Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование метода гипотермии б экспериментальной биологин и практической медицине основано v.a снижении низкой температурой общей метаболической активности организма, что защищает органы и ткани от гипсксив (Петров, Гус-лер, 1961; Мешалкин, Верещагин, 1985). Вместе с тем, карус:.-;;-.ь
ГОМОЙОТерМНИ СОПРЯНЄЙО С Б03ЯИКН0ЕЄКИЄМ ПаТОЛОГИЧеСКЙХ СдЬКГОЬ
в физиологических, физико-химических процессах.
Несмотря на то, что вопросы влияния на организм обгдего охлаждения изучены довольно подробно (Петров, Гублер, 19ЄI; Май-страх, 1975; Волколаков, Лацис, 1978; Тимофеев, IS83; Ьмирбеков, Львова, 1985; Сумбатов, 1985 и др.), молекулярные механизм}, ле-аащае в основе развитая гипотермия, до настоящего времени окончательно не выяснены.
В современных представлениях о механизмах влияния гипотермии на организм центральное место отводится нарушению структурных компонентов мембран (Белоус, Бондаренко, 1982; Тимофеев, 1983; Шепелев и др., 1984; Эмирбеков, Львова, 1965; Гулевекий н др., 1988). Однако мембраны при низкой температуре изучены либо в модельных опытах, либо в условиях глубокого замораживания.
Для исследования влияния гипотермия на структуру мембран наиболее удобным объектом являются эритроцита (Черяицккй, Воробей, 1981; Леонова, 1987). Одним из чувствительных тестов, характеризующий изменение структура мембран в целом является устойчивость эритроцитов к кислотному гемолатику. О степени стабильности эргтроцитаряой мембраны н уровне вкутрпсосудистогс ге-иолиза иожяо судить такне по концентрации свободного гемоглобина в плазме крови.
При анализе влияния гипотермии на характер бвлок-лкпидкых взаа.»аздействий в иеибраяе гвжное значение имеет изучение интегральных мембранных белков. Одним из такьх белков-ферментов является ацетилхоляяэстераза (АХЭ). Активность фермента в мембро-пах в значительной степени зависит от состава лишщюго кикро-окруаеяая ( Heger, 1979; BloJ et al., 1979; ві ?rancesco» Ътод-beck, 1981). Исследование АХЭ важно тем, что являясь интегральным белком, она слузеит как-бы зондом, характеризующий состояние всей
мембраны. Кроме того, АХЭ обладает сложным механизмом регуляции активности, особенности которого возможно, раскроются в экстремальной ситуации.
Сценка как патологических, так и адаптивных изменений, про-исходящих у гомойотермних животных при гипотермии, возмоака ллшь б сравнении с данными, полученными у аимоспящях ясивотных» Зимняя спячка яваяется уникальной моделью природной адаптация к низкой температуре тела, которая обеспечивается специальными механизмами метаболизма клеток (Aloia, ISS0; Крепе, 1981; Wang , IS85; Ьмирсеков, Львова, 1985; Хочачка, Сомеро, 1988). Полученные фундаментальные данные прл изучении механизмов зимней спячки могут Сыть положены в основу разработки методов создания искусственно пониженной жизнедеятельности, управляемой естественными резервными процессами регуляции. ~\
Цель и задачи работы. Цель исследованля состояла в сравнительном изучении стабильности эритроцитов и активности АХЭ мембран эритроцитов у крыс при глубокой гипотермии и у сусликов в динамике зимней спячка и пробуждения.
Основное внимание было направлено на решение следующих конкретных задач:
1. Исследование УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ К КИСЛОТНОМУ ГЄІ50-
лмтику а уровня свободного гемоглобина в плазме крови крыс при кратковременной в пролонгированной 2 ч гипотермии 20С, а также через сутки поело самосогревания.
-
Изучение устойчивости эритроцитов сусликов к кислотному гешдатяку в динамике зимней спячки и пробуздения.
-
Аяалаз влияния гипотермии на активность, кинетические параметры и температурную зависимость активности АХЭ мембран эратроцитов крыс дри гипотермии 20С и при её пролонгирования 2 ч.
-
Исследование активности, кинетических параметров а температурной зависимости активности АХЭ мембран эритроцитов сусликов з динамике зимней спячки п пробуждения.
Qcw?m;e положеная, вуносиизе на зениту,;
I. Глубг.кЕл гипотермия (20С) крыс приводит к дестабилизации мембран эритроцитов, оцениваемой по снижении резистентности эритрецзгев к кислотному гемоезткку и Еовыаенпэ урозля свободного гемоглобина в плазме крот.
-
У eye-яков по морэ удлинения срока зимне;: спячки повышается устойчивость эритроцитов к кислотному гемолитику. На ІОКЄ максимально сниженной реакции эрвтрона, увеличение резистентності! направлено на удлинение срока жизни эритроцитов при глубокой зимней спячке.
-
Анализ влияния низкой температуры тола на активность, кинетические параметры и температурную зависимость активности АХЭ мембран эритроцитов крыс указывает, что пролонгированная 2 ч гипотермия 20С угнетает активность фермента в большей степени, чем кратковременная гипотермия 20С.
4. При зимней спячке исследованные параметры АХЭ мембран эритроцитов сусликов коррелирует с функциональным состоянием животного, продолжительностью спячки и температурой тала кивот-кого.
Научная новизна. Настоящая работа является первым систематический исследованием, направленным на сравнительное изучение стабильности мембран эритроцитов и активности мембракосвязаяяых ферментов при гипотеркги и зимней спячке.
Установлено, что при общей глубокой гипотермии снижается резистентность эритроцитов к кислотному гемолитику а ПОВКЕЄНИЄ уровня свободного гемоглобина в сыворотке крови крыс, что свидетельствует о дестабилизации мембран эритроцитов.
Впервые изучена устойчивость эритроцитов сусликов к кислотному гемолятику как в середине непрерывного, периода спячки, так а прз спонтанном пробуждении (бауты), а танке Ера различной длительности спячки. Полученные данные свидетельствуют О ПОВЫГбНШ! резистентности эритроцитов сусликов при углублений зимней спячка и постепенном ее снижения перед окончательным пробужден::;?:,;.
Получен ряд новых экспериментальных данных о влиянии гипотермии 20С на мембранную АХЭ эритроцитов крыс: снижение реальной активности, полное торможение активности при высоких концентрациях субстрата, снижение VQ и повышение К„. , возрастание энергии активации. Обнаружено, что пролонгированная 2 ч гипотермия 20С, в отличие от кратковременной гипотермии, приводит к существенному угнетешпо АХЭ.
Автором «оказано, что у сусликов изменение активности, кинетических параметров,температурной зависимости активносте АХ5
мембран эритроцитов связано с глубиной и длительностью спячки.
Чоучпо-прзкткческое значение работы. Проведенные исследовался ааят нову» информацию об изменениях в мембране эритроцитов up:; г:он:-.:г.ении температуры тела, способствующая расширению наших зкппкЯ о механизмах патогенеза и адаптации гипотермии. Результаты рпсотн могут быть использованы для разработки рациональных ;-*р коррекции последствий принудительной гипотермии.
исследование резистентности эритроцитов, уровня свободного :;л.\:с глобина в плазме крови, активности АХЭ мембран эритроцитов ;.:л-і'т Лить использованы как тест для оценки глубины гипотерш-"іской патологии, также для отбора и определения эффективности протекторных веществ при этом. _
T.-va диссертации является составной частью научно-исследо-кательскод работы Дагестанского госуниверситета, выполняемой в па:,.:,-ах Общесоюзной программы ГКНТ СССР 0.69.14 и Координационного план-ч АН СССР 2.28.4.7.5 и 2.28.4.7.6. Материалы диссертации используются в ВДР кафедры биохимии и биофизики и проблемной лаборатории яейрохимии ДГУ и при чтении спецкурсов "Сравнительная биохимия" и "Биохимия животных".
Апробация работа. Материалы диссертационной работы долояе-ны на итоговых научных конференциях ДГУ (Махачкала, 1987-1989), научно-практической конференции "Механизмы интеграции биологических систем. Проблемы адаптации" (Ставрополь, 1989), Объединенной научной конференции молодых ученых, специалистов и студентов "Медицинская наука- практическому здравоохранению".(Махачкала, 1990), 6-ой школе-семинаре "Механззкы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды" (Ростов-на-Дону, 1730), Всесоюзном симпозиуме "Механизмы зимней спячки" (Махач-ла;.а", I3SC), совместном заседании кафедры биохимии и биофизики г Пробле;,-доЛ лаборатории нейрохимки Дагестанского университета С!ас.хач::ала, IS9I),
Пус лпт'атмя результатов исследования. По теме диссертации спуС ликовало 5 работ, 2 статьи находятся в печати.
Структур .і' оСъё).- оасотн. Диссертация нз-ютхкз на 131 страницах 'лэлпнкеппсного текстг и состоит из екєдєкия, обзорз лптг-ратуры, описания катериьлов к методов исследования, рог'.ультатог собственных исследований л их обсуждения, заключения і: пт.сдог.
Работа содер-ит 24 таблица, 13 рисунков, список псполізсга;;-нсй литературы включает 1*70 нгиг/енораниД, в то;/ числе 70 иностранных.
MATERIAL К ;>Т0ДЫ ИССЛЕДСЕАІГ/Л
Эксперименты выполнены на 140 половозрелых беспородных белых крысах-сащах в на 142 малых кавказских сусликах Cuteiiua pygam-lus Pallas), отловленных в низкекной части Дагестана.
Гипотермию крыс вызывала е холодових какєрах (Абдуллзев, 1980), в рубашке которой циркулирует вода с температурой 4-5С. Температуру тела животного снижали до 20-1ЭС равномерно в течение 60 гаа. В отдельных сериях опытов достигнутый уровень гипотермии поддерживали в течение 2 ч. В отдельных случаях, после пролонгированной 2 ч гипотермии 20С, крыс переносили б клетки с комнатной температуро"" зля самосогресания до 37С. Zhbothkx брали в опыт через одни сутки после самосогревания.
Для исследования состояния зимней спячки отловленных в г.'.зе-кше сусликов содержали! в условиях вивария до глубокой оседл, -В конце октября зверьков помещали в индивидуальные тетки, к переносили в темную комнату с температурой 5-6С. Исследования проводили при I- а 3-месячной заклей спячке, перед пссСуг^енгс?'. досле 6-та нес. спячка и через 10 дней после окончательного пробуждения от длительной (6 мес) ЗЯ-ЩіЄЙ спячки.
Известно, что в течение всего периода зимней спячки суслдк*: систематически пробуждаются через катлне 10-15 дней ('.'-зпд ,TS5; КадаСухов, IS85). Основываясь ка литературных дзн.;нх и о-е::х собственных наблюдениях не исследовал.* --ивотнкх р. с^г-гге *-:-_— равного цикла спячки сусликов, находящихся в спччг.с- 3 і-.'.:-.. ї.с-.ґ.;. — девала сусликов после их спонтанного просу^дения,, Е гс'Ч^т:--контроля использовали бодрствугадах в летний период СУСЛУГОЬ.
Еавотных, всох исследуемых групп, заоивсла декапптыд.ей. Свободно вытекающую кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом [цитрат натрия влл гепарин). Определение кислотной резистентное-
ти эритроцитов проводили по методу И.А.Терскова и И.И.Гительзо-
на (1957) с использованием 0,004 н соляной кислота. Уровень сво
бодного гемоглобина в плазме крови определяли по реакции с бен
зидином (Кассирский, 1970). Тени эритроцитов получали с помощью
г^поослютического гемолиза по методу АЛЛ.Казенова и др. (1984).
Акткеиость А1Э в мембранах эритроцитов определяли по методу Элл-
мана (silmaa et al. , IS6I) в модификации №.Н.1«аслово;і и др.
(І97Є). В качестве субстрата использовали ацетилтиохолин иодид
г концентрации 0,5 ммоля. Зависимость активности АХЗ от концен
трации субстрата исследовали при S концентрациях ацетилтиохолияа
ксдида в интервале 0,005-4,4 мыоля. Определяла температурную.зави
симость активности фермента при инкубации проб в интервале тем
ператур от- 5 до 37С, через калдые 5С. Активность АХЭ выражали
в іу.кмг.лях АТХ/мг белка/ч. ^--..
Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке по методу малой выборки (Кокукин, 1975),