АТФазная активность в мембранах UNC и TRK мутантов анаэробно выращенных Escherichia Coli Василян, Анаит Веллеровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. В регуляции функций клетки огромная роль принадлежит мембранным ферментным системам транспорта ионов и трансформации энергии, взаимодействие которых друг с другом и с другими механизмами приобретает важное значение.

Полувековая история изучения таких систем, содержащих АТФ-азы, показала, что именно они, энергетически обеспечивая активный транспорт веществ, создают и поддерживают их неравномерное распределение между клеткой и средой и служат важнейшим регуляторним механизмом клетки. F F -АТФазы, являясь основным компонентом мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов, работают, согласно хемиосмотической теории энергетического сопряжения (Mitchell, IS6I, 1966, 1968 ), как вторичные протонные 'системы и трансформируют энергию трансмембранного протонного градиента -ди.Н, генерируемого первичными протонными системами, в энергию фосфатной связи и синтезируют АТФ. Эта же АТФаза у анаэробных или анаэробно выращенных бактерий, функционируя как первичный протонный насос, трансформирует энергию гидролиза АТФ в энергии ДиН, используемую вторичными системами для осуществления своих функций. В обоих случаях, функционируя как вторичная или первичная транспортная система, її -АТФаза взаимодействует с другими - первичными или вторичными системами соответственно косвенно через энергетический посредник -

ДІАН.

Вместе с тем, эта хю АТФаза у бактерий, согласно результатам, полученным Трчуняном с соавт. (С.М.Мартиросов, А.А.Грчу-нян, 1981,1984,1986; А.А.Трчунян, 1384,1989,1990; А.А.Трчунян И др., 1984,1986,1987,1989,1991; Martirosov and Trohounian, IS8I, 1982, IS83, 1986; Trohounian et al.,I987, 1992; Martirosov et al.,I988; Trchounian and Ogandjanian,I9o9), И высказанной на их основе гипотезе (С.М.Мартиросов и др.,. 1982; Bourd and Martirosov,1983; Trchounian et al.,I987;Trchounian, 1992 ), работая как первичный протонный насос, непосредственно взаимодействует со Еторичной - калиевой транспортной системой без энергетического посредничества ДрН и объединяется в единый механизм, ?ункционирукщий как Н^-Р^-насос. Среди Пактов, полученных е пользу гипотезы, наиболее важными представляются:

I) выведение ВТ*" через її -АТФазу в обмен на поглощение К* через Тхк (или ей подобную)систему осуществляется с устойчивой стехиометрией для n,n* -дициклогексилкарбодиимид(ДЩ{Д)-чув-ствигельных потоков катионов, равной 2Н* на один К*; 2) 2HVK*-

обмен наблюдается только при интактных как ї_лї -АТФазе, так и

1 о т_гк системе: мутации в генах, кодирующих эти механизмы, обязательно отражаются на протонно-калиевом обмене; 3) 2Н⁺/К⁺-обмен при определенных: значениях протоно-движущей силы, в сумме (0,5 В) близких "фосфатному потенциалу клетки", может реверсировать с синтезом молекулы АТФ; 4) ДІЩ-чувствительная АТФазная активность -в протопластах бактерий существенно возрастает при увеличении концентрации К* и этот феномен исчезает при imcA и trkA мутациях, ведущих к остановке ї„ї -АТФазы и Trk системы соот-ветственяо. К -зависимая ДЦКД-чувсгвигельная АТФазная активность обнаруживается также в изолированных мембранах и препаратах f.f -АТФазы. 1 о

Непосредственное взаимодействие внутри мембраны и объединение f f -АТФазы с irk системой в единый механизм с образованием мембранного суперкомплекса представляется понятным. Объединение этих систем при таких низкоз^фективных энергетических процессах в клетке, как гликолиз, приводит, по оценке Трчуня-на (1989), к экономии до 50-52 % АТФ внутри клетки и уменьшению диссипации энергии. її -АТФаза, объединяясь с Trk системой, приобретает способность не только генерировать ДДН, но и создавать высокий К⁺ градиент между клеткой и средой. Эта же АТФаза кокет синтезировать АТФ, используя наравне сДаН и К⁴" градиент. Trk система, объединяясь с її -АТФазой, работает как АТФ-зависимая система, способная создать высокий К* градиент. Высказано предположение о том, что взаимодействие мевду. этими двумя механизмами мембраны может осуществляться через ди-тиол-дисульфидные связи с переходом 2sh—*-s-s + ЇІ2 + 35 кДж, когда наблюдается выделение молекулярного водорода (вакгатуап Martirosov, 1989 ). При этом необходимо участие третьего компонента - например, формиат Бодород лиазы,- поставляющего восстановительные эквиваленты (Н⁺+ е^-) для объединенного,механизма.

Однако, механизм и регуляция такого прямого взаимодействия между т? ? -АТФазой и калиевым транспортом остаются непонятны-

ми. Не обнаруживается связи мекду шіс -опероном е.сої і , кодирующим ff -АТФазу, и trk генами, определяющими Формирование Тгк, системы. К тому же недавно Эпстайном с соавт. ( D₀3ch et ai., 1991 ) обнаружены новые trk гены, находящиеся в различных участках хромосомы, роль которых должна быть изучена. Высказано предположение о том, что Trk активность у аэробно выращенных бактерий формируется двумя механизмами, отличающимися друг от друга trk& и-trkH гено'продуктами (D₀sch et al.,I99I ). Но генетический анализ представляется недостаточным. Может ли Trk система в анаэробных условиях и при отсутствии р f -АТФазы функционировать как отдельная система и обладать АТФазной активностью? Может ли взаимодействие между у -АТФазой и Trk системой определяться trk генами? Все ли trk гены функционально активны в бактериях при росте в анаэробных или аэробных условиях?

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение ДЦКД-чувствительной АТФазной активности в мембранах, изолированных из анаэробно выращенных _Unc и trk мутантов е.соїі Были поставлены следующие основные задачи:

1. изучить ДЦКД-чувствительную АТФазную активность изолированных мембран: выявить ее зависимость от концентрации К"¹" и выяснить специфичность;

2. определить природу ДЦКД-чуЕСгвительяой АТФазной активности в изолированных мембранах с использованием мутантов е.соіі с делецией unc -оперона, кодирующего p^f -АТФазу, и дефектами в trk генах; выявить ее зависимость от условий роста бактерий и шла метаболизма;

3. выявить роль trk генов, кодирующих Trk систему, в определении зависимости ДДКД-чувствигельной АТФазной активности от концентрации К⁺; сравнить роль этих генов в росте и накоплении К* у бактерий при различных условиях.

Научная новизна работы. В работе выявлена значительная (двукратная) стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности в изолированных мембранах бактерий с помощью К*" и показано, что такая стимуляция наблюдаетсялри увеличении концентрации иъ⁺, но не Na⁺, и не сі^-, или но - С использованием мутантов е.соіі с делецией unc -оперона и с дефектами в различных trk генах установлено, что такая АТФазная активность определяется ї.т -

І о

АТФазой и стимулируется с помощью К* лишь у предшественника и trkS , но HetrkA , tricE или trkH мутантов. Стимуляция АТФазной активности с помощью К*" определяется анаэробным ростом бактерий и не наблюдается при росте в присутствии нитратов и нитратном дыхании или аэробном росте в присутствии лактата. TrkG- и trkH мутанты существенно отличаются друг от друга по: зависимости их роста от концентрации К* в среде и накоплению этих катионов в клетке.

Полученные результаты указывают на то, что зависимость ДЦКД-чувствительной АТФазной активности изолированных мембран от концентрации К* определяется її -АТФазой и Trk системой и мояет быть объяснена лишь прямым непосредственным взаимодействием этих транспортных систем внутри мембраны бактерий с образованием единого механизма. Они позволяют предположить, что trkG ген не обладает функциональной активностью в анаэробно выращенных бактериях. Они указывают также на то, что сама Trk система в отдельности не обладает АТФазной активностью и что она нуждается б АТФ, скорее всего, как в регуляторе ее активности.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования и полученные результаты о специфической стимуляции ДЩ-чувствительной АТФазной активности мембраны бактерий с помощью К* существенно расширяют сведения об АГФазных механизмах мембраны и указывают на совершенно новый факт - специфическую стимуляцию активности f.f -АТФазы в анаэробно выращенных бактериях с помощью К¹" посредством ее прямого, взаимодействия с Trk калиевой транспортной системой.

Полученные данные могут быть использованы для повышения эффективности использования бактерий и поиска новых путей направленной регуляции их жизнедеятельности в биотехнологии.

Апробация работы. Результаты исследований, приведенных в работе, докладывались на Международной конференции "Ион-движущие АТФазы. Структура, функции и регуляция" (Кливленд, США, 1992), а также на семинаре лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии Чикагского университета (Чикаго, США, 1991).

Работа апробирована на заседании кафедры физиологии и анатомии растений биологического Факультета Ереванского госуниверси-

тета от 12 мая. 1993 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 работах, в том числе 3.статьях.

Объем работы. Диссертация изложена на 95 страницах и содержит 8 таблиц и 13 рисунков. Указатель литературы включает 108 наименований литературных источников, из них 20 на русском языке. .