Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди фитопатогенов, ответственных за инфекционные заболевания сельскохозяйственных культур, значительную часть составляют грибы. Взаимоотношения между высшими растениями и грибами-патогенами очень сложны и включают в себя применение различных химических соединений как со стороны грибов (в частности токсинов и ферментов), так и со стороны растений (в т.ч. ингибиторов, ферментов и фитоалексинов). Одним из компонентов системы, используемой грибами для нападения на растения и разрушения их тканей, являются гидролитические ферменты. Из литературных данных известно, что внеклеточные протеолитическне ферменты фитопатогенньгх микроорганизмов способны играть определенную роль в инфекционном процессе, вызываемом ими у растения-хозяина. Эти данные позволяют судить о некоторых функциях внеклеточных протеиназ грибов в инфекционном процессе (McHenry et al., 1996), но четких доказательств их участия в патогенезе на настоящий момент очень мало.
Белковые ингибиторы протеиназ широко представлены во многих видах высших растений. Предполагается, что основными функциями белковых растительных ингибиторов являются: 1) регуляция активности эндогенных протеиназ, 2) участие в пуле запасных белков и 3) создание защитного барьера против атаки насекомых-паразитов и фитопатогенньгх микроорганизмов (Ryan, 1973; Мосолов и Валуева, 1993).
~ Ранее было показано, что ингибиторы протеаз из семян высших растений способны подавлять рост ряда микромицетов (Halim et al., 1973; Mosolov et al., 1976). Кроме того, в работах японских ученых (Ikeda and Kusano, 1983; Kiyohara and IwaSaki, 1985) было показано присутствие в семенах гречихи ингибиторов трипсина (ИТ), различавшихся по молекулярной массе, изоэлектрической точке и аминокислотному составу. Однако не была исследована возможность участия выделенных ИТ в регуляции роста и развития патогенной микрофлоры и активности протеиназ фитопатогенов.
Цель и задачи исследования. С целью изучения факторов, участвующих во взаимодействии патогенного гриба и растения-хозяина, в настоящей работе ставятся следующие задачи: 1.Выделение, очистка и характеристика ингибиторов протеолитических ферментов
из семян гречихи, способных ингибировать секретируемые протеиназы несовершенных грибов Alternaria alternata и Fusarium oxyspomm, возбудителей альтернариоза и фузариоза.
-
Изучение действия ингибиторов протеаз из семян гречихи на рост и развитие A. alternata и F. oxyspomm.
-
Изучение условий, влияющих на синтез и секрецию внеклеточных протеаз А. alternata и F. oxyspomm.
-
Выделение, очистка и изучение свойств внеклеточной протеиназы A. alternata.
Научная новизна и практическая ценность. Из семян гречихи выделены и очищены до электрофоретически гомогенного состояния новые ингибиторы сериновых протеиназ, не действующие на эндогенные ферменты, но подавляющие активность протеиназ фитопатогенных грибов. Кроме того, выделен новый фермент - внеклеточная сериновая трипсин-подобная протеиназа Alternaria alternata. Анионный ингибитор трипсина из семян гречихи (ИТ-1) на основании установленной аминокислотной последовательности был идентифицирован как член семейства картофельного ингибитора I. Доказано, что ИТ-1 заметно отличается от других белков, отнесенных к этому семейству, по ряду свойств (молекулярной массе, специфичности и строению реактивного центра). Полученные данные существенно дополняют современные представления о процессах, сопровождающих инфекционные заболевания растений. Результаты исследования позволяют предположить, что ИТ-1 является одним из компонентов защитной системы растений и может быть использован при селекции растений, устойчивых к грибной инфекции.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на III симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), конференции "Мо-лекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, Украина, 1994), IX конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Брно, Чехия, 1994), XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), III конференции EFPP "Environmental Biotic Factors in Integrated Plant Disease Control" (Познань, Польша, 1994), XIII международном конгрессе по защите растений (Гаага, Нидерланды, 1995), VI международной конференции "Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology, the Legacy of Andrey Belozersky" (Москва, 1995), на IV симпозиуме "Химия протеолитических
ферментов" (Москва, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками. Указатель литературы содержит 363 работы.