Введение к работе
Актуальность проблемы. Интенсивное развити исследований по
клеточной биологии в последние годы привело к карданалышм
сдвигам в понимании процессов регуляции клеточной пролиферации.
Охарактеризованы клеточные онкогены, регулирующие прохождение
клетки по митотичеокому циклу. Выявляются механизмы
злокачественной трансформации. Хорошо изучены сиотемы,
обеспечивающие реакцию клетки на внешние сигналы к пролиферации.
охарактеризованы многочисленные ростовые факторы и их рецепторы,
в целої внявлен путь п«редачи сигнала от мембранного рецептора
через внутриклеточные посредники ид геном. Из целосгной картины
пока внппдает одно звено - механизм переотроек генетического
аппарата в целом, направленный на активацию генов, ответственных
яа регуляцию клеточной пролиферации. К настоящему времени
накопилось много данных об изменениях в упаковке хроматина и
лодификации отдельных макромолекул в его составе в связи о
запуском или прекращением процесса клеточной ггролиферации, а
-анжч при других физиологических и патологических процессах -
1И$ференциропке, старении, злокачественной трансформации и других
;эболеваниях. Модификации затрагивают слагающие хроматин
акромолекулы: изменяется его белковый состав, белки подвергаются
оеттрансляционным модификациям. Изменения . нуклеинового
омпонентв хроматина в основном сводятся к ивменению степени
этилирования оснований и модификации вторичной структуры -
скоплению иди репарации разрывов ЦНК. Накопление разрывов ДНК
зпровоадает переход клеток в состояние покоя, их
іффоренцировку, сопутствует старению оранизков, сопоовождает
>йствие многих канцерогенов и может вызвать малигкизацию.
рушение репарации разрывов ДНК характерно для
;слеток больная наследственными синдромами, аутоиммунными забслзваняями, гговреждению ДЖ способетзуют стрессовые, состояния. Функциональны» изменениям подвергаются также надмолекулярные комплексы хроматина - его первичная и вторичная структура, организация доменов. Среди структур клеточного ядра особое
ВНИМ^НИЭ УДЄЛНОГСЯ ЯДОРНОМУ ШТрИКСу {СКОЛОТУ) . С НИЛ!
ассоциированы многие регуляторные последовательности ДНК, ферментативные комплексы, осуществляющие репликацию, транскрипцию и модификацию ДНК и ядерных белков. Иоллпептиднии состав ередета и ассоциация с нум раз.чичьых последовательностей ДНІ-С роагируіот на изменения физиологического состояния клетки. Однако, чрезвычайная сложность системы пока не позволяет понять общую картину событий. Чтобы в некоторой степени заполнить существуюшмЯ пробел, нами были исследованы закономерности изменения вторичной и четйвртичной структуры ДКК и характер ДНК-белковых взаимодействиі в доменах хроматина покоящихся и про.чиферируьщих клеток с цельк установить закономерности в изменениях их структуры, связанные с клеточкой пролиферацией и покоем.
Работа является логическим продолжением цикла исследований составивших кандидатскую диссертацию. С использованием оригинального метода нуклеопротэид- целит-хроматографии, позволяющего фракционировать нуклеиновые кислоты по прочности ассоциации с белками в нуклоопротеидах было обнаружено неизвестное в то время явление - ослабление прочности связи ДНК белками в ядрах клеток переходящих от пролиферации к покою. Ослабление прочности связи ДНК-белок, выраженное в меньше? степени было замечено и при действии многих противоопухолевых ореларгтое. Были начаты исследования механизмов обнаруженных явлэнии и была предложена гипотетическая модель оргониРации
- з -домене хроматина, согласно которой обнаруженные явления объяснялись внесением разрывов ДІЖ. Однако, произвести экспериментальное доказательство гипотезы тогда не удалось. При завершении работы над кандидатской диссертацией была предложена новая модификация метода, значительно увеличившая его разрешающую способность. В то же время под сомнением оказались многие результаты, полученные при помоіци старой модификации метода.
В настоящем исследовании основное внимания уделено исследованию молекулярного механизма перестроек доменов хроматина при изменении пролг.ферат, -ного статуса клетки. Для етого были подробно изучены ДШ-бедкоада взаимодействия в ядерных суботруктурах. Проведено картирование разрывов ДНК, вносимых нуклоазами в домене хроматина. Перестройки хроматина,связанные
0 изменением прелиферетивного статуса клетки исследовались на
хорошо охарактеризованных моделях при помощи метода
НЩ-хроматеграфии в ковоі! модификации, данные которой позволяют
производить корректную трактовку результатов.
Дели и задачи исследования» Целью работы било установить закономерные изменения в структуре доменов хроматина, сопутствующие процессам пролиферации и клеточного покоя. В основном мы опирались на данные о характере связи ДНК о белками ядерного магрикоа и хроматина, полученные при помогай оригинального метода нуклеопротеид-цеміт-хроматогрвфии. Для правильного понимания физиологических изменений в структуре хроматина били исследованы особенности ДНК-белкових взаимодействий в оуОкомпартментах домена. Ныли поставлены следующие конкретнее задачи;
1 .Идентифицировать пики ДНК на НЩ-жроматограммах
дезоксирибонуклеопротгднвми комплексами субструкту^ клеточного
ядра.
г.Иоолодоьать прочность взаі-модейсший ДНК с различными
субкомпонентами ядерного мвтрмкса.
3.Охарактеризовать белковый компоне.чг различающихся по прочности
нуклвогсротеидов ядерного матрикса.
4.Исследовать характер ДНК-белкових взаимодействий во фракциях
яромчтина, различающихся г.о транскрипционной активности.
5.Для оценки характера физиологических изменений б структуре
доменов хроматина провести На модельных системах исследование
влияния разрывов ДНК, вносимых нукл'взами с известным механизмом
действия на характер вссогуївции домонв с ядерным юзтриксом.
6, Исследовать измэнения в ассоциации ДНК с белками, ядерного
матрикса и хроматина при переходе клеток от пролиферации к покою
и обратно на нескольких моделях.
7.Исследовать сопутствухп;яе измвнешям пролифвратиеного статуса
клетки нарушения вторичной структура ДНК и изменения степени ее
суперспиралмзации.
8. Исследовать распределение разрывов ДНК, связанных с состоянием
клеточного покоя во фракциях ДНК, различающихся по структурной
сложности и функциональной активности.
Научная новизна рибиты. В настоящей работе впервые:
- обнаружен феномен открепления ДНК от ядерного ыатрикоа при
переходе клеток в Состояние покоя.
- описано накопление двунитевнх разрывов ДНК в покоящихся
клетках и их репарация при возобновлении деления.
проведено картирование разрывов, вносимых различными нуклоазами з доменах хроматина.
- выявлены белки ядерного матрикса, образующие различающиеся пс
прочности комплексы о ДЖ.
- обнаружена гетерогенность прочно связанных о ДНК белков по
природе ДНК-белковых взаимодействий.
- обнаружены изменения п степени оуперспирализации ДНК в ходе
развития опухолей.
количественно охарактеризована прочность ДНК белковых взаимодействий в трэнекрилционно активном И неактивном хроматина.
- описаны'3 типа частиц хроматина» различающихся но прочнооти
связи ДНК-белок.
- обнаружено обогащение разрывами ДНК фракции активного
хроматина в покоящихся клетках.
выявлен неслучайный характер распределения разрывов ДНК, возникающих в покоящихоя клетках, в повторяющихся последовательностях и структурних генах.
- на основании данных диссертации разработана модель структури
домена ДНК в покоящейся и пролиферирующей клетке.
Научно-практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы в разработке новых подход&э для оценки отепени дифференцированности и пролиферативной . активности опухолей, что важно vw выработки тактики и оценки эффективности терапии опухолей. Разработанные в исследовании подходы смогут быть использовани при изучении механизма действия цитостатическ.их и стимулирующих пролиферацию <$ермакологических препаратов.
Основные положения, кыноснше па защиту. 1. В клеточном ядре выявляются 3 типа ДНП, различвнцтхоя по прочнооти связи ДНК-Аелок - ДНК О, ДНК I, ДНК II. Домены хромзтина ассоциированы с ядерным окелетоы посредством олвбой (ДНК I) и прочной (ДНК II) ояязей. Связи образованы различными группами Оелков ядерного матрикоа. Места образования связей разделены пространственно.
2. По прочности связи ДНК-белол їзс'їицн хроматина (Д1ІК О)
гаэдвдяктгоя на 3 класса - диссоциирующие в 1Ь' 2М, и ЗМ МаС1.
Активный хроматин обогащен 1М и ЗМ частицами, неактивный - ^М.
-
Белки, сохраняющие соязь с ДНК после ее делротеинизации гетерогеины по прочности связи о ДНК. сни образуют все три типа вышеупомянутая связей, а кроме н х, еще к ковалентные комплексы.
-
В пролиферирухнцих клэтках животных все ДНИ ядра ассоциирована - связаны мекду ссСой непрерывной молекулой ДНК. Яри переходе клеток в состояние покоя в молекулу ДИН вносятся двунитевие равриьы, когорые приводят к разобщению ДНК-белкоьнх комплексов дом?нов хроматина. Это проявляется как открепление части хромвглнп от адерного матрикса и разобцениэ ДНК II її ДНК I-
*?. Разрыва, приводящее к разобщению ДШ распределены по геному нер^^яначэрно - ими osorauieha несвязанная с матриксом фракция хроматина, транскрчпционно-вктивнчЛ хроматин, повторяющиеся последоевтельности.
Алро5ііщія диссертации. Результата работы доложены и обсуждены на: XVI и XX конферакдаях КВО (Москаа.,1984; Вудапешт,1990); XVI конкуренции ЙвропейоКэго общества по мутагенам внешней среди (Москва, 1S84); VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985); XI Европейском рабочем совещании по ядру (Суздаль, 19Ё9); Международном симпозиуме "Митоз и трансмиссия хромосом'1 (Ленинград, 19Э0); VIII, IX и X Всесоюзны:: симпозиумах "Структура и фу ниши клеточного ядро" (Пудино, 1984; Черноголовка, 1987: Гродно, 1990); V Всесоюзном биохимическом съезде {Ниав, 15Ьб); VI Всесоюзной вколе молодого биолога (Дудаьбо, 1988); Всесоюзних совещаниях "Актуальные вопросы клеточной Г-иологии" (Ленинград, 1989, 1990); VII Ное-
- 7 -
союзном симпозиуме "Молекулярна? механизма генетических
прсцесоов" (Москва, 1990); Всесоюзной тколе-семиняре "Молекулярная
биология и медицина" (Ленинград, 1990); II Всесоюзном совещании
"Генетика развития" (Ташкент, 19У0); III" Всесоюзном симпозиуме
"Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1391); I Всесоюзной
шісоле-семиняря "Ловреяедения ДнК лейкоцитов человека
генотоксическьмч агентами производственной и орруяесощей среди" (Ивано-Франковск, 1991); III Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекти молекулярной биологии" (Самарканд, 1991): VII конференции онкологов Прибалтика (Яалакга, 1990); VII конференции биохимиков Прибалтики (Каунас, 1Э90); Конференции молодых ученых Киевского НИИ рентімиологии, радиологии и онкологии (Киев, 1988); 1 конференции врачея-лаОорантев Латв.ССР (Рига, 1981). На заседаниях Латьииоких обществ биохимиков (1988, 1990), генетиков и селекционеров (1963, 1091), медицинских генетиков (1939). На г.'.емаборяторньчс конференция): в Латвийском НИИ вксперименталыюй и клинической медицины. Институте микробиологии ЛатвиЛсиоЛ АН, .ЧИЙ онкологии им проф. ГГетровэ, Институте органического синтеза ЛАП.
Публикации. По материалам диссертации получено авторское свидетельство СССР на изобретение ("Способ определения прочности овяби ДНК-белок с нуклеопротеида*" И 1440892), опубликованы 55 научннх работ включая 1 монографию, 3 статьи в междунэродлих изданиях, 10 - вс всесоюзных, 7 - республиканских. Тезисов докладов на международны* конференциях - 5. всесоюзных И межреспубликанских - 19, республиканских - 2.
Объем и структура диссертации. Диссертация мэлокепа ііа ЭЭЗ отрвг.ицчх машинописного текста, включая 50 рисунков. Работе состоит из ішедеиия, обзора літератури, материалов и методов,
- a -результатов исследования, обсуздения, заключения и выводов. Указатель литературы содержит 309 ссылок на русском язьке и 546 на иностранных.