Введение к работе
Актуальность проблемы. Микоплазмы (класс Mollicutes) - мельчайшие лишенные клеточной стенки прокариоты, способные к самостоятельному воспроизведению (Razin, Freundt, 1984). Располагая минимальным для самореплицирующихся прокариот размером генома (550-1600 тыс. н.п.), эти микроорганизмы имеют ограниченные биосинтетические возможности, что определяет их зависимость от клеток высших организмов. В процессе эволюции микоплазмы приспособились к сосуществованию с клетками эукариот и являются факультативными паразитами человека, животных и растений (Борхсениус, Чернова, 1989; Maniloff, 1992). Для некоторых микоплазм получены данные о внутриклеточной локализации, тогда как другие микоплазмы считаются внеклеточными паразитами. Однако в обоих случаях микоплазмы находятся в тесном контакте с мембранами клеток хозяина и способны активно вмешиваться в их метаболизм (Чернов и др., 1996; Razin, 1992;).
Большой интерес к этим микроорганизмам обусловлен, с одной стороны, уникальностью их структурной организации, а с другой - диктуется практической необходимостью. Многие микоплазмы - возбудители болезней человека, а также животных и растений (Maniloff, 1992). Микоплазмы - основные контаминанты клеточных культур, в том числе клеток, используемых в биотехнологии для производства вирусных вакцин (Борхсениус и др., 1987; Rottem, Barile, 1993). Контами-нированные вакцины небезопасны, так как в организме человека микоплазмы способны вызывать респираторные, урогенитальные и аутоиммунные заболевания, артрит и иммунодефицит, а также активировать многие вирусы, в том числе онко-генные и ВИЧ (Прозоровский и др., 1995; Lo, 1992). Внутриутробное инфицирование микоплазмами может приводить к различным нарушениям развития плода (Мальцева, 1996; Krause, Taylor-Robinson, 1992). Механизмы патогенеза при пер-систенции микоплазм у человека пока не изучены.
Подавление микоплазменных инфекций представляет проблему. Микоплазмы быстро приобретают резистентность к антибиотикам (Brunner, Laber, 1985). Этот факт исследователи связывают с наличием у микоплазм уникальных механизмов генетической трансформации, определяющих высокую скорость мутационного процесса, а также нестабильность их генома вследствие частых событий реорганизации ДНК по типу "выщепления-встраивания" (Chernov, Chernova, 1994, 1995; Dybvig, Voelker, 1996).
Разрешение проблемы подавления микоплазменных инфекций связывают с изучением молекулярной биологии микоплазм, а также молекулярных основ патогенеза при персистенции этих микроорганизмов (Прозоровский и др., 1995; Dybvig, Voelker, 1996). В изучении основ патогенеза микоплазмозов пока сделаны лишь первые шаги. Исследования механизмов взаимодействия микоплазм с организмом человека сдерживаются не только естественными трудностями контроля молекулярных процессов в системе "паразит-хозяин", но и особенностями биологии микоплазм, а также отсутствием эффективных диагностических средств, позволяющих быстро и достоверно обнаружить, идентифицировать и оценить множественность инфекции (Борхсениус, Чернова, 1989; Baseman, 1996).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение биохимических аспектов патогенеза при персистенции микоплазм у человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Создать эффективные диагностические системы для обнаружения, идентификации и оценки множественности микоплазменных инфекций в любом биологическом материале.
-
Определить биохимические особенности персистенции микоплазм у человека.
-
Выявить особенности структурной организации генома микоплазм, а также характер воздействия микоплазм на генетическую систему клеток человека in vitro.
-
На основании полученных данных представить возможные пути развития хронического инфицирования человека микоплазмами и схемы индуцируемого ими каскада патологических реакций.
Научная новизна работы. Впервые получены данные о биохимических аспектах патогенеза при персистенции микоплазм у человека. В частности, показано, что персистенция у человека различных видов микоплазм может приводить к аналогичным патологическим изменениям в его организме, связанным с развитием иммунной дисфункции, дисбиоза, а также ультрацитопатологией форменных элементов крови, активацией гемокоагуляционного каскада, угнетением реакций антикоагуляции и фибринолиза. Установлено, что персистенция микоплазм у человека сопровождается хроническим окислительным стрессом (активацией реакций перекисного окисления липидов и угнетением ферментов системы антиоксидантний защиты). Высказано предположение, что хронический окислительный стресс может определять механизмы патогенеза у человека при персистенции микоплазм.
Впервые установлено явление реорганизации в генах поверхностных антигенных детерминант у микоплазм в процессе вертикального переноса и персистенции этих микроорганизмов у человека. Предполагается, что реактивная генетическая изменчивость микоплазм может быть существенным фактором, определяющим их персистенцию в организме человека. Выявлена специфичность индуцированных микоплазмами хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови человека. Впервые высказано предположение, что специфичность взаимодействия микоплазм с генетическим аппаратом клеток человека может влиять на механизмы персистенции этих микроорганизмов у человека. Составлены схемы возможных путей развития хронического инфицирования человека микоплазмами и индуцируемого ими каскада патологических реакций.
Научно-пракггическая значимость работы заключается в создании высокоэффективных диагностических проб, позволяющих обнаружить, идентифицировать и оценить множественность микоплазменных инфекций в любом биологическом материале. В настоящее время эти зонды применяются для обнаружения микоплазменных инфекций человека в медицинских центрах Республики Татарстан.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в данной работе, могут быть использованы в исследовательской работе медицинских и биологических учреждений, занимающихся разработкой способов контроля и подавления мультиплексивных инфекций.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983), на IV Международном симпозиуме СССР-ФРГ "Структура генома" (Ленинград, 1985), на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1986), на Всесоюзной конференции "Биологические свойства микоплазм: способы диагностики, профилактики и лечения микоплазмозов" (Киев, 1986), на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия для решения биотехнологических проблем" (Тарту, 1988), 9-ой Всесоюзной конференции "Нуклеазы" (Казань, 1991), Международной конференции по быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1993), Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже 21 века" (Москва, 1994), 1-ом Евразийском конгрессе по генной терапии (Анкара, Турция^ 1995), 8-ом Международном конгрессе по бактериологии и
прикладной микробиологии (Иерусалим, Израиль, 1996), 2-ой Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1996), 5-ой конференции по фитоплазмам (Пекин, Китай, 1996), а также на 7-ом (Вена, Австрия, 1988), 8-ом (Стамбул, Турция, 1990), 9-ом (Эймс, США, 1992), 10-ом (Бордо, Франция, 1994), 11-ом (Орландо, США, 1996) Конгрессах Международного общества микоплазмологов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 82 работы, включая 1 монографию (в соавторстве с С.Н.Борхсениусом), 29 статей в центральных отечественных и зарубежных изданиях, а также 7 авторских свидетельств на изобретения.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН. Экспериментальные результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично, а также совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной генетики, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, теоретическое обобщение получаемых результатов, выводы из работы.
Часть работы по определению биохимических особенностей персистенции микоплазм у человека выполнена в соавторстве с сотрудниками Центра охраны семьи, материнства и детства Республики Татарстан, а также клиники детских болезней им. Е.М.Лепского Казанской медицинской академии. Автор приносит глубокую благодарность всем коллегам, способствовавшим осуществлению данной работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". В работе представлено 6 таблиц и 46 рисунков. Список литературы включает 401 источник.