Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Экстракорпоральные методы в лечении печеночной недостаточности (обзор литературы) 17
1.1 Метаболические нарушения при заболеваниях печени 17
1.2 Использование методов эфферентной терапии в лечении заболеваний печени 26
1.3 Новые технологии и подходы при лечении печеночно-клеточной недостаточности 51
Глава 2 Материалы и методы исследования 57
2.1 Устройство аппарата для экстракорпорального очищения крови «Биоискусственная печень» 57
2.2 Методики и режимы выполнения модельных и клинических исследований 60
2.3 Методика приготовления и хранения цитозоля печени с
микросомальной и митохондриальной фракциями 74
2.4Использованные индикаторные вещества 75
2.5 Биохимические методы исследования 77
2.6 Расчет показателей, характеризующих эффективность диализа 92
2.7 Статистическая обработка 94
Глава 3 Изучение эффективности использования цитозоля печени и альбумина в качестве биоматериалов для аппарата «Биоискусственная печень» в модельном эксперименте
3.1 Экспериментальное изучение эффективности использования цитозоля печени в качестве биоматериала для аппарата «Биоискусственная печень» 95
3.2 Экспериментальное изучение возможности использования альбумина и донорской плазмы в качестве диализирующего раствора для аппарата «Биоискусственная печень» 107
3.3 Сравнительное изучение эффективности альбуминового и цитозольного диализа на низкопоточных диализаторах на аппарате «Биоискусственная печень» в условиях модельного эксперимента 115
3.4 Сравнительное изучение эффективности альбуминового и цитозольного диализа на высокопоточных диализаторах на аппарате «Биоискусственная печень» в условиях модельного эксперимента 127
Глава 4 Клинические исследования терапевтической эффективности метода экстракорпоральной детоксикации и нормализации обменных процессов с использованием метода альбуминового диализа на аппарате «Биоискусственная печень» 134
Глава 5 Сравнительная оценка различных режимов экстракорпоральной детоксикации и коррекции метаболических расстройств на экспериментальном образце аппарата «Биоискусственная печень» (Заключение) 141
5.1 Модельные исследования на аппарате «Биоискусственная печень» 141
5.2 Клинические исследования 151
Выводы 154
Список сокращений и условных обозначений 156
Список литературы
- Использование методов эфферентной терапии в лечении заболеваний печени
- Методики и режимы выполнения модельных и клинических исследований
- Экспериментальное изучение возможности использования альбумина и донорской плазмы в качестве диализирующего раствора для аппарата «Биоискусственная печень»
- Модельные исследования на аппарате «Биоискусственная печень»
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Нарушение
функции печени возникает при различных патологических состояниях: печеночной
недостаточности, ожоговой болезни, радиационных поражениях, вирусных гепатитах и др. –
и сопровождается выраженными метаболическими расстройствами с развитием
токсемического синдрома (Плеханов А. Н., Товаршинов А. И. Современные подходы
к диагностике и лечению печеночной недостаточности (обзор литературы) // Бюллетень
Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии
медицинских наук. 2016. Т. 1. № 4 (110). С. 156–161). Количество пациентов с тяжелым
течением и хроническими формами заболеваний печени, приводящими
к прогрессирующему развитию печеночной недостаточности, постоянно возрастает (Искра А. И., Лепехова С. А. Перспектива использования биотехнологий для коррекции печеночной недостаточности (обзор литературы) // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2014. Вып. № 1 (95). С. 112–119; Blachier M. et al. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data // Journal of hepatology. 2013. Т. 58. № 3. P. 593–608). Использование стандартных терапевтических приемов при лечении печеночной недостаточности не позволяет достичь удовлетворительных результатов, и смертность сохраняется на уровне 80–90% (Tritto G., Davies N. A., Jalan R. Liver replacement therapy // Crit. Care Med. 2012. Vol. 33, № 1. P. 70–79).
Значительная часть методов лечения эндо- и экзогенных интоксикаций у человека основана на методах экстракорпоральной детоксикации (гемодиализ, гемосорбция, плазмоферез и пр.), среди которых особое значение имеют системы типа «вспомогательная искусственная печень» (Рябинин В. Е. Проблемы и перспективы создания экстракорпоральных систем поддержки функционального состояния печени // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61, № 5. С. 545–559). Обеспечивая незаменимые функции печени, эти системы могут поддержать жизнь пациента до пересадки печени или до восстановления функции собственной печени (Кутепов Д. Е. Использование экстракорпоральных методов лечения печеночной недостаточности // Казанский медицинский журнал. 2014. Т. 95, № 1. С. 75–79; Zheng Z. et al. Artificial and bioartificial liver support systems for acute and acute-on-chronic hepatic failure: A meta-analysis and meta-regression // Exp. Ther. Med. 2013. Vol. 6, № 4. P. 929–936). Однако известная ограниченность и недостаточная эффективность этих методов лечения требуют их усовершенствования и разработки новых, патогенетически обоснованных, способов детоксикации и нормализации обменных процессов (Nevens F., Laleman W. Artificial liver support devices as treatment option for liver failure // Clin. Gastroenterol. 2012. Vol. 26, № 1. P. 17–26).
Таким образом, разработка новых и совершенствование существующих методов
экстракорпоральной детоксикации сохраняют свою актуальность. При создании новых
систем экстракорпоральной детоксикации внимание большинства разработчиков
и исследователей сосредоточено, прежде всего, на оценке эффективности и безопасности
разрабатываемого метода. Сами исследования, как правило, ограничены рамками
действующих протоколов доклинических и клинических испытаний. Результатом такого
подхода является недостаток сведений о механизмах достижения терапевтического
эффекта. Учитывая актуальность и сложность проблем, возникающих при создании
экстракорпоральных систем поддержки печени, в настоящее время требуется координация
деятельности специалистов, занимающихся биохимией, клеточной биологией и лечением
печеночной недостаточности, с целью разработки и своевременного внедрения доступных
методов лечения. Теоретической базой, обеспечивающей развитие в этом направлении,
должны быть исследования, которые позволят не только оценить эффективность
и безопасность используемых методов экстракорпоральной очистки крови,
но и детализировать механизмы достижения терапевтического эффекта, что будет способствовать расширению возможностей по созданию принципиально новых подходов в эфферентных методах терапии.
Цель исследования. Установить механизмы возмещения детоксицирующей и метаболической функций печени при использовании цитозольного и альбуминового диализа на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень» в модельном эксперименте и клинических испытаниях.
Задачи исследования:
-
Изучить динамику изменения концентраций аммиака и мочевины в экстракорпоральном контуре аппарата «Биоискусственная печень» в ходе модельного эксперимента при использовании в качестве биодиализирующего раствора цитозоля печени с микросомальной и митохондриальной фракциями.
-
Установить динамику изменения концентраций анилина и пара-аминофенола в экстракорпоральном контуре в ходе модельного эксперимента при использовании в качестве биодиализирующего раствора цитозоля печени с микросомальной и митохондриальной фракциями.
-
Определить динамику изменения концентраций аммиака, салицилата натрия, 2,4-динитрофенола, молекул средней массы и анилина в модельном и диализном растворах при альбуминовом и плазменном диализе в условиях модельного эксперимента на аппарате «Биоискусственная печень».
-
Провести сравнительный анализ эффективности удаления маркерных токсических соединений с помощью альбуминового и цитозольного диализа при использовании низкопоточных и высокопоточных диализаторов на аппарате «Биоискусственная печень» в условиях модельного эксперимента.
-
Оценить эффективность альбуминового диализа на аппарате «Биоискусственная печень» для коррекции метаболических нарушений у пациентов с острой печеночной недостаточностью.
Научная новизна. Впервые охарактеризованы механизмы и эффективность обезвреживания аммиака и анилина на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень» («БИП») при использовании в качестве диализирующего раствора цитозоля печени. Охарактеризованы механизмы и эффективность элиминации различных гидрофильных и гидрофобных веществ на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень» при альбуминовом диализе.
Впервые изучены возможность и эффективность очистки (десорбции) раствора альбумина после проведенного диализа на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень» с применением углеродных гемосорбентов, способствующей повышению акцепторной способности альбумина.
Впервые в условиях модельного эксперимента использован метод диализа с донорской плазмой в качестве диализирующего раствора и показана его эффективность на экспериментальном промышленном образце аппарата «БИП», сравнимая с альбуминовым диализом.
Впервые проведены модельные исследования, позволившие изучить механизмы различных режимов экстракорпоральной детоксикации на аппарате «БИП»: сопоставлены низкопоточный и высокопоточный альбуминовый и цитозольный диализ.
По результатам клинико-лабораторного мониторинга функционального состояния печени получены новые данные о терапевтической эффективности использования 10 %-го раствора альбумина на экспериментальном промышленном образце аппарата «БИП» при лечении больных с острой печеночной недостаточностью (ОПН).
Впервые показана возможность использования лиофилизированного цитозоля печени свиньи после его длительного хранения в качестве диализирующего раствора на аппарате «БИП» для лечения больных с ОПН.
Впервые получены данные о состоянии микросомальной системы цитозоля печени при использовании его в качестве диализирующего раствора на аппарате «БИП» в зависимости от длительности процедуры диализа и сроков хранения цитозоля.
Теоретическая и практическая значимость работы. По результатам модельных
экспериментов установлены механизмы возмещения детоксицирующей и метаболической
функций печени при использовании цитозольного и альбуминового диализа
на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень». Дано экспериментальное обоснование возможности и эффективности использования цитозоля печени, раствора человеческого альбумина и донорской плазмы в качестве диализирующих растворов для экспериментального промышленного образца аппарата «БИП».
Результаты проведенных клинических испытаний аппарата «БИП» свидетельствуют об эффективности его использования при лечении пациентов с печеночной недостаточностью и возможности применения при терапии ОПН в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Полученные клинико-экспериментальные данные являются основой для разработки мультифункциональных аппаратов для экстракорпоральной детоксикации и нормализации обмена веществ.
Методология и методы исследования. Исследование выполнено в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. В работе представлены результаты экспериментального и клинического разделов исследования.
Экспериментальный раздел работы включает в себя результаты, полученные в серии модельных экспериментов на экспериментальном промышленном образце аппарата «Биоискусственная печень». Клинический раздел работы проводили на базе областной клинической больницы г. Челябинска в отделении реанимации и интенсивной терапии (2009–2011 гг.) в соответствии с действующими нормативными документами (ГОСТ Р ИСО 14155-1-2008 Руководство по проведению клинических испытаний медицинских изделий; ГОСТ Р 52379-2005 Национальный стандарт Российской Федерации Надлежащая клиническая практика. М., 2005).
Для достижения цели и решения поставленных задач использовались биохимические, клинико-лабораторные, фармакокинетические и статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту:
-
Возмещение мочевинообразовательной и детоксицирующей функций печени при цитозольном диализе на аппарате «Биоискусственная печень» реализуется за счет ферментов орнитинового цикла и микросомального окисления, а при альбуминовом и плазменном диализе – за счет связывания с белками в диализном контуре аппарата «Биоискусственная печень».
-
Метаболическая активность цитозоля с микросомальной и митохондриальной фракциями выше при использовании низкопоточных диализаторов, а эффективность связывания токсических веществ альбумином выше при использовании высокопоточных диализаторов.
-
Клинические исследования на экспериментальном образце аппарата «Биоискусственная печень» продемонстрировали высокую эффективность альбуминового диализа в коррекции нарушений азотистого, пигментного и углеводного обмена при острой печеночной недостаточности.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора. Степень достоверности полученных результатов диссертации подтверждается их теоретическим анализом, личным участием автора во всех экспериментах, проведенных с помощью современных методик, сертифицированного оборудования и реактивов; актами внедрения результатов работы в учебный процесс и проверки первичной документации; статистической обработкой полученных данных и публикацией материалов диссертации в статьях, докладах на значительном числе научных конференций.
Основные положения работы изложены и представлены на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов – до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ЧГМА «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 2003); II итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию образования ЧелГМА (Челябинск, 2004); Двенадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клеточные и нанотехнологии в биологии и медицине» (Курган, 2007); Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012); I Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013); Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» (Москва, 2014); Российской научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и перспективы» (Казань, 2015).
В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором
на кафедре биохимии Южно-Уральского государственного медицинского университета.
Личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач (совместно
с профессором, д-ром биол. наук В. Е. Рябининым), разработке экспериментального образца
аппарата «БИП», его режимов и характеристик детоксикационных модулей (совместно
с профессором, д-ром биол. наук В. Е. Рябининым, В. И. Супруном, А. Г. Томиловым,
А. П. Егоровым, В. А. Куксой), проведении модельных экспериментов на аппарате «БИП»
(совместно с профессором, д-ром биол. наук В. Е. Рябининым, канд. биол. наук
С. И. Гробовым), проведении обследования пациентов и сборе первичного материала
(совместно с профессором, д-ром биол. наук В. Е. Рябининым, д-ром мед. наук
Е. Л. Куренковым, канд. мед. наук А. Ю. Тюриным, канд. мед. наук И. И. Долматовым),
проведении клинических исследований на аппарате «БИП» (совместно с профессором, д-
ром биол. наук В. Е. Рябининым, канд. мед. наук А. Ю. Тюриным), выполнении
лабораторного этапа исследований (совместно с канд. биол. наук С. А. Пушкаревым, канд.
мед. наук Д. А. Козочкиным, П. Н. Попковым, С. Н. Краснопеевой, А. М. Малышевой,
А. А. Стасюком, А. Ю. Дубасовым, Л. Ю. Сухановой, Р. И. Мухаметжановой,
М. А. Соколовым), обработке, анализе и обобщении полученных результатов,
статистической обработке первичных данных, написании и оформлении рукописи диссертации.
Работа выполнена при поддержке:
-
гранта федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. «Разработка и создание мультифункционального аппарата «Биоискусственная печень» с биоинженерными 3D клеточными конструкциями» (соглашение о предоставлении гранта № 8275 от 23.10.2012);
-
программы «Старт 2010» Фонда содействия развитию малых предприятий в научно-технической сфере, проект «Разработка конструктивных и эксплуатационных параметров многофункционального аппарата для очищения крови с экспериментальным изучением эффективности его функционирования» (государственный контракт № 7564р/10391 от 26.02.2010);
-
гранта Российского гуманитарного научного фонда «Новые системы искусственного жизнеобеспечения и клеточные технологии в оказании медицинской помощи населению Челябинской области» (2009–2010 гг.).
Внедрение результатов исследования в практику. Материалы диссертационной
работы используются в учебном процессе кафедр биологической химии (биохимии), химии
фармацевтического факультета Южно-Уральского государственного медицинского
университета; кафедр биологической химии, общей хирургии Башкирского
государственного медицинского университета. Материалы диссертационной работы используются в практической деятельности ГБУЗ «Областная клиническая больница № 3» (г. Челябинск).
Публикации. Соискатель имеет 27 опубликованных работ, из них по теме диссертации – 21 научная работа общим объемом 53 страницы, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискатель имеет 1 патент на полезную модель. 10 научных работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований и обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 207 источников: 92 – на русском языке и 115 – на иностранных. Работа содержит 25 таблиц, 10 рисунков.
Использование методов эфферентной терапии в лечении заболеваний печени
Принцип действия небиологических (искусственных) систем поддержки печени заключается в использовании экстракорпоральных приемов очистки крови. «Технология поддерживающей терапии при заболеваниях печени развивается по пути создания методов для поддержания функции оставшейся массы гепатоцитов за счет замещения различных специфических функций печени, поэтому существенную роль в решении этой проблемы играет экстракорпоральная гемокоррекция» [2].
Использование гемодиализа, гемофильтрации, плазмафереза, гемо-или плазмосорбции является практически безопасным для больных с ПН, но не достаточно эффективным, т.к. обладают низкой способностью к удалению связанных с альбумином токсинов, билирубина, желчных кислот, ароматических аминокислот, средне- и короткоцепочечных жирных кислот, в большом количестве накапливающихся в организме при поражении печени [66, 161].
Описание первого клинического применения плазмафереза у больных с печеночной комой описано в обзоре Т.Чанга [107]. Большой спектр удаляемых токсических веществ делает этот метод более эффективным, чем гемодиализ, приводит к уменьшению степени печеночной энцефалопатии и снижению интоксикации [198]. По результатам исследования Larsen F.S. и соавт., выживаемость в группе больных, которым проводили плазмаферез, составила 58,7%, против контрольной группы, в которой проводилось стандартное медикаментозное лечение с выживаемостью 47,8% [144]. Несмотря на широкое клиническое применение, механизм лечебного эффекта плазмафереза остается невыясненным [42]. Установлено, что при лечении ОПН методом плазмафереза замещение изъятой плазмы альбумином или донорской плазмой может тормозить регенерацию собственной пораженной печени [149]. Данный метод требует достаточного количества донорской плазмы, что повышает риск возникновения иммунологического ответа организма и возможности инфицирования пациента вирусами гепатитов В и С, иммунодефицита человека, герпеса, цитомегаловируса [198].
Применение гемодиализа у пациентов с заболеваниями печени (первые клинические исследования) практически не снизило летальность, что было связано с низкой проницаемостью мембран, не способных пропускать молекулы средней массы и связанные с альбумином вещества [137]. Использование новых типов полиакрилнитрильных диализных мембран с высокой проницаемостью для молекул средней массы не привело к снижению летальности в клиническом исследовании Opolon P. с соавторами [163].
Метод гемофильтрации был использован для лечения больных с ПН, в котором удаление токсических веществ из организма происходит путем конвекции через мембраны с высокой гидравлической проницаемостью (хайфлакс-мембраны). Выживаемость составила 60% [177], значительным ограничением этого метода является необходимость компенсировать жидкость, удаляемую в ходе сеанса (93-98%).
Метод гемодиафильтрации сочетает стандартный гемодиализ и гемофильтрацию и превосходит по эффективности стандартный гемодиализ за счет увеличения объема удаляемых веществ за счет фильтрационного и конвекционного переноса с помощью специальных диализаторов с высоким коэффициентом ультрафильтрации. Несмотря на увеличение клиренса и улучшения некоторых клинических показателей многие исследователи отмечают опасность возникновения обратной фильтрации, которая может привести к попаданию нестерильной диализирующей жидкости в кровь пациента. Также применение высокопроницаемых мембран приводит к потерям витаминов, гормонов, аминокислот и других веществ, необходимых для жизнедеятельности организма. Последствия таких потерь еще недостаточно изучены [28].
Использование неспецифических сорбентов (уголь, анионообменные смолы) при прямом контакте с кровью или плазмой приводит к значительному эффективному удалению токсических молекул. Но эта процедура имеет ряд серьезных осложнений и может сопровождаться развитием биологической несовместимости. Также ограничением является отсутствие селективности при адсорбции. Некоторые исследователи наблюдали снижение уровня фибриногена, активацию системы комплемента, что приводило к развитию системного воспалительного ответа [188, 202]. Кроме этого, прямой контакт адсорбентов с плазмой приводил к удалению фактора роста гепатоцитов и ряда гормонов, таких как гормон роста, трииодтиронин, паратгормон, стероидные гормоны и инсулин [202]. Для уменьшения отрицательных эффектов прямого контакта белков плазмы с сорбентами, было предложено использование синтетических мембран. Однако применение низкопористой ацетилцеллюлозной мембраны не позволяло удалять связанные с альбумином токсические молекулы (уровень билирубина даже увеличивался) [141]. При использовании мембран с большим размером пор, пропускающих молекулы альбумина, но не пропускающих более крупные белки плазмы (иммуноглобулины класса М), из кровотока удалялись иммуноглобулины класса G, фибриноген, липопротеиды, снижался билирубин и при этом наблюдали уменьшение проявления энцефалопатии [141].
Методики и режимы выполнения модельных и клинических исследований
Работа состоит из двух разделов: экспериментального и клинического. Экспериментальный раздел включает в себя ряд модельных экспериментов, проведенных на аппарате «БИП» с использованием различных режимов диализа и различных биоматериалов в качестве диализирующих жидкостей. В клиническом разделе работы была оценена эффективность альбуминового диализа как эфферентного метода терапии острой печеночной недостаточности на аппарате «БИП».
Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГБОУ ВО ЮУГМУ (2001 – 20013 гг.) и включает в себя результаты, полученные в серии модельных экспериментов на аппарате «БИП», с использованием диализаторов с разной проницаемостью мембран и различных биоматериалов в качестве диализирующих жидкостей. В связи с этим были выделены 7 серий модельных экспериментов: 1. Альбуминовый диализ с использованием углеродных сорбентов. 2. Диализ с использованием донорской плазмы в качестве диализирующий раствора. 3. Альбуминовый диализ с использованием низкопоточных диализаторов. 4. Альбуминовый диализ с использованием высокопоточных диализаторов. 5. Цитозольный диализ с использованием низкопоточных диализаторов. 6. Цитозольный диализ с использованием высокопоточных диализаторов. 7. Исследование биотрансформирующей и детоксицирующей способности цитозоля печени в экстракорпоральном контуре. Отбор проб модельного раствора (МР) и диализирующего раствора (ДР) осуществляли через определенные промежутки времени для выявления динамики изменения концентраций веществ эндогенного и экзогенного происхождения.
Все режимы проведенных экспериментов приведены в сводной таблице 2.1. Характеристики используемых диализаторов представлены в таблице 2.2. Принципиальная схема проведения модельных исследований представлена на Рис. 2.3. Методика проведения альбуминового диализа в модельных экспериментах с использованием 10% раствора альбумина в качестве диализирующего раствора и последующей его очистки на углеродном сорбенте
Для оценки эффективности связывающей способности донорского альбумина при применении в качестве диализирующего раствора на аппарате «БИП» в модельном растворе были созданы высокие исходные концентрации салицилата натрия, 2,4-ДНФ, анилина и аммиака для моделирования эндогенной и экзогенной интоксикации (таблица 2.1). 10% раствор альбумина пропускали через гемодиализатор по разъемам для диализной жидкости по принципу рециркуляции. Одновременно с этим проводили перфузию модельного раствора, который подавали также по принципу рециркуляции через разъемы гемодиализатора для крови. Контакт МР с 10% раствором альбумина осуществляли через полупроницаемую мембрану гемодиализатора Hemoflow F3, Fresenius (табл. 2.2) в течение 3 часов при скоростях перфузии МР и альбумина 150 мл/мин и температуре 37C. Определение уровней аммиака, анилина, молекул средней массы, 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ), салицилата натрия проводили по методам, представленным в настоящей главе «Материалы и методы».
На следующем этапе исследования использованный в эксперименте альбумин пропускали через углеродный гемосорбент СКН-1 (Гемопласт, Россия) в течение 3 часов. При этом отслеживали изменение содержания вышеперечисленных индикаторных веществ через определенные промежутки времени для анализа степени очистки альбумина и возможности более эффективного использования его в экстракорпоральном замкнутом контуре аппарата «БИП».
Экспериментальное изучение возможности использования альбумина и донорской плазмы в качестве диализирующего раствора для аппарата «Биоискусственная печень»
Ход определения, реактивы. При определении N-деметилазной активности цитозоля инкубационная смесь содержала: трис(гидроксиметил)аминометан 80 mM, НАДФН 3,0 mM, Mg2+ 16 mM и 6,0 mM ДМА и порядка 1,5 г/мл белка микросом. Опытные и контрольные пробы инкубировали 20 мин при 37C термостате ТС-80 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия). Реакция останавливали добавлением 15 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После центрифугирования при 7000 g в течение 10 мин определение образовавшегося формальдегида проводили с использованием реактива Наша (2М ацетата аммония, 0,05 М ледяной уксусной кислоты, 0,02 М ацетилацетон). Фотометрирование проб проводили на спектрофотометре СФ-56 при 412 нм в кювете шириной 10,00 мм. Параллельно ставили холостой опыт, где НАДФН добавляли после остановки реакции. Расчт активности ферментной системы вели, исходя из известной величины молярного коэффициента экстинкции продукта взаимодействия формальдегида с ацетилацетоном, по конечной формуле: A = D 1000 Vинк./1,25 m т [нмоль мг -1 мин -1], где D - разность оптических плотностей исследуемой пробы и холостого опыта, Vинк. - объм инкубационной смеси [мл], m - масса внеснного в инкубационную смесь микросомального белка [мг], т - время инкубации [мин]. 2.5.1.2 Определение содержания цитохромов P-450 и b5 [34] Определение содержания цитохромов b5 и P-450 в выделенной микросомальной фракции цитозоля проводили по методике Карузиной И.И. и Арчакова А.И. на двухлучевом спектрофотометре СФ-18.
Принцип метода. Определение содержания цитохрома b5 основано на измерении разницы в поглощении окисленной и восстановленной форм гемопротеида, а цитохрома P-450 – на измерении величины поглощения комплекса восстановленного цитохрома P-450 с окисью углерода (СО) при 450 нм.
Ход определения, реактивы. Измеряли оптическую плотность суспензии микросом, содержащей цитохром b5 в восстановленной форме, против контроля в диапазоне длин волн 400-500 нм. Восстановление проводили, добавляя несколько кристаллов дитионита натрия. Контролем служила суспензия микросом без добавления дитионита. Также измеряли оптическую плотность суспензии микросом, насыщенной окисью углерода (CO) с добавкой дитионита натрия (восстановленный комплекс: цитохром P-450 – CO) против контроля, представляющего собой суспензию микросом с добавкой дитионита (восстановленная форма цитохрома P-450). Расчты содержания цитохромов производили на количество белка микросом в суспензии, которое определяли методом Бенедикта [37], и исходя из величин разности экстинкций в максимуме и минимуме поглощения: D428/408 (для цитохрома b5 max 428 нм и min 408 нм) и D450/490 (для цитохрома P-450 max 450 нм и min 490 нм) по известным величинам разности молярных коэффициентов экстинкции измеряемых форм цитохромов b5 и P-450 относительно их форм, находящихся в контрольных пробах, равных соответственно 164 . 103 (л.моль-1.см-1) и 93 . 103 (л.моль-1.см-1) [34]. 2.5.1.3 Определение активности НАДФН-оксидазы, НАДФН:2,6 дихлорфенол-индофенол-редуктазы
Определение активности НАДФН-оксидазы, НАДФН:2,6 дихлорфенол- индофенол-редуктазы проводили по общепринятым методикам Карузиной И.И. и Арчакова А.И. [34]. Принцип метода. Принцип метода основан на определении изменения поглощения акцепторов электронов (2,6 дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ)) при переходе их из окисленной формы в восстановленную.
Принцип метода. Скорость п-гидроксилирования анилина определяется по количеству образовавшегося п-аминофенола. Реакция протекает на молекуле цитохрома Р-450 в присутствии НАДФН и кислорода. Образующийся п-аминофенол связывается с фенолом и в присутствии Na2CO3 образует окрашенный в синий цвет индофенольный комплекс.
Ход определения, реактивы. Реакцию начинали добавлением анилина до 3мМ конечной концентрации. Реакцию останавливали добавлением к 1 мл цитозоля или модельного раствора 0,5 мл 15% раствора ТХУ. Затем пробу центрифугировали при 3500 g в течение 10 мин и отбирали 1 мл надосадочной жидкости, в которую добавляли 0,5 мл 10% раствора Na2CO3и 1,5 мл 2% раствора фенола в 0,2 М растворе NaOH. Для развития окраски пробы выдерживали в термостате при 37С в течение 30 мин. Оптическую плотность измеряли при 630 нм на СФ-56 в кювете шириной 10,00 мм. Параллельно ставили холостой опыт, в котором использовали цитозоль без добавления анилина. Содержание п аминофенола рассчитывали по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору п-аминофенола.
Модельные исследования на аппарате «Биоискусственная печень»
Острая печеночная недостаточность – тяжелое осложнение, возникающее вследствие массивной гибели гепатоцитов, приводящее к быстропрогрессирующей энцефалопатии, полиорганной недостаточности и тяжелой коагулопатии, сопровождающееся высокой летальностью (до 90%). В последнее время в России растет количество больных острым токсическим гепатитом, вызванным употреблением суррогатных алкогольных напитков на основе денатурированного спирта. Также часты случаи развития ОПН вследствие передозировки парацетамола, отравления грибами и гепатотропными ядами, осложнений ингаляционного наркоза. Тяжесть состояния таких больных определяется развитием печеночно-клеточной недостаточности (ПКН), холестатического и цитолитического синдромов.
Единственным эффективным методом лечения ОПН считается трансплантация печени. Успехи хирургических техник, послеоперационного ведения и иммунодепрессивной терапии позволяют достигнуть выживаемости от 65 до 90% больных в течение 1 года [20, 85, 105]. Однако трансплантация печени является дорогостоящей процедурой с целым рядом ограничений [130].
В последние годы были достигнуты большие успехи по разработке экстракорпоральных систем поддержки печени, которые применяются для подготовки к трансплантации или для поддержания жизненных функций организма в период регенерации собственной печени [174]. Учет преимуществ и недостатков различных методов клеточной и эфферентной терапии [70, 66, 67] позволяет не только оценить предшествующий опыт при лечении заболеваний печени, но и подойти к разработке новых, более эффективных и безопасных методов терапии.
В настоящем клиническом исследовании была оценена эффективность альбуминового диализа как эфферентного метода терапии острой печеночной недостаточности. Методология данного этапа работы описана в Главе 2, раздел 2.2.2.1. В исследовании принимали участие 25 пациентов с диагнозом ОПН различной этиологии (Табл.2.3).
Все изучаемые биохимические показатели, полученные до и непосредственно после сеансов альбуминового диализа, отражены в таблице 4.1. После однократной процедуры альбуминового диализа активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы снижались статистически значимо (Табл. 4.1). Также статистически значимо уменьшались уровни общего и прямого билирубина. Наблюдалось статистически значимое снижение концентрации аммиака и повышение уровня глюкозы в крови (Табл. 4.1). Проведенное исследование выявило существенные особенности в способности альбуминового диализа восстанавливать нарушенные функции печени. У значительной части пациентов он оказывал четкое положительное влияние на показатели цитолиза и восстановление гепатобилиарного транспорта. Цитолиз, являясь одним из основных показателей активности патологического процесса в печени, характеризует совокупность всех изменений гепатоцитов в их клиническом, биохимическом и морфологическом проявлениях. Синдром возникает вследствие нарушения структуры гепатоцитов и характеризуется прогрессирующим течением, вплоть до некроза клеток печени. По этой же причине при ОПН нарушается экскреция прямого билирубина в желчные капилляры, поэтому он попадает непосредственно в кровь, где его содержание значительно увеличивается. Кроме того, резко снижается способность печени синтезировать билирубинглюкурониды, вследствие этого концентрация непрямого билирубина в сыворотке крови также значительно увеличивается. Таким образом, достоверное снижение активностей трансаминаз, щелочной фосфатазы и содержания билирубина после процедуры альбуминового диализа свидетельствует об эффективности данного метода. Массивная деструкция гепатоцитов определяет не только степень и глубину повреждения печени, но и нарушение ее синтетической функции. Показатели белок-синтетической функции печени (уровни альбумина и общего белка) исходно находились в пределах нормы и в течение процедуры диализа не изменялись. Продолжительность периода полураспада альбуминов составляет 20 суток, поэтому быстрая реакция альбуминов на развитие острой печеночной недостаточности отсутствует [44]. В связи с тем, что при ОПН выраженные нарушения претерпевает углеводный обмен (гипогликемия и активизация анаэробного гликолиза) [79], обращает на себя внимание статистически значимое повышение уровня глюкозы после альбуминовой терапии, что свидетельствует о восстановлении синтетической функции печени. Ключевым клинико-лабораторным показателем, характеризующим тяжесть ОПН, является концентрация аммиака в сыворотке крови. Гипераммониемия занимает центральное место в токсической теории развития печеночной энцефалопатии, и в целом ряде исследований показана прямая корреляция между уровнем аммиака и тяжестью состояния пациентов [102, 122, 129, 167]. Процедура альбуминового диализа приводит к статистически значимому снижению уровня аммиака за счет хорошей диализируемости последнего и, возможно, за счет активизации орнитинового цикла [79], хотя статистически значимого повышения содержания мочевины в данном исследовании не наблюдали. Очевидно, это связано с переходом мочевины в диализный контур по градиенту концентрации в ходе процедуры, т.к. мочевина является хорошо диализируемым растворимым соединением. У всех пациентов после сеанса уменьшался уровень аммиака и отмечалась стабилизация состояния.