Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1. Современные представления о патогенезе хронического лимфоцитарного тиреоидита 11
1.2 Роль апоптоза в патогенезе АИТ 15
1.3. Аутоантитела к ДНК в норме и при патологий 21
1.3.1. Возможные механизмы реализации повреждающего действия каталитических аутоантител к ДНК при аутоиммунной патологии 21
1.3.2. Механизм участия. ДНК-абзимбв в патогенезе аутоиммунного синдрома 24
1.4. Генетические факторы риска развития АИТ 27
1.4.1 Полиморфизм гена поверхностного антигена цитотоксических Т-лимфоцитов СТЕА-4 31
1.4.2. Полиморфизм гена протеинтйрозин фосфатазы 36
1.4.3 Полиморфизмтена фактора некроза опухолей-альфа и его рецепторов 38
1.4.4 Полиморфизм генов цитокинов и их роль в аутоиммунитете 45
Заключение по обзору литературы 54
Глава 2. Материалы и методы исследования
2:1. Реактивы и оборудование 56
2.2. Объекты исследования 58
2.3 Приготовление раствора ДНК морского ежа 59
2.4 Определение AT к нативной и денатурированной ДНК методом иммуноферментного анализа 60
2.4.1 Подбор оптимальной концентрации конъюгата 61
2.5 Определение ДНКазной активности AT к ДНК 61
2.6 Электрофоретический анализ плазмидной ДНК pBR322 в, агарозном геле 62
2.7 Иммунофенотипирование лейкоцитов методом проточной цитометрии 63
2.8 Материалы и методы генотипирования 63
2.8.1. Выделение ДНК 63
2.8.2. Постановка ПЦР 64
2.8.3. Рестрикционный анализ 66
2.8.4. Разделение продуктов амплификации и рестрикции 66
2.9. Статистическая обработка результатов 66
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Характеристика процесса программируемой клеточной гибели и аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите 69
3.2. Выявление связи .между показателями активности аутоиммунитета: уровня специфических АТ-ТТ, АТ-ТПО, неспецифических AT к ДНК и функциональным состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите 77
3.3 Генетические факторы риска развития хронического лимфоцитарного тиреоидита 80
3.3.1 Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов с уровнем AT у больных АИТ 88
Глава 4. Обсуждение результатов 96
Выводы 111
Список литературы 132
- Роль апоптоза в патогенезе АИТ
- Полиморфизм генов цитокинов и их роль в аутоиммунитете
- Характеристика процесса программируемой клеточной гибели и аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите
- Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов с уровнем AT у больных АИТ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хронический лимфоцитарный тиреоидит (аутоиммунный тиреоидит (АИТ), тиреоидит Хашимото) - одно из наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ), частота которого среди взрослого населения колеблется от 6 до 11% (Валдина Е.А., 2001; Балаболкин М.И., 2002, Зефирова Г.С., 1999, Петунина Н.А., 2002). Исследования последних десятилетий указывают на мультифакторную природу данного заболевания (Davies T.F, 1998), но вопросы этиологии и патогенеза, терапии и прогноза заболевания не получили еще своего окончательного решения (Дедов И.И., 2003).
В настоящее время известно, что в основе развития аутоиммунных заболеваний, в том числе и АИТ, лежит нарушение процессов программируемой клеточной гибели, в частности апоптоза (Квачева Ю.Е., 2002; Петрищев Н. Н., 2008). Интерес к апоптозу обусловлен тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом тех сигнал-проводящих систем (интерлейкины (IL), интерфероны, нуклеазы), изменение которых имеет патогенетическое значение для АИТ. Тем не менее, механизмы дисрегуляции апоптоза в условиях реализации аутоиммунитета еще недостаточно исследованы (Недосекова Ю.В., 2009).
Рядом авторов показано, что маркером нарушения функционирования иммунной системы, приводящих к развитию и прогрессированию аутоиммунных заболеваний (АИЗ), являются аутоантитела (ААТ) к ДНК, которые, вероятно, и являются причиной деструкции тканей и органов, нарушая уровень физиологического апоптоза (Невинский Г.А., 2000, Сучков С.В., 2001). Различия в клинико-иммунологической картине АИТ (эу-, гипо- и гипертиреоз), видимо, связаны с феноменом гетерогенности ААТ (Сучков С.В., 2001), обладающих различными уровнями специфичности. Тем не менее, до настоящего времени нет единой точки зрения относительно причин и характера иммунных сдвигов, приводящих к утрате контроля над образованием ААТ и появлением, с одной стороны, абзимов с каталитическим и цитотоксическим эффектом, а с другой – ААТ к ДНК лишенных указанных свойств.
Кроме того, немаловажным фактором развития АИТ лежит изменение со стороны иммунокомпетентных регуляторных Т-клеток, генетический дефект которых, спровоцированный экзогенным воздействием, ведет к срыву их толерантности (Абрамова Н.А., 2006). На сегодняшний день существует более 100 генетических маркеров, которые тем или иным образом ассоциированы с развитием аутоиммунных патологий ЩЖ (Кандрор В.И., 2001). При этом фенотипическое проявление генетического полиморфизма в значительной мере зависит от генофонда и условий жизни каждой конкретной популяции, чем и объясняется противоречивость данных по ассоциации полиморфизма генов-кандидатов с риском развития АИТ.
Таким образом, на сегодняшний день представляется актуальной комплексная оценка биохимических и генетических факторов нарушения аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите среди населения Республики Татарстан (РТ). В связи с вышесказанным,
целью данного исследования является характеристика аутоиммунного процесса при хроническом лимфоцитарном тиреоидите и выявление генетических факторов риска развития данной патологии у населения РТ.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать процесс аутоиммуннитета и апоптоза при хроническом лимфоцитарном тиреоидите по содержанию специфических (аннексин V, TRAIL и TNF-) и неспецифических (АТ к нативной ДНК (нДНК), денатурированной ДНК (дДНК)) маркеров.
2. Исследовать наличие ДНК-гидролизующей активности АТ к ДНК в сыворотке крови больных хроническим лимфоцитарным тиреоидитом и здоровых лиц.
3. Изучить связь между показателями активности аутоиммунитета: уровня органоспецифических (АТ к тиреоглобулину (АТ-ТГ), АТ к тиреопероксидазе (АТ-АТ-ТПО)) и неспецифических АТ к ДНК с функциональным состоянием ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.
4. Изучить ассоциацию полиморфизмов: -318С/Т, -1661A/G и +49A/G гена CTLA-4, -1858С/Т гена PTPN22, -308A/G гена TNF-, -609G/T, -1135Т/С гена TNF-R1, +196T/G, del15bp гена TNF-R2, +3953С/Т гена IL-1, -590С/Т гена IL-4, -174C/G гена IL-6 с риском развития хронического лимфоцитарного тиреоидита и степенью активности аутоиммунного процесса у населения РТ.
Научная новизна
Впервые охарактеризован процесс программируемой клеточной гибели при хроническом лимфоцитарном тиреоидите по трем специфическим маркерам: аннексин V, TRAIL и TNF-. Показано, что при АИТ в стадии гипертиреоза имеет место TRAIL-индуцированный апоптоз с преобладанием некротических процессов.
Показано преобладание ААТ к денатурированной ДНК (АТ к дДНК) в сыворотке крови больных АИТ, при этом общий пул АТ к ДНК характеризовался изменением степени ДНК-гидролизующей активности и субстратной специфичности в процессе течения заболевания.
Исследована генетическая предрасположенность к хроническому лимфоцитарному тиреоидиту у населения РТ по 12 полиморфизмам 8 генов, продукты которых принимают участие в регуляции иммунного ответа.
Впервые проведен комплексный анализ по выявлению биохимических и генетических маркеров нарушения аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите.
Научно-практическая значимость работы
Данные, полученные в результате исследования, могут служить основой для формирования групп повышенного риска развития АИТ и разработки дифференцированных программ профилактики и ранней диагностики заболевания у конкретного человека с учетом данных генотипирования.
Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, генетики популяций, медицины и могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах.
Положения, выносимые на защиту:
1. Функциональное состояние ЩЖ при хроническом лимфоцитарном тиреоидите зависит от характера патологического процесса - апоптоз/некроз, что отражается в кластеризации специфических (АТ-ТГ, АТ-ТПО) и неспецифических (АТ к ДНК) ААТ, а также в изменении степени гидролитической активности и субстратной специфичности АТ к ДНК в процессе течения заболевания.
2. Повышенный уровень TRAIL отражает преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами при АИТ в стадии гипертиреоза.
3. Генетическими маркерами активации апоптоза и индукции аутоиммунитета при АИТ с высокой активностью аутоиммунного процесса являются полиморфизмы генов TNF- и его рецепторов, IL-1, IL-4 и CTLA-4.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского государственного университета (Казань, 2008 г.); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (памяти В.Г. Винтера) (Казань, 2009); Симбиозе-2009 (II Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов) (Пермь, 2009 г.); Всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии (тиреоидология, нейроэндокринология, эндокринная хирургия)» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010); Международной конференции «European Human Genetics Conference 2010» (Швеция, 2010); II Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, среди которых 2 публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включает 17 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, включающего 233 ссылок, из которых 57 - на отечественные и 176 на зарубежные работы.
Роль апоптоза в патогенезе АИТ
К настоящему времени показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции процесса апоптоза и генезом различного рода патологических состояний, в частности и аутоиммунных тиреопатий (Квачева Ю.Е., 2002). Между тем патогенетические факторы и механизмы его дисрегуляции в условиях реализации аутоиммунитета еще недостаточно исследованы. Кроме изучения разнообразных нарушений регуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при аутоиммунных тиреопатиях огромное значение придается апоптозу клеток самой ЩЖ.
Аннексии А5, как и другие аннексины, не выделяется из нормальных клеток; источником внеклеточного аннексина А5 являются апоптотические и разрушенные клетки. Одним из ранних признаков апоптоза служит экспозиция на клеточной мембране фосфатидилсерина (PS). Этот процесс является неотъемлемой частью апоптоза; независимо от типа клеток и пускового механизма активации, программы клеточной гибели. Исследователи отмечают, что вТЦЖ больных АИТ- количество тиреоцитов, претерпевающих апоптоз, повышено. Данных факт согласуется с тем, что лимфоциты, инфильтрирующие железу, характеризуются повышенной экспрессией FasL (Bretz J.D., 1999). Установлено, что рецепторопосредованные формы апоптоза- включают мембранные рецепторы, которые активируются растворимыми лигандами, например фактор некроза опухолей (TNF). - г, АроЗЬ и FasL ((Ashkenazi V.M1., 1998; Arscoott P.L.," et al., 1998). Указанные рецепторы активируются при тримеризации соответствующими лигандами и передают специфический сигнал через адаптерные молекулы. Последние непосредственно активируют протеазы и нуклеазы, участвующие в протеолизе клеточных компонентов, приводяк гибели клеток.
FasL является трансмембранным белком, относящимся- к семейству TNF, который индуцирует апоптоз путем связывания и активируя рецептор Ras (Apo-l/CD95), относящийся к суперсемейству рецепторов TNF. Если Аро-1 выявляют в нормальной ткани ЩЖ, то FasL в нормальной железе практически не присутствует и экспрессируется лишь при нетоксических формах зоба и хроническом АИТ (Mitsiades N., et al., 1998), активируя апоптоз и приводя к деструкции ЩЖ (Данилевский М.А., с соавт, 2002).
Существует альтернативная модель рецептор-опосредованной апоптотической гибели тиреоидных клеток при АИТ.
Цитокин TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing ligand) был обнаружен в 1995 году на основе гомологии последовательности с другими членами семейства TNF. TRAIL - лиганд, имеющий значительную гомологию с FasL. Он индуцирует апотоз посредством рецепторов -4 5 гибеликлеток (DR-4,-5), экспрессирующиеся на фолликулярных клетках, Он экспрессируется; в клетках в виде, трансмембранного белка П. типа., Щ результате- расщепления протеазами внеклеточный; домен- TRAIL высвобождается. из клетки в свободном растворимом тримерном- виде.
Рекомбинантныи: растворимый TRAJE способен: вызывать, апоптоз; в;. Y культурах клеток из широкого спектра-человеческих" опухолей; не: затрагивая; нормальные" клетки. Благодаря этому свойству препарат рекомбинантного цитокйна TRAIL. рассматривается в качестве: потенциального терапевтического средства для лечения раковых: заболеваний.
Экспрессия, TRAIL активизируется» под воздействием: провоспалительных цитокинов на. тиреоцитах и на: аутореактивных иммунных клетках. В результате TRAIL опосредует как апоптоз, тиреоцитов; так и, протекцию тиреоидных клеток от цитотоксического- воздействия? иммунной» системы. Иммунные клетки, активированные аутоантигенами»- -, тиреоцитов, становятся- восприимчмвымш к TRAIL. Так; уничтожению.5. -подвергаются только иммунные, клетки со специфичностью по отношению к-: тиреоидным аутоантигенам (Nakahara Mi, et aL, 2009).
Терапевтический потенциал TRAIL оказался; ограничен в связи: с тем, что многие- первичные: опухоли- резистентны, к TRAIL. Нёсмтряс на» . ,. интенсивные исследования, механизмы, лежащиевоснове:эффективности:и селективности действия TRAIL, окончательно не выяснены. Одной из-причин является сложный механизм взаимодействия: TRAIL с его пятью рецепторами, из которыхлишь два, DR-4 и DR -5 способны-проводить сигнал апотоза.. Другие три рецептора участвуют в регуляции TRAIL -индуцированного апоптоза, ингибируют его, конкурируя с рецепторам» смерти.
При развитии аутоиммунных процессов, сопровождающихся воспалением, макрофаги и моноциты периферической крови начинают. синтезировать провоспалительные цитокины, которые стимулируют массивную экспрессию рецепторов, опосредующих программированную клеточную гибель тироцитов. Это делает доступными клетки ЩЖ доступными для цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов. Можно предположить, что эти процессы усугубляют повреждение тиреоцитов и способствуют развитию аутоиммунной патологии (Jiskra J., et al., 2009).
Следует подчеркнуть, что механизм развития АИТ со специфическим дефицитом Т-лимфоцитов супрессоров (CD8 ). В частности, в своих исследованиях R. Volpe (1997), показал, что АИЗ ЩЖ возникают в результате нарушения регуляторних процессов в самой иммунной системе и это нарушение частично связано с наследственным дефектом АГ-специфических Т-супрессоров и влиянием факторов окружающей среды на иммунорегуляцию. Дедов И.ТЇ. с соавт., (2002) считают, что генетический дефект Т-супрессоров приводит к размножению запрещенного клона Т-лимфоцитов, их контакту с антигенами ЩЖ, передачи информации В-лимфоцитам и плазматическим- клеткам, последние продуцируют органоспецифические AT, которые, кооперируясь с Т-лимфоцитами-киллерами на поверхности клеток фолликулярного эпителия, оказывают цитотоксическое влияние на гормоно-активные клетки, вызывая их деструкцию и изменение функции органа. Этот процесс носит название «антителозависимое клеточно-опосредованная цитотоксичность».
Известно, что все клетки организма имеют иммунологическую толерантность, которая приобретается в перинатальный период при контакте незрелых лимфоцитов с собственными АГ. Различные отклонения этих процессов в такой критический период и образование отдельных клонов лимфоцитов, могут стать причиной нарушения такой толерантности и в последующем вести к развитию АИЗ (рис. 1).
В основе патогенеза заболевания лежит изменение со стороны иммунокомпетентных регуляторных Т-клеток. Генетический дефект этих клеток, спровоцированный экзогенным воздействием, ведет к срыву толерантности и инфильтрации ЩЖ Т- и В-лимфоцитами, макрофагами. В ответ на повреждающее действие аутоагрессии наблюдается гиперплазия ЩЖ, поддерживающая состояние эутиреоиза, иногда сопровождающееся признаками гиперфункции. Длительный процесс аутоагрессии приводит к постепенному снижению функциональной активности ЩЖ - гипотиреозу (Данилевский М.А., с соавт., 2002).
Полиморфизм генов цитокинов и их роль в аутоиммунитете
Цитокины, представляют собой группу полипептидных, медиаторов; участвующих в формирований и регуляции защитных реакций организма. В первую, очередь -они регулируют развитие местных защитных реакций; в тканях- с; участием различных типов; клеток, кровщ эндотелия, соединительношткани- и клеток эпителия. Гиперпродукция цитокиновведеґк, развитию системной воспалительной, реакции и, может служить-, причиной .развития ряда патологических состояний; в частности; и-АИЗ!..
Экспрессия генов» цитокинов начинается; в; ответ на проникновение в организм; патогенов антигенное: раздражение или-! повреждение тканей: Согласно- данным последних;: лет,; полиморфизм; генов;. кодирующих: цитокины, оказывает существенное влияние на предрасположенность .к: различным: заболеваниям. Исследуемые в, данной; работе гены, цитокинов» являются как провоспалительными; обеспечивающие, мобилизацию воспалительного ответа (IL-Г,. EL-6);. так и противоспалительными (IL-4) ограничивающие развитие воспаления
Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество участков этого полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятковий располагаться они могут как в кодирующих экзонах, так и в интронах и,, что особенно важно; в промоторных регуляторных зонах структуры гена. Эти участки ДНК содержатзоны связывания регуляторных факторов, которые определяют не структуру считывания, а интенсивность наработки клеткой конечного белкового продукта, т.е. самих молекул интерлейкина. Другими словами, наличие аллельного полиморфизма в промоторных участкахгенов интерлейкинов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции цитокинов при антигенной стимуляции, т.е. при формировании воспалительных клеточных реакций, в том числе и такого заболевания как АИТ.
Полиморфизм +3954С/Т гена IL-10. IL-1 - цитокин с широким диапазоном биологических и физиологических эффектов, включая генерацию лихорадки, синтез простагландинов, активацию Т-лимфоцитов. Из клинических наблюдений известно, что реализация воспалительного ответа у разных лиц. может существенно различаться по интенсивности и продолжительности, у одного больного протекать более остро, агрессивно и сопровождаться высокими значениями лихорадки; у другого иметь затяжной характер и протекать хронически, не сопровождаясь выраженным повышением температуры тела.
В семейство IL-1 принято включать IL-la, IL-lp\ рецепторный антагонист IL-1 (IL-Ra), рецепторы EL-1R и IL-18. Это семейство - член суперсемейства, в которое также входят гены, связывающих гепарин ростовых факторов, ингибиторов трипсина и гистактофилина. Все они имеют подобные структуры, семейства генов IL-1 и гепарин ростовых факторов имеют приблизительно 25%-ное сходство последовательности. Подобие последовательности в пределах подсемейств, кодирующих IL-la. и IL-lp, достаточно высоко - приблизительно 70%, но между подсемействами сходства меньше: на уровне ДНК степень гомологии между IL-la и IL-ip составляет 45%, тогда как на аминокислотном уровне - только 26%. Процессинг функционально неактивного белка_предшественника IL-ip (ЗІкДа) в активную форму (17кДа) осуществляется высокоспецифичной цистеиновой. Другое название этого фермента - ГЬ-1-(3-конвертаза (Erdogan М., et al., 2000). Биологические: эффекты EL-p . реализуются после связывания со специфическим, мембранным рецептором IL-1RI. IL-lRa также может: связыватьсяг с этим: рецептором,, блокируя эффекты IL-1. На основании-анализа: структуры генов высказано предположение; что ген5 IE-1(3 произошел из rem-EL-la путем дупликации ДНК в,результатеіобратнойтранскрипции:.
Еены, кодирующие ILrip и IL-lRa; картированы-. на-: длинном плече хромосомы2 B,o6JiacTHql4..Известно два биаллельныхполиморфизма в гене: И,-13:-в промоторнойчасти в положении—511с заменой цитозина на.тимин и в 5 экзоне +3954 также: с заменой цитозина на тимищ где. аллели -51 IT и . +3954Т ассоциированы с более высокой продукцией, цитокина. (Hunt P.J., 2007); Ген IL-1B содержит 22 экзона, 20 из; которых альтернативные (т.е; имеют структурные варианты);и 9і интронов; из- которых альтернативных--8...
. Обагена имеют нетранслируемые; области-на 3 и 5 концах..Более тогОі для: них характерна высокая степень гомологии интронных последовательностей; ЧТОІ, как предполагается,- играет валеную регуляторную роль .в. экспрессии. этих генов (ErdoganMS, 2000).,
Равновесие: между продукцией экспрессией: и; ингибйцией синтеза:, белков: семейства-IE-1 играет одну из ключевьшролей в развитии:, регуляции-и исходе: воспалительного процесса. Склонностью более высокой выработке этого цитокина, выявленная, в первом исследовании : сохраняется, и в, более поздних измерениях, а такжеимеет тенденцию передаваться по наследству;
Частное распределение аллелей гена IL-1 различается у европеоидов Северной Америки и Европы, а так же жителей разных регион России, с другой стороны распределение частоты этих мутаций у популяций Санкт-Петербурга, схожи с данными по финской популяции и у здоровых жителей Башкирии (фино-угорская группа). Различия в частоте встречаемости аллелей:генов семейства IL-1 свидетельствует о том,.что принадлежность к различным расам и даже проживание на разных территориях оказывает влияние на характер их распределения частот аллелей и генотипов (Kotsa: К.А.,2004).
Очевидно; индивидуальный ансамбль аллельных вариантов генов5 цитокинов может отчасти- определять, характер воспалительного1 ответа (ErdoganM-, 2000). По всей" видимости, в зависимости от индивидуального ансамбля высоко или низкопродуцируюших вариантов: генов цитокинов, участвующих в реализации воспаления; характер: воспалительного; ответа; может значительно различаться между индивидуумами: с полярными генотипами: например, ряд генов провоспалительных цитокинов. являются» высокопродуцирующими, а противовоспалительных цитокинов — низкопродуцирующими.; - «провоспалительный генотип»;: или обратная. ситуация - «противовоспалительный генотип» B целом, влияние полиморфизма теков\ІЬЇ-/1 wIL-IR:n& характер-воспаления; вероятно, можно описать в виде следующих:тенденций: носительство неМутантных вариантов этих: генов: определяет адекватную. продукцию соответствующих; белков и регуляцию функционирования.системы IL-l"(Wang L. ,.2007).
Полиморфизм -59ОС/Т гена:Ш-4\. Особенность IL-4.-. отличающая:его от: других цитокинов, состоит в наличии- видовошспецифичности; Ш-4 человека: оказывает биологическое: действие на клетки человека, и обезьян, но? не мышей. В свою очередь IL-4 мыши: действует только на клетки., мышей. Источником IL-4 являются Т-хелперы, стимулированные митогеном; тучные клетки, неидентифицированные клетки стромы костного мозга. EL-4- продукт субпопуляции активированных Т-клеток - действует через: специфический рецептор (Chung А., 2001).
Рецептор IL-4 выявленный на покоящихся Т-клетках, В-клетках, макрофагах, тучных клетках,, на стромальных клетках костного мозга, клетках печени, мышцах, фибробластах. Известно что IL-4 усиливает экспрессию антигенов гистосовместимости II класса ( МНС II) в покоящихся В-клетках; а также синтез иммуноглобулинов IgG и IgE после стимуляции липополисахаридом, поддерживает жизнеспособность и рост интактньйх Т-клеток, повышает активность цитотоксических Т-лимфоцитов, усиливает пролиферацию предшественников гемопоэза при ответе на ростовые факторы. Терапевтический потенциал цитокина связан с его возможностью восстанавливать клеточный и гуморальный-иммунитет (Chung А., 2001).
Рецепторы к IL-4 с весом 139 кД представлены,на поверхности клеток-мишней. При этом их количество увеличивается,в 5-10 раз при той или иной форме активации клеток. Мишени регуляторного действия» IL-4, имеющие соответствующие рецепторы, относятся к самым разнообразным клеточным типам.
Участвует IL-4 и в развитии костномозговых клеток-предшественников. Один IL-4 не изменяет интенсивность пролиферации этих клеток, но усиливает митотические процессы в сочетании- с другими . ростовыми факторами. Тандем EL-4 с гранулоцитарным " колониестимулирующим фактором обеспечивает более активное размножение клеток гранулоцитарного и моноцитарного ростков дифференцировки, тандем с эритропоэтином - эритроидных предшественников, с IL-1 - размножение клеток-предшественников мегакариоцитарного пути развития (Bowes J., 2008).
Ген; кодирующий IL-4, картирован на длинном- плече хромосомы 5 в области q31. Известно, что полиморфизм в гене EL4: в промоторной части в положении -590 (С-590Т). Аллель С ассоциирован с более высокой продукцией цитокина (Magistrelli G.A., 1999).
Характеристика процесса программируемой клеточной гибели и аутоиммунитета при хроническом лимфоцитарном тиреоидите
Специфические маркеры апоптоза. К настоящему времени показана взаимосвязь между нарушениями регуляции процесса апоптоза и генезом аутоиммунных тиреопатий. Наибольший интерес вызывает регулирующее влияние на апоптоз биологически активных веществ, прежде всего цитокинов (Fas, TRAIL, TNF-a и др.) (Попов Л.С., 2004). Причем, TRAIL опосредует как апоптоз тиреоцитов, так и цитотоксических аутореактивных лимфоцитов (Nakahara М., 2009). TNF-a является гомологом FasL, что свидетельствует о его высокой апоптогенной активности. В связи с этим, нами охарактеризован процесс апоптоза на основании количественной оценки трех специфических маркеров: аннексии V, TNF-a, TRAIL,
Биохимические изменения при апоптозе включают транслокацию фосфатидилсерина (PS) с внутренней стороны плазматической мембраны. Связываясь с PS на поверхности клетки, аннексии V, конъюгированный с флуорохромом, также служит маркером апоптоза (Gerke V., 2002). Установлено, отсутствие- значимых различий в содержании аннексина V в сыворотке крови больных АИТ с разным функциональным состоянием ШЖ и контрольной группы здоровых лиц (табл. 4), что свидетельствует о нормальном, с физиологической точки зрения, течении апоптоза при АИТ.
В результате наших исследований, получено достоверное повышение уровня TRAIL в. сыворотке крови у больных- АИТ с гипертиреозом по сравнению со здоровыми лицами.: Достоверных различий, между уровнем! содержания TRAIL у больных АИТ с гипотиреозом эутиреозом и здоровых доноров выявлено не было (табл. 4). Однако необходимо, отметить тенденцию к снижению уровня TRAIL в сыворотке крови больных АИТ: гипертиреоз гипотиреоз эутиреоз, а также разброс индивидуальных показателей уровня TRAIL у больных АИТ с гипотиреозом и эутиреозом.
Корреляционный анализ между уровнями TRAIL и аннексина V в общей выборке больных АИТ выявил прямую корреляционную зависимость слабой степени (Rs=0,07) (р 0,05) (рис. 3).
Таким образом, установлено, что при АИТ имеет место TRAIL-индуцированный апоптоз. Выявление максимального повышения уровня TRAIL при АИТ с гипертиреозом отражает преобладание некротических процессов над апоптотическими механизмами. Полученные результаты согласуются,с данными большинства исследователей, которые указывают на деструктивную природу гипертиреоза при АИТ (Volpe R., 199І;,Балаболкин МИіссоавт.,2007).
Усиление: синтеза TNF-a; является ключевым фактором активации; иммунокомпетентных клетокпри ряде аутоиммунных заболеваний»: (Soory А, 2002);
Нами была обнаружена тенденция, к повышению содержания TNE-a в сыворотке крови больных АИТ не достигшая; уровня; статистической. достоверности (р 0,05). Максимальное повышение уровня TNE-a в сыворотке крови; при АИТ наблюдалось у пациентов с гипертиреозом (табл.
Таким образом, повышение TNE-a в сыворотке; кровю больных АИТ с . гипертиреозом еще раз подтверждает.тезис о; возможном, преобладании: некротических процессов над. апоптотическими. Если судить по. степени разброса индивидуальных показателей TNE-a при гипотиреозе (95% ДИ:0,99-5,61)- и эутиреозе (95% ДИ 2,59-5,9), то; можно предположить, что уровень этого цитокина отражает зависимость функционального состояния ЩЖ от характера патологического процесса (апоптоз/ некроз), в тиреоиднойткани.
Неспецифические маркеры апоптоза. Исследованиями: ряда; авторов было показано; присутствие в. сыворотке крови- больных аутоиммунных заболеваний ЩЖ ДНК-связывающих AT, проявляющих ДНКазную активность (Невинский FА., 2000; Бреусов А.А-, 2001; Сучков С.В:, 2002) и их определение, рекомендовано для скрининга АИЗ (Коликова Ю;0;, 2003). В настоящее время показано; что AT к ДНК, обладая гидролизующими свойствами ферментов, способны выступать в роли мощного регулятора апоптоза, скорость которого при АИТ многократно увеличивается (Кандрор В.И., 2001). В связи с этим, нами проведена оценка уровня; AT к; нДНК и дДНК в группе больных АИТ по сравнению с контрольной группой здоровых лиц (табл. 5; рис.4).
Нами установлено достоверное увеличение AT к дДНК у 97% больных АИТ по сравнению со здоровыми-лицами (Р=0,001, 95%ДИ 0,34-0,41): Из них у 75% при гипертиреозе, 85% при гипотиреозе, 841,7% - эутиреозе. В общей выборке больных АИТ обнаружена тенденциям увеличению AT к нДНК, не достигшая уровня достоверности (р 0,05).
Учитывая роль ДНК-абзимов (ДНК-связывающих аутоантител с ДНК гидролизующими свойствами) в патогенезе АИЗ и программированной клеточной гибели (Сучков СВ., 2002), обнаруженные AT к ДНК были изучены на наличие каталитической активности в зависимости от функционального состояния ЩЖ. При изучении ДНК-абзимов закономерно встает вопрос о принадлежности каталитических свойств собственно AT, так как в сыворотке крови содержится значительное количество ДНКаз, которые могут совыделяться с Ig, поскольку Ig могут образовывать комплексы с различными белками и ферментами (Невинский Г.А., с соавт., 2000). Известно, что активность сывороточных ДНКаз является термолабильной и полностью инактивируется при 56С (Невзорова Т.А., с соавт., 2003, Барановский А.Г., 1997). Для исключения возможного влияния сывороточных ДНКаз на гидролиз плазмидной ДНК, сыворотки крови-здоровых лид, больных СКВ и АИТ, предварительно подвергались прогреванию при +56С в течение 40 минут.
После прогревания сыворотки крови доноров утрачивали способность превращать субстрат — суперспиральную ДНК pBR322 (I форма) — в кольцевую (II форма) и линейную (III форма) формы.
На рисунках 5 и б, отражающих гидролиз субстрата антителами к ДНК у больных АИТ с гипертиреозом, показано, как по мере увеличения времени реакции снижается количество субстрата-суперскрученной ДНК (I форма), и нарастает количество продуктов ее расщепления.
Образование кольцевой формы ДНК (II форма), - продолжается на протяжении 24 часов- и появление линейной формы ДНК (III форма) отмечается через 6 часов1 от начала инкубации, что( указывает на более высокую гидролитическую активность AT к ДНК и их субстратную специфичность к одноцепочечной ДНК.
На рисунках 7 и 8, отражающих гидролиз субстрата антителами к ДНК . у больных АИТ с гипотиреозом, также показано снижение количества суперскрученной ДНК (I форма), и увеличение количества продуктов ее расщепления.
Кольцевая форма ДНК (II форма) образуется на протяжении 24 часов реакции. Однако, линейная форма ДНК (III форма) появляется через 12 часов инкубации. Это свидетельствует о более низкой гидролитической активности AT к ДНК и их сродства к одноцепочечной ДНК у больных АИТ с гипертиреозом по сравнению с АИТ в стадии с гипотиреоза (табл. 6).
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов с уровнем AT у больных АИТ
Поскольку исследованные,нами гены вовлечены-в.регуляцию: Т-клеток, которые,, в свою очередь стимулируют В-клетки к выработке: АТ-ТЕ и -ТИО, в; группах больных провели- оценку среднего уровня показателей АТ-ТЕ и -ТИО, а также уровня AT к. нативной и денатурированной-; ДНК среди носителей разных генотипов изучаемых полиморфных- маркеров.
Наиболее высокое: содержание АТ-ТЕ наблюдалось у носителей генотипа KG- (ОПТ 2 1) полиморфизма -1661A/G; аллеля, G (ОШ. 1,49) и гомозиготного генотипа GG (ОШ 11,1); полиморфного варианта +49A/G: Тогда как генотип АА (ОШ 0,8)? промоторного полиморфизмам -1661A/G достоверно чаще, встречался1 в, группе с нормальным содержанием; до 100 мЕд/мл (58% у больных с: нормальной выработкой-АТ-ТЕ, 41%.у больных с содержанием более 100 мЕд/мл, р=0,009 ).
"Но полученным намигданным высокий уровень АТ-ТЕ ассоциировано носительством аллеля С (52% у больных с нормальным содержанием: AT, 64% - у больных с титром АТ-ТЕ более ТОО мЕд/мл, ОШ 1,62, р=0;025) полиморфизма +3953G/T гена IL-ip. Тогда как аллель Т (ОШ.0;б1, 47% до 100 мЕд/мл против 35% более 100 мЕд/мл) и гомозиготный генотип по данному аллелю (ОШ0,19, 21% и 5%, соответственно) и генотипа ТТ (ОШ 0,19, Ї9%-норма, 8% - выше нормы, р=Ю,01) локуса -590С/Т гена IL-4 обладали протективным действием, поскольку встречались достоверно чаще в группе больных АИТ с выработкой данных AT в пределах нормы (табл. 12).
Согласно полученным нами данным по изучению ассоциации, генов TNF-a я его рецепторов с выработкой АТ-ТГ, наибольший риск наблюдается у носителейіаллеля G (ОШ 1,7, 44% у больных с титром более ЮО мЕд/мл, с нормой- 30%) и генотипа1 GG(OIH;3;l, 19% и-9%, соответственно) (р 0,05) полиморфизма -308A/G гена.TNF-a, а ткаже аллеля С (ОШ 2!,2;:73%tH 54%, соответственно) и генотипа; СС (ОШ 4,08; 25% и 10%, соответственно) полиморфного.варианта-1;135Т/СTenaTNF-Rl (табл. 13).
Аллель А (ОШ 0,5- р=0,01) и гомозиготный генотип АА (ОШ 0,31; р=0,036) полиморфизма -308A/G гена TNF-a,. аллель Т (ОШ 0,44, р=0,00027) встречались достоверно.чаще в группе больных с номальным титром АТ-ТГ.
Высокий уровень аутоиммунного процесса (содержание АТгТИО более 1000МЕ/мл) был выявлен у- больных-носителей аллеля G (ОШ-1,96? и 1,5Г, соответственно) и генотипа AG (ОШ 2,59 и 3 49; соответственно) дак "для промоторного1 -1661A/G, так и для экзонного полиморфизма? +49 A/G: гена СТЬА-4. Тогда как нормальный: аллель А (ОШ 0,51) локуса--1661A/G преобладал в группе больных с нормальным содржанием АТ-ТПО (78% у больньгх с АТ-ТПО до:30-МЕ/мл против 65% у больных,с титром AT более 1000 мЕд/мл, р=0,03)(табл. 14).
Высокий уровень АТ-ТПО был обнаружен у носителей аллеля G (ОШ 2,11, 42% для больных с титром более 1000 мЕд/мл и 27% - для нормы; р 0,001) и генотипа AG (ОШ 2,89; 53% и 36%, соответственно, р=0,01) локуса 308A/G гена TNF-a; генотипа II (ОШ 1,38; 50% и 26%, соответственно; р 0,05) делециоішого полиморфизма 15Ьр гена TNF-R2, а так же аллеля С (ОШ 1,8; 73% и-53%, соответственно, р 0,002) и генотипа СС (ОШ 2,32; 57% и 30%, соответственно, р 0,0002) -1135 Т/С гена TNF-R1 (табл. 16).
Протективным действием обладали аллель. А (ОШ; 0,47; 72% и=57%, соответственно, p=G,001) w генотип; АА локуса. -308A7G тена. TNF-a? и генотипы АА (ОШ0;27;.54%и 30%, соответственно, р,0,0008), GT (ОШ 0,33; 45%; и; 30%, соответственно, р==0;006) щ ГО (ОПТ 0;5;: 61%. и 27%,. соответственно,.р=0,001).полиморфных локусов";.-308A7G гена;:TNF-a, -1135; Т/Єтена 22VF-J?iH del 15Бр гена TNF-R2 (соответственно). " "
В; основе АИТ лежит снижение; иммунной толерантности? к собственным-! антигенам, приводящее, к, неконтролируемому синтезу ААТ к ткани. ЩЖ,. особенно к ядерным антигенам; Нарушение иммунной толерантности возникает вследствие; врожденного или приобретенного дефекта как в системе Т-лимфоцитов (снижение- активности Т-супрессоров, уменьшение продукции-интерлейкина-2); так .и-В1системе (поликлональная активация). Патогенетическое значение, имеют- антитела к ДНК которые оказывают повреждающее действие, сопровождающеесяразвитием типичной воспалительной реакции (ДядыкА.И: с соавт., 2009):,
Поскольку, изученные нами; гены участвуют как в ингибировании активации.; Т-лимфоцитов (ЄТБА}4- и PTPN22), так, и в, воспалительных реакциях (Ш-10, -4,. -6), был проведен, анализ ассоциации полиморфных маркеров с уровнем.АТ к ДНК.
В результате-исследования значимые различия-в уровнях.AT к.ДНК между носителями отдельных генотипов . обнаружены только; по/ полиморфномумаркеру -16б1А/6гена CTLA-4 (рис. 16).
Как показано на рисунке, у носителей гетерозиготного генотипа GG наблюдается достоверное; повышение уровня AT к дДНК по сравнению с уровнемАТ к нДНК (р 0,005, 95%ДИ 0,06-0,12), несмотря на то, что, в целом содержание AT к ДНК у таких индивидуумов ниже, по сравнению с носителями других генотипов.
Таким образом, носители определенных .генотипов по полиморфным локусам генов CTLA-4, TNF-a и его рецепторов, а также провоспалительного интерлейкина-1(3 характеризуются повышением содержания органоспецифических аутоантител (АТ-ТГ, АТ-ТПО), тогда как на уровень неспецифических аутоантител (AT к ДНК) оказывает влияние только полиморфизм -1661A/G гена CTLA-4, продукт которого принимает участие в активацию Т-лимфоцитов, что лишний раз подтверждает то, что генетический дефект Т-лимфоцитов и является основным звеном в патогенезе хронического лимфоцитарного тиреоидита.