Введение к работе
Актуальность темы. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов обнаружены в тканях животных, растений и в микроорганизмах (Мосолов, 1971;, 1983; 1988; Ryan, 1973; 1981; Laskowski, Kato, 1980; Flichardson, 1977; Мосолов,; Валуева, Мосолов, 1995). Общим свойством этих молекул является способность образовывать с ферментами устойчивые комплексы что приводит к обратимому подавлению протеолитической активности Широкое распространение ингибиторов в живой природе свидетельствует' что подавление протеолптичесекой активности этими молекулами является' универсальным и весьма эффективным способом регуляции метаболизма v живых организмов Исследования проведенные наЖивотных и чеювеке
физиолог,ичїког^ГІг^^І^^^г^^^ПТ^^^
?OhS sTito f?85- БугаГі986 Хоме^ко 1990^ Проворотов Семёнкова
lSuFracois,'VeroniqueJohn, 1997* "роворотов , Семёнкова,
Несмотря на определенные успехи в изучении структуры, физико-химических свойств, механизмов взаимодействия с ферментами, биологическая роль ингибиторов остается малоизученной Предполагается, что они принимают участие в регуляции многих биохимических и физиологи-ческих процессов в онтогенезе. Эти молекулы также могут участвовать в формировании защитных реакций растений при действии патогенных микроорганизмов и вредных насекомых. Однако, сведения о физиологической роли ингибиторов протеиназ пока еще немногочисленны и представ-ления об этом в значительной степени имеют предположительный характер Не изучен вопрос об участии ингибиторов протеиназ в формировании гомеостатастических реакций у растений т е их способносги противостоятиіменения*"и сохранятьдинамическое постоянство состава и свойств при действии различных Галоповсреды ВэтоГ^правлении вгеьмавГжныеSСмогли бы да^ссТедования IvZZowиZZl лярной гет"рогешюсти ^Т^шЛуТ^^2^Ышо1 растении
чем m3^ель«ие^мы Э?о поз^оГлобыучить ценГ^
манию Тфизимо^
литеоатуРІ^практически иtcvtct^
литературе практически отс^ствуютэкс^^ данные о взаи-
^поопганиГмами Ема важным индуцировать активность ингибиторов протеиназ в тканях растений. Ис-
модействии протеиназ и^ ингибитопов в оастенияГп^
патогенными миіпоопганиГмами EL ва Гтіопети^ом ГппГ
тическом плаГпре^"
иГибиторовпротеиназ вссоздании гУрозисного сГстояни у растений В
следования в это,^Гаправлении позволят Р^работать принципиально новые подходы к созданию эффективных защитных препаратов, активирующих процессы формирования признака устойчивости у растений. Соответственно, участие ингибиторов протеиназ в формировании
гомеостатистических реакций нами рассматривается на различных модельных сисгемах: гетерозис, патогенез у устойчивых и восприимчивых форм растений, в частности при поражении грибными возбудителями, а также при изменении условий произрастания, действии на растения физиологически активных соединений.
Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению закономерностей взаимодействия протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов при различных физиологических состояниях растений и оценке значения белковых ингибиторов в формировании защитных реакций, соответственно, нами были поставлены следующие задачи:
разработка метода определения активности ингибиторов, находящихся в составе комплекса "фермент-ингибитор";
разработка метода определения активности желатингидролизующих протеин» w их ингибиторов;
- изучение активности внеклеточных и мицелиальных протеиназ
патогенных грибов Fusarium и Helminthosporium;
- исследование молекулярной множественности, относительной активности
ингибиторов трипсина, химотрипсина, ингибиторов протеиназ патогенных
грибов в семенах и вегетативных органах растений;
- изучение молекулярной множественности и относительной активности
протеиназ и их ингибиторов у гетерозисных гибридов кукурузы;
- изучение активности протеиназ и их ингибиторов в тканях
восприимчивых и устойчивых сортов растений при заражении их
патогенными грибами;
- изучение влияния фунгицидов, фитотоксичных метаболитов патогенных
грибов, защитных препаратов биологического происхождения на
активность протеиназ и их ингибиторов в растениях;
Научная новизна работы. Получены новые данные о связи ингибиторов протеиназ с гетерозисом и формированием защитных реакций при действии внешних факторов. Показано, что в тканях растений ингибиторы могут находиться в свободной и связанной формах. Свободные формы ингибиторов являются функционально активными и могут подавлять действие протеолитических ферментов, в т.ч. и протеиназ экзогенного происхождения. Фитотоксичные метаболиты патогенов повышают протеолитическую активность и снижают содержание свободных форм ингибиторов в тканях растений, что способствует усилению процессов патогенеза. Впервые показано, что защитные препараты химического и биологического происхождения индуцируют синтез ингибиторов протеиназ в растительных тканях и повышают таким образом их устойчивость к действию возбудителей болезней. Патогенные грибы рода Fusarium и рода Helminthosporium способны секретировать в окружающую среду протсолитичсские ферменты, активность которых подавляется белками из запасающих и вегетативных органов растений. При прорастании часть
ингибиторов внеклеточных протеиназ патогенов из семян диффундируют в окружающую среду. Ингибиторы протеиназ из растений способны связываться с углеводными компонентами клеточных мембран патогенов и агглютинировать споры ряда патогенных грибов.
Положения, выносимые на защиту:
новые методы определения активности ингибиторов протеиназ;
механизм действия ингибиторов протеиназ как защитных белков, заключающийся в диффузии ингибиторов из растительных тканен и связывании их с клеточными стенками грибных патогенов;
- зависимость активности протеолитических ферментов и их ингибиторов
у растений от действия внеклеточных фитотоксичных метаболитов патоге
нов;
- длительная индукция активности ингибиторов протеиназ в тканях расте
ний под действием защитных препаратов химического и биологического
происхождения, способствующее повышению их устойчивости к возбуди
телям болезней.
Апробация результатов. Основные результаты исследовании были представлены на Всесоюзной конференции "Геном растений; (Черновцы, 1983), Всесоюзном семинаре "Белки растений - генетические маркеры в селекции" (Ленинград, 1983), конференции "Генетико-селекционные исследования на Урале" (Свердловск, 1984, 1987), I-IV Всесоюзных конференциях молодых ученых (Петрозаводск, 1983; Москва, 1986; Петрозаводск, 1988; Минск, 1990), 5-ом съезде Всесоюзного биохимического общества (Киев, 1986), У111 Всесоюзном совещании " Иммунитет растений к болезням и вредителям" (Рига, 1986), II Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), II Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), конференции генетиков Поволжья и Урала (Челябинск, 1991), I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущиио, 1991), на конференции "Проблемы генетики и селекции на Урале" (Екатеринбург, 1992), I съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 1994), симпозиуме "Физико-химические исследования в физиологии растений" (Пенза, 1996), Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997), 2-ом съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1988), 11-ом конгрессе Европейского общества физиологов растений (FESPP) ( Варна, 1998), 7-й Международной конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, 1998).
Публикации. Результаты исследований изложены в 62 научных публикациях. В автореферате приводится список основных публикаций, включая I авторское свидетельство на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части ( 5 глав), выводов, списка использованной литературы, включающий 364 названия (170 отечественных и 194 зарубежных источников). Работа изложена на 249 страницах, включая 44 таблицы и 33 рисунка.