Белковые факторы маскирования и демаскирования мРНК в клетках эукариот Степанов, Александр Семенович

Введение к работе

Актуальность проблемы. К началу 70-х годов определились экспериментальные предпосылки для выяснения молекулярных механизмов маскирования мРНК — нахождения её во временно нетранслируемой форме на любой стадии жизненного цикла эукариотических клеток различного происхождения. Согласно гипотезе А.С.Спирина белки, блокирующие трансляцию мРНК в цитоплазме клеток, обеспечивают сохранение нефункционирующей мРНК — маскирование мРНК в форме комплексов мРНК с белками — мРНП-частиц, названных информосомами (Спирин, Белицина, Айтхожин, 1964, Ж. общ. биол., т. 25, с. 321—338). Рибонуклеопро-теидная форма существования оказалась универсальной как для новообразованных молекул про-мРНК, синтезирующихся в ядре клеток эукариот, так и для всех последующих этапов биогенеза и функционирования мРНК. По всей вероятности, белки информосом на определённых этапах функционирования должны присутствовать в клетке не только в составе комплексов с мРНК, но и в свободном состоянии. Было высказано предположение, что фонд свободных белков информосом составляют РНК-связывающие белки, обнаруженные в экстрактах животных клеток и названные так из-за своей способности к взаимодействию с экзогенными высокомолекулярными РНК (Овчинников и др., 1968, Мол. биол., т. 2, с. 752—763). По-видимому, изменения величины, состава и доступности пула свободных РНК-связывающих белков являются решающими факторами регуляции трансляции в клетках эукариот.

Если предположить, что трансляционная активность мРНК обусловлена набором связанных с ней белков, то в основе явлений маскирования/демаскирования матриц в клетках эукариот должны лежать механизмы "переодевания" мРНК, т. е смены набора белков, связанных с матрицей. Тем не менее такая гипотетическая схема, предполагающая взаимообмен свободных РНК-связывающих белков ядра и цитоплазмы с белками информосом различной внутриклеточной локализации (ядерных гяРНП, свободных цитоплазматических мРНП и полирибосомо-связанных мРНП), еще до недавнего времени не имела под собой достаточной экспериментальной базы. Более того, оставались практически невыясненными молекулярные механизмы маскирования и демаскирования мРНК, несмотря на очевидную связь этих явлений с одной из центральных проблем молекулярной биологии — проблемой регуляции биосинтеза белков в клетках эукариот.

Маскирование мРНК белками представляет собой весьма распространённый вариант трансляционного контроля. Интенсивный синтез мРНК на средних стадиях оогенеза, сохранение большей части матриц вплоть до оплодотворения и ранних стадий эмбриогенеза амфибий — наиболее изученный и яркий пример маскирования мРНК в клетках эукариот. Считается, что механизмы контроля реализации запасённых мРНК, то есть механизмы регуляции экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, вносят определяющий вклад в общую регуляцию биосинтеза белков на стадиях оогенеза и раннего эмбриогенеза эукариот. Не случайно, чёткие экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу рибонуклеопротеидной формы существования маскированных, запасённых мРНК, впервые были получены именно при изучении эмбриональных клеток (Spirin and Nemer, 1965, Science, Vol. 150, pp. 214—217). Ооциты амфибий и рыб на заключительных стадиях эмбриогенеза (так называемый период созревания ооцитов) стали основным объектом исследований в нашей работе.

Возможность трансляционного контроля в ооцитах, как и во всех эукариотических клетках, определяется наличием в клетках эукариот до сих пор ещё не изученного до конца набора белков, обслуживающих мРНК на всех этапах её биогенеза и функционирования ("Omnia mea mecum porto", Spirin, 1978, FEBS Letters, Vol. 88, pp. 15—17). Согласно этой гипотезе, белки аппарата трансляции в клетках эукариот должны обладать сродством к РНК, и кроме того, эти РНК-связывающие белки должны компартментализоваться на РНК. Очевидно, этим двум положениям полностью соответствуют белки, обеспечивающие процессы маскирования/демаскирования мРНК в ооцитах. Представления о важной роли специальных белков в регуляции трансляции мРНК сложились практически полностью на основании результатов, полученных в работах с бесклеточными системами. Оставался, однако, не выясненным принципиально важный вопрос о том, насколько эти результаты отражают действительную ситуацию в живой клетке. (Современное состояние проблемы см. в обзоре: Спирин, 1996, Успехи биологической химии, т. 36, с. 3—48). Генетические подходы к изучению механизмов регуляции трансляции в клетках эукариот пока что ограничиваются незначительным числом объектов. Использование ооцитов амфибий как естественной модели для изучения

механизмов биосинтеза белка и его регуляции, в частности, применение методов микрохирургии и микроинъекций в ооциты, предоставляют уникальную возможность для исследования этих процессов в живой клетке. Подобный подход представляется особенно перспективным для выяснения механизмов компарт-ментализации белков аппарата трансляции и для изучения пространственной организации белок-синтезирующего аппарата в цитоплазме эукариотических клеток.

Основная цель настоящей работы состояла в получении прямых экспериментальных доказательств возможности участия РНК-связывающих белков в процессах маскирования и демаскирования мРНК в клетках эукариот. При этом главная задача заключалась в разработке экспериментальных подходов для выяснения механизмов маскирования/демаскирования мРНК в живой клетке.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Разработан критерий отличия естественных информосом от искусственных РНП-комплексов, которые могут образовываться в экстрактах эукариотических клеток при добавлении в них экзогенных РНК. Основой критерия является стабильность РНП-комплексов в условиях избытка РНК, повышения ионной силы и температуры реакционной смеси. Стабильность РНП-частиц определяли по величине их плавучей плотности при центрифугировании в градиенте концентрации/плотности CsCI. Использование этого критерия позволило показать, что образование стабильных РНП-комплексов возможно при взаимодействии РНК-связывающих белков с гомологичной мРНК.

2. Разработан оригинальный подход к изучению РНК-белковых взаимодействий непосредственно в живой клетке путем сочетания современных методов биохимии, молекулярной биологии и экспериментальной эмбриологии. Впервые показано, что радиоактивно меченые in vitro свободные РНК-связывающие белки после инъекции в ооциты амфибий участвуют в формировании информосом, т.е. в маскировании мРНК.

3. Впервые в составе РНК-связывающих белков обнаружена и охарактеризована эндогенная протеинкиназа, идентифицированная как казеиновая киназа типа II (СК 2). Разработана высокоэффективная схема очистки СК 2 из клеток и тканей эукариот различного происхождения.

4. Установлено, что эндогенными субстратами СК 2 являются РНК-связывающие белки, сродство которых к РНК снижается вследствие фосфорилировам.л. Протеинкиназная активность СК 2 ингибируется мРНК и некоторыми другими полианионами.

5. Выявлено участие СК 2 в образовании информосом после инъекции очищенного фермента в ооциты амфибий. Сформулирована гипотеза о зависимости процессов маскирования/демаскирования мРНК в клетках эукариот от фосфорилирования РНК-связывающих белков эндогенной РНК-связывающей протеин-киназой (СК 2). При этом молекулам РНК отводится нетривиальная функция регулятора ферментативной (протеинкиназной) активности. Регулятором активности СК 2 могут выступать не только мРНК, но и другие полирубонуклеотиды. Не исключено также, что в клетке существует особый класс РНК, служащий эффектором для полианион-чувствительных ферментов. Кроме того, важную роль в регуляции клеточной активности фермента, несомненно, выполняет и изменение его сродства к РНК в различных физиологических условиях.

6. Впервые обнаружена корреляция между ак.ивацией СК 2 и возрастанием уровня трансляции демаскированных мРНК в процессе прогестерон-индуцируемого созревания ооцитов травяной лягушки Rana temporaria. Получены данные, позволяющие предполагать, что активация СК 2 является следствием повышения внутриклеточного рН.

7. Высказано предположение, что СК 2 необходима для
предотвращения маскирования мРНК в клетк х эукариот. Впервые
показано, что СК 2 является белком теплового шока и это под
тверждает представления о СК 2, как о возможном позитивном
регуляторе трансляции.

Результаты проведённых исследований позволяют утверждать, что основная роль СК 2, универсальной и наиболее изученной протеинкиназы эукариотических клеток, состоит в контроле процессов, связанных с функционированием мРНК. Значение полученных результатов в практике научных исследований состоит в разработке оригинального методического подхода к анализу РНК-белковых взаимодействий в живой клетке и в формулировании нового направления — выяснения роли ковалентных модификаций свободных РНК-связывающих белков в трансляции

предсуществующих мРНК. Изложенные в работе оригинальные результаты создают реальную экспериментальную основу для дальнейших исследований в этих направлениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на многих конференциях и симпозиумах, в том числе: "Сборка предбиологических и биологических структур" (Москва, 1979), XVI конференция ФЕБО (Москва, 1984), IV Советско-Итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984), "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), "Translational Control"- (Колд Спринг Харбор, США, 1989, IV Международный микологический конгресс (Регенсбург, Германия, 1990), "Protein Biosynthesis" (Пущино, 1991). Результаты исследований неоднократно обсуждались на научных семинарах в Институте белка РАН, в Институте биологии развития РАН, в НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, докладывались на научных конференциях в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН, где были удостоены I премии в 1983, 1984, 1987 и 1994 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ.