Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нейрональная сигнализация и роль ионов СГ в синаптической передаче 16
1.1. Нейроны и синаптическая передача 16
1.2. Потенциал покоя и изменения мембранного потенциала 18
1.3. Равновесный потенциал для ионов СГ(ЕСГ) 21
1.4. Влияние ионов СГ на мембранный потенциал 22
1.5. Механизмы возникновения трансмембранного градиента 24
1.6. Мембранные АТРазы нейрональных мембран 25
Выводы к первой главе 29
Глава 2. Механизмы транспорта СГ в нейрональных мембранах 30
2.1. Активные СГ-транспортирующие системы 30
2.1.1. Первично-активные СГ-транспортирующие системы 32
2.1.1.1. АТР-зависимый транспорт СГ из нейрона (СГ-АТРаза или СГ-насос) 32
2.1.1.2. АТР-зависимый транспорт СГ в нейрон 33
2.1.1.3. Mg2+-ATPa3a нейрональных мембран 35
2.1.2. Вторично-активные СГ-транспортирующие системы 37
2.1.2.1. K.V СГ ко-транспортер 37
2.1.2.2. СГ/НСОз"-обменник 39
2.1.2.3. Na+/K+/2C1'ко-транспортер 40
2.2. Пассивные СГ-транспортирующие системы 41
2.2.1. Пассивные СГ-каналы 42
222. Макси СГ-каналы 43
2.2.3. Потенциал-активируемые СГ-каналы 44
2.2.4. Объем-регулируемые СГ-каналы 46
2.2.5. Лиганд-активируемые СГ-каналы 47
2.2.5.1. Са2+-активируемые СГ-каналы 48
2.2.5.2. СГ-каналы, активируемые нейромедиаторами 48
2.2.5.3. Глицин-активируемые СГ-каналы 50
2.2.5.4. ГАМКд-активируемые СГ- каналы 51
2.2.5.5. ГАМКБ-рецепторы 59
2.2.5.6. ГАМКс-рецепторы 59
2.2.5.7. Ацетилхолин- и глутамат-активируемые СГ-каналы 59
Выводы ко второй главе 60
Глава 3. Роль АТР или Mg^-ATP в функциональной активности тормозных рецепторов 61
3.1. Двойственный характер влияния нейромедиаторов на тормозные рецепторы 61
3.2. Роль протеинкиназ и протеинфосфатаз в регуляции активности ГАМКА-рецепторов 63
3.3. Нетипичный ГАМКд-активируемый СГ-канал 64
3.4. АТР-связывающие СГ-транспортирующие белки (АВС-суперсемейство) 66
3.5. Функциональное взаимодействие пуриновых рецепторов с ГАМКА-рецепторами 69
Выводы к третьей главе 70
Материалы и методы исследования 71
Результаты исследования 80
Глава 1. Свойства СГ-АТРазы нейрональных мембран мозга рыб 80
1.1. Идентификация субклеточных структур, содержащих СГ-АТРазу 80
1.2. Кинетические свойства СГ-АТРазы 81
1.2.1. Специфичность к одно- и двухвалентным анионам и катионам 81
1.2.2. Субстратная специфичность 84
1.2.3. Влияние рН и молярности буфера 86
1.2.4. Влияние блокаторов различной природы 87
1.2.4.1. Влияние блокаторов транспортных АТРаз Р-типа 87
1.2.4.2. Влияние блокаторов СГ-каналов 89
1.2.4.3. Влияние ГАМКд-ергических лигандов на фермент 90
1.3. Функциональная сопряженность СГ-АТРазы с тормозными рецепторами 101
1.3.1. Влияние активаторов и блокаторов ионных каналов на фермент 101
1.3.2. Влияние бензодиазепинов и барбитуратов 104
1.3.3. Влияние глицина и стрихнина 106
1.4. Двухфазный характер влияния лигандов тормозных рецепторов 109
1.4.1. Влияние ГАМК на фермент в зависимости от ее концентрации 109
1.4.2. Влияние ГАМК на фермент в условиях, когда он не активируется анионами ПО
1.4.3. Зависимость активности фермента от концентрации пентобарбитала 113
1.4.4. Зависимость активности фермента от концентрации диазепама 117
1.4.5. Влияние фуросемида на ГАМКА-индуцируемый транспорт ионов СГ и активность СГ-АТРазы 120
1.4.6. Влияние фенолпроизводных на активность фермента 123
1.5. Структурная сопряженность СГ-АТРазы с ГАМКА-рецепторами 124
1.5.1. Влияние этанола на активность «базальной» и ГАМК-активируемой Mg2+-ATPa3 124
1.5.2. Ультраструктурная локализация СГ-АТРазы в субклеточных структурах 126
1.6. Механизмы регуляции действия ГАМКА-ергических лигандов на СГ-АТРазу... 130
1.6.1. Роль G-белков и катионов в регуляции активности фермента. Влияние ГТР и ГДР 130
1.6.2. Влияние специфических реагентов на аминокислотные остатки белков 131
1.6.3. Роль кластерной организации в регуляции фермента 131
1.6.4. Роль протеинтирозинкиназ и протеинфосфатаз в регуляции фермента 132
1.6.5. Роль опиоидных, аденозиновых и серотониновых рецепторов в регуляции активности фермента 135
1.6.6. Роль ионов НСОз" в активации СГ-АТРазы 139
1.6.6.1. Влияние низких концентраций ионов НС03' 139
1.7. Молекулярные свойства СГ,НС03'-АТРазы из мозга рыб 147
1.7.1. Свойства солюбилизированной формы фермента 147
1.7.2. Очистка фермента из мозга рыб: молекулярная масса и субъединичный состав 149
1.8. Фосфорилирование СГ, НС03"-АТРазы мембран мозга рыб 152
1.8.1. Влияние Mg2+-ATP на активность СГ, НС03"-АТРазы 152
1.8.2. Фосфорилирование мембранносвязанной СГ,НС03'-АТРазы с помощью [у-32Р]АТР 158
1.9. Реконструкция СГ, НС03'-АТРазы в искусственные протеолипосомы 162
1.9.1. Роль фермента в АТР-зависимом транспорте ионов СГ через мембраны липосом 162
Выводы к первой главе 167
Глава 2. Свойства СГ, НС03"-АТРазы нейрональных мембран мозга крыс 168
2.1. Кинетические свойства фермента 168
2.1.1. Специфичность к одно- и двухвалентным катионам и анионам 168
2.1.2. Влияние ионов СГ и НС03' на фермент 168
2.1.2.1. Влияние низких концентраций ионов СГ и НС03' 168
2.1.2.2. Влияние высоких концентраций ионов СГ и НС03' 172
2.1.3. Субстратная специфичность 175
2.1.4. Оптимумы рН и молярности буфера 178
2.1.5. Влияние блокаторов различной природы 179
2.2. Очистка СГ, НС03'-АТРазы из мозга крыс: молекулярная масса и субъединичный состав 181
2.3. Фосфорилирование СГ, НС03'-АТРазы мембран мозга крыс с помощью [у-32Р]АТР 186
2.4. Реконструкция СГ, НС03'-АТРазы из мозга крыс в искусственные протеолипосомы 190
2.4.1. Роль фермента в АТР-зависимом транспорте ионов СГ через мембраны липосом 190
2.5. Роль СГ, НС03"-АТРазы в пикротоксин-индуцируемои судорожной активности у крыс 196
Выводы ко второй главе 197
Глава 3. СГ-АТРаза в нейронах обонятельного эпителия рыб 198
3.1. Кинетические свойства фермента 198
3.2. Участие СГ-АТРазы в АТР-зависимом транспорте СГ через мембрану микросом 207
Выводы к третьей главе 210
Глава 4. Практическое применение свойств фермента 211
Выводы к четвертой главе 217
Обсуждение результатов 218
Заключение 273
Выводы 280
Библиографический список 282
- Нейроны и синаптическая передача
- Первично-активные СГ-транспортирующие системы
- Двойственный характер влияния нейромедиаторов на тормозные рецепторы
- Кинетические свойства фермента
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основных свойств нервной ткани является передача нервных импульсов от нейрона к нейрону посредством изменения мембранного потенциала (Ем), вызванного как пассивным, так и активным движением ионов через ионные каналы [705,486, 247, 718]. Из систем активного транспорта ионов наиболее изучены катионные системы (Na+, К+, Са2+), а анионные (в первую очередь СГ) исследованы значительно меньше, хотя в последнее время их роль в неирональных процессах привлекает все большее внимание. Это связано, прежде всего, с установлением важной роли активных СГ-транспортных процессов в поддержании внутриклеточной концентрации ионов хлора ([СГ]ВН), отличной от концентрации, обусловленной пассивным распределением, создаваемым системой Доннана [226, 668, 306,379], что в свою очередь, является важным фактором регуляции сигнальных систем нейрональной клетки [72,450, 396,454,549].
В нейронах эмбрионов и в рецепторных нейронах некоторых сенсорных систем (в частности, в обонятельной выстилке) Ем более отрицателен, чем равновесный потенциал для хлора (Ес{), описываемый уравнением Нернста [187, 440, 362]. Тормозные медиаторы (ГАМК, глицин), взаимодействуя с ГАМКА- и глициновыми рецепторами на постсинаптической мембране, индуцируют выход СГ из нейрона и его возбуждение [475, 296, 19]. В этих нейронах, основная роль в поддержании высокой (> 50 мМ) [СГ]ВН принадлежит сопряженному, вторично-активному Na+/K+/2C1' ко-транспорту [431, 561, 559], осуществляемому NKCC ко-транспортной системой, а также первично-активной, независимой от Na+, АТР-зависимой системе. Эти системы транспортируют СГ в нейрон против электрохимического градиента [54, 414]. Однако АТРаза, участвующая в таком СГ-транспортирующем процессе до настоящего времени не обнаружена.
В то же время, в нейронах взрослых животных Ем более положителен, чем Еа', и тормозные медиаторы индуцируют вход СГ в нейрон по электрохимическому градиенту, обеспечивая его торможение [678]. В таких нейронах основная роль в поддержании низкой (< 10 мМ) [СГ]В11 принадлежит сопряженному, вторично-активному К+/СГ ко-транспорту, осуществляемому КСС2 ко-транспортной системой [275, 595], а также первично-активной АТР-зависимой системе (СГ-АТРазе) [266-268,353]. Аналогичная СГ-АТРаза была обнаружена в базолатеральных мембранах эпителиальных клеток моллюска [201, 204]. Причем установлено, что СГ-АТРаза, обнаруженная в
9 плазматических мембранах различных клеток (в том числе в нейронах), транспортирует ионы хлора из клетки во внеклеточную среду. В зависимости от исследуемой ткани такая молекулярная «машина» (СГ-насос) может являться Р- (ErE2), F- или V-типом АТРазы [201,204,353,366].
Кроме того, показано, что в развитых нейронах, при увеличении концентрации ГАМК или частоты ее воздействия на рецептор, наблюдаемое торможение нейрональной мембраны переходит в ее возбуждение [549, 337, 338]. Все авторы отмечали важную роль ионов НСОз' в этом процессе, однако в отношении ионов СГ мнения исследователей разделились. Одни из них предполагали, что при ГАМКЛ-индуцируемом С17НС03"-обменном процессе ионы СГ входят в нейрон пассивно, в обмен на ионы НСОз" [550, 553, 449]. Однако убедительных доказательств этого феномена не получено. Другие авторы предполагали, что ионы СГ выходят из клетки при ГАМКА-индуцируемой деполяризации, поэтому ставился вопрос о существовании АТР-зависимого транспорта СГ внутрь клетки - СГ-АТРазы, отличной от СГ-насоса и сопряженного с ГАМКА-рецепторами [450]. В пользу возможного существования такой АТРазы, свидетельствуют данные, демонстрирующие присутствие в специфических нейронах мозга ГАМКА-регулируемого СГ-насоса [127, 128, 260], который, связывая ГАМК, индуцирует АТР-зависимый транспорт СГ против электрохимического градиента.
Торможение нейрона зависит от внутриклеточной концентрации АТР и характеризуется, по сравнению с возбуждением, более быстрой и интенсивной активацией энергетического обмена [617, 328, 229]. Изменение функциональной активности мозга при различных воздействиях хорошо коррелирует с интенсивностью образования макроэргических соединений [660]. Так, энергопродукция (Р/мин/г) резко возрастает при судорогах, моделирующих эпилептический припадок [614], и снижается при фенобарбиталовом наркозе. Показано также, что при пикротоксин-индуцируемых судорогах, стрессе или ишемии в мозге млекопитающих изменяется активность не только Na+,K+-ATPa3bi, но и «базальной» Mg2+-ATPa3bi [588, 607, 717]. Функциональная роль «базальной» Mg2+-ATPa3bi в нейрональных мембранах не установлена, однако показано, что часть ее активности может составлять экто-АТРаза, обеспечивающая устранение АТР как медиатора [410,411,535,537]. Выявление в нервной ткани
специфических процессов, требующих энергетических затрат, является одной из актуальнейших задач нейрохимии.
Все вышеизложенное указывает на целесообразность поиска в плазматических мембранах синаптических структур АТРазной системы, которая активируется ионами СГ и/или НС03', структурно и функционально сопряжена с тормозными рецепторами и участвует в АТР-зависимом транспорте СГ.
Цель работы. Целью настоящей работы является выявление и идентификация в мембранах нейронов анион-зависимой АТРазы, установление функциональной и структурной сопряженности этого фермента с ГАМКА-рецепторами, вовлечение в образование фосфопротеина и участие в АТР-зависимом транспорте ионов СГ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Выявление в плазматических мембранах мозга и обонятельной выстилки животных АТРазной системы, активируемой ионами СГ и/или НС03", и исследование ее кинетических свойств.
Биохимическая и цитохимическая идентификация структур мозга, обладающих активностью СГ,НС03'-АТРазы, с помощью методов дифференциального центрифугирования и цитохимии.
Изучение специфичности влияния активаторов и блокаторов различных рецепторных белков на СГ,НС03"-АТРазную систему и установление функциональной сопряженности фермента с ГАМКА-рецепторами, посредством преинкубации фермента с лигандами различной природы.
Исследование молекулярных свойств фермента и установление его структурной сопряженности с ГАМКА-рецепторами методами гель-хроматографии и ПААГ-электрофореза.
Исследование способности СГ,НС03"-АТРазы образовывать фосфопротеин в присутствии [у-32Р]АТР и выяснение ее роли в АТР-зависимом и ГАМКА-индуцируемом транспортах СГ с помощью флуориметрического зонда на СГ.
Установление участия СГ,НС03"-АТРазы нейрональных мембран в конвульсант-индуцируемой судорожной активности животных.
Научная новизна. Впервые в нейрональных мембранах обнаружена анион-активируемая Mg^-ATP-гидролазная белковая структура, которая обеспечивает
11 активность «базальной» Mg2+-ATPa3bi, зависимой от активации анионами галогенового ряда и, в первую очередь, ионами СГ или СГ и НС03\ Эта активность принадлежит ферменту, названному СГ, НС03'-АТРазой.
Ряд биохимических свойств СГ, НСОз'-АТРазы (специфичность к анионам, оптимум рН, чувствительность к SH-реагентам, ингибиторам высокоэнергетического фосфорилированного интермедиата, участие в АТР-зависимом транспорте ионов СГ, прямое фосфорилирование АТР) указывают на принадлежность фермента к электрогенным транспортным АТРазам Р-типа. Однако по ряду других биохимических свойств (специфичность к нуклеотидам, чувствительность к активаторам и блокаторам СГ-каналов, молекулярная масса, субъединичный состав и другие) обнаруженный фермент отличается от СГ-АТРазы (СГ-насоса), существующей в нейрональных мембранах, и сходен со свойствами тормозных рецепторов.
Впервые обнаружено, что СГ,НС03'-АТРаза функционально сопряжена с ГАМКд/бензодиазепиновым рецепторным комплексом. Активность СГ,НСОз"-АТРазы регулируется через рецептор-зависимый путь активаторами и блокаторами тормозных рецепторов, управляющих транспортом анионов (СГ и НСОз"), и не чувствительна к лигандам рецепторных белков (глутаматных, холиновых и ГАМКБ-рецепторов), управляющих транспортом катионов (Na , Са ). Эффект ГАМКА-ергических лигандов на фермент имеет двухфазный характер, что проявляется в активировании или ингибировании «базальной» Mg2+-ATPa3bi и в изменении характера ее активации анионами. Причем установлена прямая зависимость между изменением характера активации «базальной» Mg2+-ATPa3bi при действии ГАМКА-ергических лигандов и ее чувствительностью к анионам. Показана важная роль белков цитоскелета и катионов в обеспечении действия ГАМКА-ергических лигандов на фермент. Эффект лигандов тормозных рецепторов на фермент опосредовано регулируется лигандами опиоидных и пуриновых рецепторов.
Впервые установлено, что СГ, НС03"-АТРаза локализована в элементах ГАМКА- ергических дендро-дендритных синапсов и структурно сопряжена с ГАМКд/бензодиазепиновым рецепторным комплексом. Так, СГ,НС03'-АТРаза из мозга животных имеет молекулярную массу -300 кДа и у рыб является гомоолигомером, состоящим из субъединиц с молекулярной массой -56 кДа, а у крыс гетероолигомером, состоящим из субъединиц с молекулярной массой -56, 53 и 48 кДа. Такие свойства
фермента сходны с молекулярными свойствами ГАМКА-рецепторов из мозга этих видов животных, но значительно отличаются от молекулярных свойств транспортных АТРаз Р-типа. В пользу этого указывают также данные о способности очищенного из мембран фермента сохранять чувствительность к ГАМКА-ергическим лигандам.
Впервые показано, что субъединицы фермента с молекулярной массой ~ 56 кДа обладают способностью фосфорилироваться с участием протеинкиназ, а также без их участия в присутствии [у-32Р]АТР и Mg2+, и дефосфорилироваться под действием ионов СГ и НСОз', рН>10 или гидроксиламина. ГАМК через рецептор-зависимый путь также вызывает дефосфорилирование кислотостабильного и гидроксиламин-чувствительного фосфорилированного интермедиата. Кроме того, установлена важная роль ванадат-чувствительной тирозинфосфатазы в дефосфорилировании СГ,НС03'-АТРазы. Показано, что выделенная и реконструированная в мембрану СГ,НС03"-АТРаза участвует в АТР-зависимом или ГАМКА-индуцируемом транспорте ионов СГ через мембрану протеолипосом. АТР-зависимый транспорт СГ также регулируется ГАМКА-ергическими лигандами через рецептор-зависимый путь. Установлено, что ионы НСОз" вызывают реверсию направления транспорта СГ через мембрану липосом, в которые предварительно вводили ионы СГ.
Получены новые данные, демонстрирующие вовлечение фермента в пикротоксин-индуцируемую судорожную активность у крыс, что проявляется в увеличении активности «базальной» Mg2+-ATPa3bi мозга животных и в устранении ее активации ионами СГ и НСОз' в присутствии пикротоксина.
На основании полученных данных, описывающих свойства СГ, НС03"-АТРазы, разработана схема функционирования фермента в нейрональных мембранах.
Теоретическое и практическое значение работы.
Гипотеза о существовании в нейрональных мембранах АТРазы, сопряженной с ГАМКА-рецепторами, была высказана два десятилетия назад (Stelzer, et al., 1988). Обнаружение в нейрональных мембранах мозга и обонятельной выстилки АТР-зависимой СГ-транспортирующей системы, сопряженной с ГАМКА-рецепторами, подтверждает такое предположение. Описанные взаимодействия исследуемой АТРазы с ГАМКА-рецепторами на клеточном, молекулярном и функциональном уровнях свидетельствуют, что в нейрональных мембранах присутствует СГ,НС03'-АТРаза, сопряженная с тормозными рецепторами.
Функциональная и структурная сопряженность СГ,НС03'-АТРазы с ГАМКА-рецепторами, а также сходство кинетического поведения активности фермента при действии ГАМКА-ергических лигандов со свойствами ГАМКА-регулируемого СГ-канала позволяют рассматривать СГ,НСОз'-АТРазу как полифункциональную олигомерную белковую структуру, которая является одновременно ферментом (АТРазой), транспортером (АТР-зависимым СГ-насосом) и СГ-каналом (ГАМКА-сопряженным СГ-каналом), подобно тому, как это наблюдается для АТР-связывающих белков АВС-суперсемейства.
Полученные данные открывают перспективу для дальнейших исследований, направленных на раскрытие молекулярных механизмов гидролиза АТР исследуемой СГ ,НСОз'-АТРазой в процессах функционирования нервной системы в норме и при патологии. Кроме того, результаты работы предполагают целенаправленный поиск новых препаратов, способных избирательно и через процессы гидролиза АТР высокоспецифично регулировать функцию тормозных рецепторов. Проведенное биохимическое исследование вносит вклад в решение фундаментальной проблемы регуляции функции рецепторных белков и выявление в нервной ткани специфических процессов, требующих энергетических затрат.
На основании данных по чувствительности фермента мозга животных к различным токсическим веществам разработан простой экспресс-метод определения токсичности водной среды (патент на изобретение № 2266539).
Публикации результатов данной работы внесены в международный сборник «SUBIS» в рубрику «Оригинальные статьи» в разделы по АТРазам и ГАМКА-рецепторам, а также в важнейшие результаты в области естественных, технических и общественных наук Российской Академии Наук за 1998 год.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. В плазматических мембранах мозга и обонятельной выстилки позвоночных животных (млекопитающие, рыбы) обнаружена неизвестная ранее анионная АТРаза, которая в первую очередь активируется ионами СГ (СГ-АТРазная активность), а также одновременно ионами СГ+НС03" при их соотношении ~5:1 (СГ,НС03'-АТРазная активность). Диапазон концентраций анионов, максимально активирующих фермент, зависит от концентрации субстрата в среде инкубации и
может составлять для СГ 25-100 мМ и НС03" 5-20 мМ. Ряд биохимических свойств СГ,НС03'-АТРазы свидетельствуют о принадлежности фермента к транспортным АТРазам Р-типа и СГ-АТРазам (СГ-насосам) Р-типа из мембран клеток различного происхождения.
Молекулярные свойства СГ,НСОз"-АТРазы (молекулярная масса, субъединичный состав, связывание ГАМКА-ергических лигандов мембранносвязанным и частично очищенным белком) и результаты цитохимических исследований (локализация фермента в элементах ГАМКА-ергических дендро-дендритных синапсов) указывают на ее функциональную и структурную сопряженность с ГАМКА-рецепторами.
СГ,НС03'-АТРаза, очищенная из нейрональных мембран и реконструированная в искусственные липосомы, участвует в АТР-зависимом или ГАМК-индуцируемом транспорте ионов СГ через мембрану протеолипосом. В условиях, когда ионы СГ находятся внутри липосом, ионы НС03" индуцируют выход СГ из липосом.
СГ, НСОз'-АТРаза нейрональных мембран образует в присутствии АТР и Mg2+ кислотостабильный и гидроксиламинчувствительный фосфорилированный интермедиат, который дефосфорилируется под действием анионов, гидроксиламина, рН 10 и ГАМК. Действие ГАМКА-ергических лигандов на фермент обеспечивается фосфорилированием с участием протеинкиназ. Фосфорилирование фермента протеинкиназами и дефосфорилирование его протеинфосфатазами являются важными внутриклеточными факторами, обеспечивающими действие ГАМКА-ергических лигандов на СГ,НС03'-АТРазу.
Разработана гипотетическая модель функционирования СГ,НС03'-АТРазы в нейрональной мембране, включающая несколько стадий - присоединение субстрата и анионов, фосфорилирование, дефосфорилирование и высвобождение анионов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Представленные в диссертации материалы были доложены: на X Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии, посвященном памяти Л.А. Орбели (Ленинград, 1990); на международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского севера» (Петрозаводск, 1991); на XI международном совещании по эволюционной физиологии (С-Петербург, 1996); на I конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997); на международном симпозиуме по обонянию и вкусу (Сан Диего, США, 1997); на XXV международном конгрессе по
патофизиологии (Москва, 2005); на конференции «ГАМКА-рецепторы» (Нью-Йорк, США, 2006).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 41 печатной работе, из которых 32 статьи опубликованы в рецензируемых отечественных и зарубежных
журналах.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ
Материал диссертации изложен на 337 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц, 111 схем и рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (65 отечественных, 658 иностранных источника).
Нейроны и синаптическая передача
Центральная нервная система представляет собой непрерывно работающую, сложно организованную систему клеток, которые постоянно получают информацию, анализируют ее, перерабатывают и определенным образом отвечают на нее [245, 299, 705]. Для регуляции многих аспектов поведения и для контроля функции организма, нервная система обладает огромным количеством линий коммуникаций, обеспечиваемых нервными клетками (нейронами). Нейроны представляют собой основную единицу структурной организации мозга [468]. Изображенные на рис.1 неирональные клетки различного происхождения демонстрируют особенности строения нервных клеток, присущие всем нейрогам центральной и периферической нервной системы, и соответствуют схеме обычного нейрона с дендритами, телом и аксоном. Клеточное тело (сома) нейрона содержит ядро, митохондрии и другие внутриклеточные органеллы, общие для всех клеток [705]. Названия дендрит, тело клетки и аксон применяются к отросткам, на которых входящие волокна образуют синаптические контакты, играющие роль станций для возбуждения или торможения. Информация от нейрона к нейрону передается через синаптические контакты [299, 326]. Для передачи информации от клетки к клетке нейроны используют электрические или химические сигналы. На рис.2, представлена схематическая структура электрического и химического синапсов.
Синапсы на нервных клетках чаще всего образуются расширениями нервного окончания (бутонами). В электрических синапсах ток протекает напрямую от одной клетки к другой через коннексоны (межклеточные каналы). В химических синапсах деполяризация пресинаптического нервного окончания вызывает освобождение нейромедиатора (ацетилхолина, глутамата, ГАМК, глицина и др.), который, соединяясь на постсинаптической мембране дендритов с соответствующим рецептором, вызывает кратковременное изменение ионной проницаемости и, как следствие, возбуждение или торможение мембранного потенциала [338, 250, 680]. При активации этих каналов возникают постсинаптические токи; эти токи интегрируются, и в результате возникают постсинаптические потенциалы в дендритах, теле и аксонном холмике нейрона. Таким образом, различные отделы нейрона специализированы как с анатомической, так и с функциональной точек зрения.
Способность вырабатывать электрические сигналы - важнейшее функциональное свойство нервных клеток [246,247]. Такие электрические сигналы опосредованы потоком ионов через водопроницаемые поры (ионные каналы), существующие в нейроналыюй мембране [239, 301]. Вследствие неравномерного распределения электролитов существует разность потенциалов между внутренней и наружной стороной плазматической мембраны (мембранный потенциал). Известно, что ионы, разделенные мембранной, движутся из области высокой в область более низкой их концентрации, в результате чего возникает разность потенциалов, т.е. так называемый диффузионный потенциал [668]. Мембранные потенциалы в значительной мере являются диффузионными, возникающими вследствие различия скоростей передвижения различных ионов через мембраны. Влияние разности электрических потенциалов между цитоплазмой и внеклеточной средой на поток ионов через клеточную мембрану существенно зависит от направления потока: движение «против поля» тормозится, а «по полю» - ускоряется. Различное влияние разности потенциалов на движение ионов в ту и другую сторону приводит к тому, что потоки ионов в том и другом направлениях могут стать одинаковыми только при различных концентрациях соответствующих ионов в среде и цитоплазме. Кроме того, здесь важную роль приобретает условие макроскопической электронейтральности системы, которое заключается в том, что концентрация анионов в клетке всегда должна быть равна концентрации в ней катионов.
Первично-активные СГ-транспортирующие системы
В ранних исследованиях в нейрональных клетках животных был показан активный транспорт СГ против электрохимического градиента, а затем в плазматических мембранах нейронов была обнаружена анион-активируемая Mg2+-ATPa3a (СГ-АТРаза), отвечающая за активный транспорт СГ [223, 224]. СГ-АТРазная активность была обнаружена в мембранных везикулах кролика и крыс и выявлялась как не митохондриальная М2+-АТРазная активность, максимально активируемая в присутствии ионов СГ [223, 224, 265]. Локализация СГ-АТРазы в плазматических мембранах нейронов была установлена с помощью маркерных белков после центрифугирования микросом в градиенте плотности сахарозы [265] и методом ферментативной цитохимии [269]. Этакриновая кислота ( 0,3 мМ) полностью ингибировала фермент с Kj=50 мкМ и не влияла на Mg2+-ATPa3y митохондрий, Na+, К+ -АТРазу и НСОз -АТРазу. СГ-АТРаза активировалась рядом анионов в порядке уменьшения эффективности Cr Br" CH3COO =r S042"=HC03 S032 , тогда как SCN и F" не влияли на ферментативную активность [571]. Фермент гидролизовал нуклеотидфосфаты в порядке уменьшения эффективности АТР»ГТР ИТР УТР ЦТР, но не выявлялся в присутствии АДР, AMP и сАМР. Оптимум рН для СГ-АТРазы составляла 7,4 [265,267,268].
В ранних исследованиях участие фермента в АТР-зависимом транспорте ионов СГ" исследовалось на везикулярном препарате плазматических мембран мозга крыс [269, 270, 519]. Вход 36С1 в мембранные везикулы наблюдался после добавления 3 мМ АТР и 3 мМ Mg , а этакриновая кислота (0,3 мМ) полностью ингибировала транспорт ионов. Нуклеотиды с разной эффективностью АТР»ГТР ИТР УТР стимулировали транспорт СГ, тогда как в присутствии ЦТР, АДР, AMP и не гидролизуемого аналога ATP - P, у- метилен ATP поглощение 36C1 везикулами не наблюдалось. Скорость АТР-зависимого поглощения СГ увеличивалась с увеличением концентрации АТР и СГ, и Км составляла 1,5 мМ и 7,4 мМ. Оптимум рН для АТР-зависимого транспорта СГ составил 7,4 [519].
В дальнейшем была проведена реконструкция СГ-АТРазы мозга рыб. Фермент был солюбилизирован из мембран мозга крыс с помощью детергента MEGA-10 и фракция, обогащенная плазматическими мембранами, была встроена в мембраны искусственных липосом, образованных фосфолипидами азолектина. Транспорт ионов СГ в протеолипосомы исследовался в отсутствие и в присутствии других липидов и лигандов различной природы. Максимальное АТР-зависимое поглощение СГ и активность реконструированной АТРазы наблюдались в присутствии фосфатидилинозитола-4-монофосфата. Кроме того, было установлено, что АТР-зависимый транспорт СГ стимулировался в присутствии FCCP (протон-проводящий ионофор) и валиномицина, но не DCCD (0,1 мМ) (протонного ингибитора). Кроме того, транспорт СГ, как и активность фермента, не чувствительны к 0,3 мМ фуросемиду [646]. Было предположено, что СГ-АТРаза является электрогенным СГ-транспортером, регулируемым через фосфатидил-инозитольный путь in vivo. Установлено, что молекулярная масса СГ-АТРазы (СГ-насоса) из плазматических мембран мозга крыс составляет -520-580 кДа и состоит из четырех субъединиц с молекулярной массой 62, 60, 55 и 51 кДа. При фосфорилировании фермента было установлено, что каталитическая субъединица, которая подвержена гидроксиламин-чувствительному фосфорилированию, принадлежит белку с молекулярной массой -51 кДа. Кроме того, клонирована субъединица с молекулярной массой 55 кДа [648]. Обнаруженная в мозге млекопитающих СГ-АТРаза является кандидатом на главную АТРазную систему, участвующую в АТР-зависимом транспорте СГ из нейрона во внеклеточную среду, т.е. против электрохимического градиента.
Ранее в ряде публикаций было показано существование №+-независимого, АТР-зависимого транспорта СГ, направленного из внеклеточного пространства в цитоплазму клеток. В частности, такой транспорт СГ был показан на нейтрофилах человека, где наблюдаемая [СГ]ВН в четыре раза выше, чем должно быть при распределении ионов в соответствии с уравнением Нернста [527]. Активный транспорт СГ не зависел от наружной концентрации Na+ и ингибировался в присутствии ингибиторов метаболизма АТР. Существование №+-независимого транспорта СГ было также показано в мускульных волокнах артерий желудка крыс [131, 115] и вентрикулярных клетках серца крыс [114]. В незрелых нейронах [СГ]ВН выше, чем ожидается для равновесного распределения этих ионов, что, как предполагается, связано с функционированием Na+/K+/2G" ко-транспортера. Однако ряд исследователей показали существование АТР-зависимого транспорта СГ внутрь незрелых нейрональных клеток крыс [54]. Так, на N2a клетках нейробластомы было показано, что их инкубирование в Hepes-буфере, содержащем NaCl, вызывает накопление [СГ]ВН около 60 мМ, т.е. в 2-3 раза выше, чем предполагается для равновесного распределения при мембранном потенциале -49 мВ. Когда клетки помещали в среду без NaCl, концентрация [СГ]ВН быстро уменьшалась (tj 2 5 мин), тем самым указывая на высокую СГ-проницаемость. Когда внутриклеточная концентрация АТР уменьшалась в присутствии ротенона (ингибитора синтеза АТР), начальная скорость транспорта СГ внутрь клеток ингибировалась на 60-65% и, как следствие, концентрация СГ снижалась до 24 мМ, т.е. близко к величине предсказанной уравнением Нернста. После снижения концентрации АТР и [СГ]ВН дополнительное внесение в инкубационную среду глюкозы приводило к восстановлению АТР с одновременным восстановлением [СГ]ВН. Внутриклеточная концентрация ионов НС03" практически не влияет на Ыа+-независимый и АТР-зависимый транспорт СГ, что предполагает, что СГ/НС03 -обменный процесс не вовлекается в активный транспорт хлора. Однако, авторы не исключают вовлечения ионов НС03 в обнаруженный АТР-зависимый механизм транспорта ионов СГ. Таким образом, было показано, что обнаруженный в незрелых нейрональных клетках АТР-зависимый механизм отличается от Na+/K+/2C1 ко-транспортера и отвечает за активный транспорт ионов СГ в цитоплазму клеток.
Двойственный характер влияния нейромедиаторов на тормозные рецепторы
До 90-х годов общепризнанным являлась точка зрения, что ГАМК или глицин оказывают тормозное действие на синаптическую проводимость [652]. Однако уже тогда было показано, что тормозный эффект медиаторов не всегда проявляется в гиперполяризации мембранного потенциала. Так, было установлено, что ГАМК, через СГ-проводимость, может вызывать возбуждающее действие и деполяризацию мембранного потенциала [547]. Это также наблюдалось при исследовании САЗ нейронов гиппокампа новорожденных крыс [107, 108, 48, 328, 347, 348, 362]. Деполяризующее возбуждающее действие ГАМК, с участием ГАМКА-рецепторов наблюдалось в различных типах и областях мозга у эмбрионов или новорожденных крыс [474, 346, 104, 440, 441, 191]. Имеются данные, что не только ГАМКА-рецепторы, но и глициновые рецепторы также могут проявлять возбуждающее действие на нейроны эмбрионов и новорожденных животных [310, 474, 186, 540, 187, 68, 126, 215]. Относительно прямым объяснением этого феномена является отсутствие или гипофункция СГ-выталкивающих механизмов в нервных клетках эмбрионов или новорожденных животных [480, 191]. ГАМКА-рецептор индуцируемая деполяризация и возбуждение были описаны также в различных нейронах взрослых животных [22, 12, 395, 277, 549, 292, 567, 28, 550]. Было предположено, что такое деполяризующее действие ГАМК на ГАМКА-рецепторы в дендритных областях пирамидальных нейронов гиппокампа взрослых крыс связано с внутриклеточным насосным транспортом СГ внутрь нейрона [395]. Однако в других исследованиях было показано, что такая деполяризация наблюдается при сильной стимуляции, такой как высокая частота или длительное время воздействия ГАМК или экзогенное применение высокой концентрации медиатора или сильных активаторов/блокаторов ГАМКА-рецепторов, например таких как барбитураты. Кроме того, было показано, что ГАМКА-индуцируемая деполяризация имеет медленное прохождение во времени после первой фазы быстрой гиперполяризации [117, 577, 549, 449, 292, 550, 449, 290, 291]. Этот феномен был по разному интерпретирован различными авторами, хотя у них была общая идея об участии ионов НС03" в деполяризующей фазе [361]. Кроме того, в одной гипотезе было предположено, что быстрый транспорт СГ через ГАМКА-активируемые рецепторы приводит к значительному увеличению [СГ]ВН, что и вызывает уменьшение ГАМКА-индуцируемой стимуляции транспорта ионов хлора в нейрон. Было предположено, что в таких условиях транспорт ионов НС03 из клетки является преобладающим. В другой гипотезе предполагается, что в пролонгирующей ГАМКА-рецептор индуцируемой деполяризующей фазе мо :;ет быть активирование нетипичных ГАМК0-рецепторов, связанных с анионным каналом, имеющим необычно высокую проницаемость для ионов НС03 [449, 450]. В настоящее время ионные механизмы этого процесса окончательно не установлены [549], однако предполагается вовлечение в него не только пассивного транспорта ионов СГ и НС03 , но и АТРазы, участвующей в активной регуляции [СГ] вн [553,449].
Таким образом, из анализа литературных данных можно видеть, что электрохимический градиент для СГ определяет «быстрый» физиологический эффект ГАМК через ГАМКА-рецепторы. Это может быть деполяризация-возбуждение в эмбрионах или новорожденных животных [47, 108, 547], которое связано с электрохимическим градиентом и транспортом СГ внутрь нейрона. В то же время, у взрослых животных медиатор является тормозным, как это было убедительно показано за последние 35 лет [425, 325,599, 600,326,547,397]. Однако у взрослых животных, в условиях сильной стимуляции медиатором, ГАМКА-рецептор индуцируемый сигнал может становиться деполяризующим, и такое возбуждение принадлежит к проявлению роли ионов НС03". Этот сигнал имеет более пролонгирующую временную фазу в соответствии с током, индуцируемым только за счет ионов СГ. С физиологической точки зрения это условие может соответствовать сильному возбуждению, которое вызывают глутаматергические нейроны.
Многочисленными исследованиями установлено, что активность лиганд-управляемых СГ-каналов является энергозависимой [617]. Уже в ранних электрофизиологических исследованиях функции ГАМКА-рецепторов было показано, что длительное воздействие или высокая концентрация медиатора, применяемые при воздействии на ГАМКА-рецептор, вызывают снижение или так называемый «rundown effect» функции тормозного рецептора. Было установлено, что такое падение функции рецептора связано с внутриклеточным уменьшением концентрации АТР в нейроне [614, 229], а восстанавление ее наблюдается при введении нуклеотида в клетку [553]. Было предположено, что АТР, за счет вовлечения протеинкиназ, должен фосфорилировать рецепторный белок [405]. В дальнейших исследованиях действительно было подтверждено, что протеинкиназы, в том числе РКА, РКС и протеинтирозинкиназы, за счет фосфорилирования а- или Р-субъединицы регулируют функцию ГАМКА-рецепторов [405].
Кинетические свойства фермента
Мы исследовали влияние ионов СГ на «базальную» Mg2+-ATPa3y мозга крыс в диапазоне концентраций 1-150 мМ (рис. 82). В исследуемом диапазоне концентраций ионы СГ начинают активировать фермент с концентрации 10 мМ, в диапазоне концентраций 30-80 мМ кривая зависимости активности фермента от концентрации ионов СГ выходит на плато. При дальнейшем увеличении активирующий эффект ионов снижается и при 150 мМСГ не проявляется (Ка=4,5мМ, VMaKC= 9,0 мкмоль Р;/ч на мг белка). Нами установлено, что способность одновалентных анионов галогенового ряда активировать «базальную» Mg -АТРазу мозга крыс снижается в ряду СГ Вг Г, a F", N032 и SCN ингибируют его.
При исследовании активности СГ-АТРазы мозга крыс установлено, что двухвалентные катионы активируют фермент в следующей убывающей последовательности: Mg2+ Mn2+ Ca2+ Co2+, а в присутствии Zn2+, Cu2+ и Cd2+ активность фермента не обнаруживается.
В исследуемых нами препаратах мозга крыс активность «базальной» Mg2+-ATPa3bi составляет 8,0 мкмоль Р/ч на мг белка. Поскольку концентрация ионов СГ внутри нейрональной клетки по данным разных авторов колеблется от 2 до 9 мМ [549], а на долю проницаемости ионов НС03 через тормозные рецепторы приходится 1/5 от проницаемости ионов СГ [550], мы исследовали влияние совместного действия ионов СГ и НСОз в таких соотношениях их концентраций, чтобы в сумме они составляли 10 мМ (рис. 79 ). В этих условиях эффект максимальной активации «базальной» Mg2+-ATPa3bi мозга крыс наблюдается в соотношениях С17НС03" 6/4 мМ и 7/3 мМ и составляет 12,2 мкмоль Р/ч на мг белка. На основе полученного максимального значения эффекта ионов НС03", мы исследовали влияние 3 мМ НС03" на «базальную» Mg2+-ATPa3y мозга животных в диапазоне концентраций СГ 0-50 мМ (рис. 80).
Предварительно мы измерили активность фермента в присутствии только ионов СГ в данном диапазоне концентраций. Они активируют «базальную» Mg2+-ATPa3y мозга крыс с максимальным эффектом при 15-30 мМ.
При одновременном внесении ионов СГ+НСОз" в среду инкубации, активность «базальной» Mg2+-ATPa3bi возрастает во всем исследуемом диапазоне концентраций СГ (за исключением 50 мМ) и имеет максимальную величину в присутствии 8-15 мМ СГ. В связи с этим мы исследовали влияние 10 мМ СГ в диапазоне концентраций 0-8 мМ НС03"(рис. 81).
Сами ионы НС03" незначительно активируют «базальную» Mg2+-ATPa3y мозга крыс. При одновременном внесении ионов СГ+НСОз в среду инкубации, в заданном диапазоне концентраций, «базальная» М2+-АТРазная активность значительно возрастает с максимальным эффектом при концентрации 3 мМ НСОз". Опираясь на полученные результаты, мы проводили дальнейшие исследования активности фермента в присутствии 3 мМ НСОз и Ю мМ СГ. Важно отметить, что такие концентрации анионов создаются в цитоплазме нейрона и в межклеточном пространстве мозга позвоночных при деполяризации постсинаптической мембраны вследствие активирования ГАМКА-рецепторов. Так, Сталей и коллеги предположили, что интенсивное активирование ГАМКА-рецепторов индуцирует СГ/НС03 -проводимость, в ходе которой транспорт СГ, направленный из экстрацеллюлярного пространства в нейрон увеличивает концентрацию этого аниона от 10 мМ, тогда как ионы НС03 транспортируются из нейрона, и их концентрация увеличивается снаружи клетки от 2 мМ [549].
Известно, что транспортные АТРазы Р-типа (Na К+-АТРаза), а также СГ-АТРаза из различных тканей ингибируются сульфгидрильными реагентами (ДТНБ, NEM) [552]. В нашем исследовании ДТНБ (10 мкМ) и NEM (10 мкМ) ингибируют СГ,НСОз -АТРазную активность мозга крыс - на 90% и 97 %, соответственно (табл. 14). Кроме того, фермент мозга животных является высоко-чувствительным к олигомицину, который полностью ингибирует СГ,НСОз"-АТРазную активность в концентрации 0,5 мкМ. Ранее было показано, что NEM (100 мкМ) также полностью ингибировал СГ-АТРазу (СГ-насос) мозга млекопитающих, тогда как олигомицин (1 мкМ) не влиял на нее [265]. о-Ванадат (блокатор протеинфосфатаз и транспортных АТРаз Р-типа) в концентрации 10 мкМ ингибирует СГ, НС03 -АТРазную активность мозга крыс на 95 % (табл. 14).
При исследовании свойств СГ-активируемой Mg2+-ATPa3bi в плазматических мембранах мозга рыб, нами было установлено, что она чувствительна к активаторам и блокаторам ГАМКА-рецепторов
