны регуляторные механизмы, появляющиеся в неблагоприятных условиях среды, направленные на контроль трансляции посредством димеризации рибосом. Для S.aureus показано наличие белка SaHPF, который вызывает димеризацию рибосом, что позволяет не расходовать энергию на синтез полипептидов и способствует переживанию клеткой неблагоприятных условий. Глава 1.4 SaHPF – фактор инактивации рибосомы
SaHPF - Staphylococcus aureus hibernation-promoting factor – белок инактивации рибосомы бактерии стафилококка золотистого. Белок состоит из 190 аминокислотных остатков, молекулярная масса 22,22 кДа.
В работе Ueta et al., 2010, были обнаружены рибосомные частицы S. aureus с константой седиментации 100S – димер рибосомы. Анализ рибосомных фракций с помощью двумерного электрофореза показал, что среди рибосомных белков, как в общей фракции рибосом, так и в димерных фракциях рибосомы встречается еще один белок – SaHPF (рис.5). В случае общей фракции рибосом концентрация белка SaHPF незначительна, так как от общего количества частиц рибосомы в нормальных условиях существования клетки, лишь часть находится в димерном состоянии, в то время как в димерных частицах рибосомы соотношение белка SaHPF по отношению к другим белкам рибосомы можно соотнести как 1:1.
Вымывание белка SaHPF из 100S рибосом с помощью повышенной концентрацией соли приводила к распаду частиц на 70S рибосом. Напротив, добавление белка способствовало образованию димерной частицы рибосом. В аналогичных исследованиях с E.coli было показано наличие димерных частиц, в образовании которых принимали участие два белка: HPF и RMF (Polikanov et al., 2012). В обеих бактериях образование димерной частицы приводило к прекращению транслирующей активности рибосомы. В отличие от E.coli, димеры в S.aureus образуются во всех стадиях роста, достигая максимальной концентрации на переходе от экспоненциальной фазы к стационарной фазе (Ueta et al. 2010).
Биологическая роль белка заключена в прекращении транслирующей активности рибосомы, по существу клетка перестает тратить энергию и переходит на режим экономии. Взаимные превращения между неактивными 100S рибосомами и активными 70S рибосомами имеет важное значение для регулирования ответа на изменения окружающей среды. При нормализации условий среды повышается количество активных 70S частиц и клетка возвращается к нормальной жизнедеятельности (Wada, 1998; Aiso et al., 2005).
Предположительно, белок SaHPF взаимодействует с малой субъединицей рибосомы. В работе (Polikanov et al., 2012) методом рентгеноструктурного анализа были исследованы рибосомы T. thermophilus с белком HPF. Исходя из пространственной модели комплекса, можно предположить, что белок связывается с 30S субъединицей рибосомы и способствует двум рибосомам объединиться в димерную частицу, такие же результаты были показаны методом криоэлектронной микроскопии (Kato et al., 2010; Ortiz et al., 2010). Глава 1.5 Функциональные и структурные гомологи белка SaHPF
Белки, факторы регуляции трансляции, обладающие схожими с SaHPF функциями или структурой, были обнаружены так же у других бактерий (Wada A. 1998, Ueta M. 2008), и в некоторых растительных пластидах (Johnson C.H. 1990, Yamaguchi K. & Subramanian A.R. 2003).
Белки различной степени гомологии с SaHPF, структуры которых были определены: E. coli (HPF [pdb: 2RQL], YfiA [pdb: 1N3G, 1L4S], RMF [pdb: 4v8g] в комплексе с рибосомой), Haemophilus influenzae (raiA [pdb: 1IMU]), Thermus thermophilus (Protein Y [pdb: 2YWQ]), Coxiella burnetii (YfiA [pdb: 3TQM]), Vibrio cholerae (HPF [pdb: 4HEI]), Listeria monocytogenes (Lmo2511 [pdb: 3K2T]), Clostridium acetobutylicum (protein Y (PSrp-1) [pdb: 3KA5]), Streptococcus pyogenes (Ribosome hibernation promotion factor (HPF)/Ribosome-associated factor Y [pdb: 3LYV]). Согласно Ueta M. et al (2008), данные белки классифицируют как три типа: длинные HPF, короткие HPF и YfiA. Большинство бактерий обладают хотя бы одним типом белка. Наиболее изучены белки таких типов у E. coli: HPF, RMF (ribosome modulation factor) и YfiA. В работе Ueta M. et al (2005) показано, что за образование димеров рибосомы отвечает белок RMF, при взаимодействии с которым рибосома образует димерную частицу – 90S. Если добавить белок HPF и RMF, то константа седиментации димерной частицы будет равна 100S. При добавлении белков YfiA и RMF не происходит образования димеров, но при этом не наблюдаются процессы трансляции, как и в предыдущих случаях. Белки HPF и YfiA занимают схожие места в полости рибосомы, но YfiA длиннее, за счет чего блокируется взаимодействие рибосомы с RMF и димеры рибосом не образуются. В статье (Polikanov et al., 2012) методом рентгеноструктурного анализа показано положение данных белков в полости рибосомы (рис.6)
Выделение и очистка белка SaHPF и С-концевого домена SaHPF для определения структуры методом ЯМР
Клетки E.coli штамма BL21(DE3) с плазмидой pGS21a, несущий ген
полноразмерного SaHPF (& /:pGS21a) был получен от профессора Поликанова (Университет Иллинойса, Чикаго). Плазмида была выделена из ночной культуры клеток E.coli штамма DH5 выращенной в среде с ампицилином (100 мкг/мл). Для выделения плазмиды был использован набор от компании GenJet Plasmid MiniPrep (ThermoFisher Scientific, США). Для работы с последовательностью плазмиды была использована программа SnapGene.
С-концевой фрагмент белка, содержащий 60 аминокислотых остатков был получен путем ПЦР с праймерами pr-АА60 (прямой): 5 -ATAGAAATTATTCGTTCAAAAGAATTC-3 и pr-ATG (обратный) 5 -CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3 , где в качестве матрицы использовалась плазмида &V/:pGS21a (рис.10). Для амплификации использовали набор Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, США). ПЦР смесь состояла из 1хбуфера Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase, 2мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из нуклеотидов, 100 нг ДНК Sahpf::pGS21a, 2мМ каждого из праймеров, 1 ед. фермента (Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase). Температурный режим составлял один цикл первичной денатурации 95 С длительностью 3 минуты, далее следовали 30 циклов денатурации 95С в течение 30 секунд, отжига при 60 С в течение 30 секунд и полимеризации в течение 4 минут при 72С. Для достройки фрагментов после 30 циклов был введен дополнительный цикл 5 минут при 72С. Фрагменты, полученные в ходе ПЦР очищали с помощью набора GeneJet PCR Purification Kit (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя.
Для удаления исходной матричной ДНК плазмиды Sahpf. \pGS21 фрагменты ПЦР обрабатывали эндонуклеазой MalI (СибЭнзим, Новосибирск, Россия) при 37С в течение 3 часов. Очистку фрагментов ДНК производили в 1% агарозном геле: после электрофореза в трис-боратном буфере фрагменты ДНК соответствующие по размеру делеционному варианту ( 5,5 т.п.о.) вырезали из агарозного геля и очищали с помощью GeneJet Gel Extraction Kit (ThermoFisher Scientific, США). Очищенные фрагменты ДНК фосфорилировали, для этого 200 нг ДНК фрагментов помещали в 1 хбуфер для полинуклеотид киназы бактериофага Т4 (СибЭнзим, Новосибирск, Россия) и добавляли 2 мМ АТФ (NEB, США), смесь доводили до 20 мкл деионизованной водой и инкубировали при 37С. Фермент инактивировали прогреванием смеси до 70С в течение 10 минут. Лигазная смесь объемом 20 мкл состояла из 1хбуфера для лигазы Т4 бактериофага (ThermoFisher Scientific, США), 50 нг фосфорелированных фрагментов в предыдущем буфере, 1ед. лигазы Т4 бактериофага (ThermoFisher Scientific, США). Смесь инкубировали при 22С в течении 30 минут, после чего реакцию останавливали нагреванием смеси до 70С в течении 10 минут. После инактивации лигазы 10 мкл лигазной смеси использовали для трансформации клеток Е.coli DH5.
Культуры, полученные из клонов, с удаленным N-концевым доменом, использовали для выделения ДНК с помощью набора GenJet Plasmid MiniPrep (ThermoFisher Scientific, США). Для определения размеров вставки препараты плазмид обрабатывали рестриктазами Ndel и XhoI. Результаты рестрикционного анализа проверяли методом электрофореза в 1% агарозном геле по сравнению с исходной конструкцией &V/:pGS21a. Использовался буфер для нанесения образцов, содержащий 40 мМ трис, 32 мМ уксусной кислоты, 5 мМ ЭДТА, рН 8,0, 5% глицерина, 0,1% БФС, 0,1% ксиленцианола. К анализируемому образцу добавляли буфер для нанесения образцов (в объемном отношении 1:1 с образцом) и наносили в слоты геля. Электрофорез проводили в пластинке геля при напряженности электрического поля 10 В/см. Для окрашивания ДНК в гель вносили водный раствор бромистого этидия.
Выделение и очистку белка проводили для решения трех задач: получение образца белка для исследования методом ЯМР, для кристаллизации белка и димеризации рибосомы. В каждом случае использовался свой набор буферов. Буферы для выделения и очистки белка для исследования методом ЯМР и кристаллизации: Буфер А: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,5 М NH4Cl; 1 мМ ДТТ. Буфер Б: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 1 М NH4Cl; 1 мМ ДТТ. Буфер В: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,5 М NH4Cl; 20 мМ имидазол; 1 мМ ДТТ. Буфер Г: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,5 М NH4Cl; 0,3 М имидазол; 1 мМ ДТТ. Буфер Д: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,25 М NH4Cl; 1 мМ ДТТ. Буфер RE: 50 мМ RE; 0,5 М NH4Cl; 1 мМ ДТТ. Буфер Ch: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,25 М NH4Cl; 7 mM CHAPS; 1 мМ ДТТ. Буфер U: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,25 М NH4Cl; 220 нг/мкл polyU; 1 мМ ДТТ. Буфер Ph: 50 мМ фосфатный буфер, pH 6,8; 0,25 М NH4Cl; 1 мМ ДТТ. Буферы для выделения и очистки белка для димеризации рибосомы: Буфер (Р) А: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 10 мМ MgCl2; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) Б: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,5 М NH4Cl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ имидазол; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) В: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 10 мМ MgCl2; 20 мМ имидазол; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) Г: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 10 мМ MgCl2; 0,3 М имидазол; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) Д: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 50 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 1 мМ ДТТ. Буферы для димеризации и очистки димеров рибосомы: Буфер (Р) Е: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 50 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 5 % сахароза; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) Ж: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 50 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 30 % сахароза; 1 мМ ДТТ. Буфер (Р) З: 20 мМ трис-HCl, pH 7,6; 0,1 М NH4Cl; 500 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 1 мМ ДТТ. Глава 2.4 Использованные в работе методы 2.4.1 Разрушение клеток Замороженную фракцию клеток размораживали на льду. К одному грамму клеток добавили 2 мл буфера А (или (Р) А), PMSF и PIC. Все тщательно ресуспендировали на льду. Разрушение клеток проводили двумя способами: 1. Раствор клеток переносили в стеклянную посуду. Стеклянную посуду помещали в лед. Разрушали клетки с помощью ультразвука на оборудовании Bandelin Sonopuls (Германия). Для разрушения использовали следующие параметры: сила 40%, цикл 2, время 3 мин. Охлаждали клетки в течение 5 минут. Повторяли 3 раза. 2. Разрушали клетки под давлением на оборудовании Constant Cell Disruption System (гомогенизатор высокого давления) (Великобритания). Перед этим оборудование охлаждали до 4С с помощью проточного водного насоса. Для разрушения использовали следующие параметры: давление 1,2 кбар. Повторяли 3 раза. 2.4.2 Осаждение клеточных фракций