Введение к работе
Актуальность проблемы. Ядра клеток хивотиих. к человека содержат ДНК—эндонуклеазу, активируеную нонапи Са a Hg , - Ca/Mg--зависнмую эндонуклеазу. Выявление феркента Hevtiah и Burgoyne [1973] способствовали активные исследования хрокатина. для которых Са/'Мс-зависиная эндонуклеаза представляла интерес как фактор, обусловливавший деградацию ДНК хрокатина з ходе вкделения клеточных ядер, ffyllie [1980] было установлено, что Ca/tSg-зависикая эндонуклеаза катализирует расдепление ДНК хроматина при клеточкой гибели СапоптозеЭ тнноцятов in vitro. Впоследствкж эндокуклеазо-—зависимый апоптоз был показан зо яногих тканях. Он признан в настоягкее вреня наиболее частой причиной нормальней клеточной гибели, и является на сегодняшний день единственной известной Функцией Са^Нз*зазисиной зндонуклеазы. .
Параллельно, в 70-90 годах исследованы 2 других типа ДНК--разрезагади;; фериентов, так»? присутствующих в кжгточных ядрах: апуриновые/ашфинидиновьк зндонуклеазы САП-эндояуг_леазьО и ДНК— —топокзоизразы. АП-эндонуклеазы катализируют in vitro реакцию гидролиза ДНК вблизи сайтов апуриннзации. что дает основание предполагать участие этих ферментов в репарации ?ДК. Топоизоме— разы катализнруггг сочетанную реакцию разрезания-отивания ДНК, в связи с чек участвуют о процессах деконденсацки я упаковки хрона-тчна, устраняют Еознякаюяие зацепления иолекул ДК. катализируют рекокбкнацня ЯНК. Исследований, направленных на установление взаи-ноотнопакий топоизомераз ч АП-зидснуклзаз с Са/ЇІ-завнсимой зндо— нуеляазой не проводилось. Инфорнация об АП-эндонуклеазах ч топои-зокеразах по достоверности н полноте значительно превышает знания о Сг^Ка-заЕксн::ой зядонуклеазе, кленнрозаны гени этих ферментов из нескольких орг?.ннзяов.
Но аналогии с прокариотами CE.coli) ногшо предполагать существование у угиэотнкх нескольких зкденуклеаз и 2^ изофоря, способи:^ не только катализировать гидролиз ДНК в пгбиущей клетке, но к уничтожать чуякродкуж ДНК. участвовать о рекоябинадяи ка зтапах ра-реоания рецкпкентпой и донорской ДІІК иля разрепения крестообразных структур, катализировать асе виды репарации ДНК. Ряд хоезониьк данных укззызает на судаствовзн.'е зля функций у эидонуклеез ядра,' на :гх роль в ийяертализачни к опухолевой трг.нс-
формации клеток, вирусной инфекции и в других.процессах в клетке. Многочисленные попытки выделить Ca/Hg-зависинуго эндонуклеазу привели к накоплении ряда противоречивых данных о физико—химических и каталитических свойствах этого фермента. Дахе ферменты, выделенные из одного организма, по, данным разных авторов отличаются по молекулярной массе, изоэлектрическоЯ точке, оптимуму рН, кати-оиозавислности, и субстратной специфичности. Имеются работы, свидетельствующие о суяествовании других катионозависиных эндонукле-аз наряду с Ca/tlg-зависимой эндонуклеазой, или об отсутствия последней. Дефицит данных, полученные на чистых белковых препаратах, приводит к недостатку базовых знаний об эндонуклеазах ядра, задергивает исследование механизмов их регуляции и клонирование их генов.
Цель и задачи исследования. Основной цолья кастоя&ен работы являлась разработка и экспериментальное обоснование концепции множественности ядерных ДНК-зндонуклеаз. В качестве глазного объекта исследования выбрана печень крыс как наиболее изученная в этом отношении ткань.
В соответствии с целыз исследования Были поставлены следуюкяе задачи:
— иссследовать гетерогенность ядерных зндонуклеаз на основе анали
за фрагментации ДНК хроматина в изолированных клеточных ядрах.
печени крыс;
разработать методы выделения ядерных зндонуклеаз и топоизочера-зы I из ядер печена крыс;
охарактеризовать полученные зндонуклеазы по физико-химическим и каталитический свойствам, сравнить их с известными ДНКазаки;
— определить изменения актнзкости отдельных ядерных эндоьуклеаз
и топоизокеразы I при имнортаяизации и опухолевой трансформации клеток печени крьгг. фибробластов крыс и человека, кератчноцитов человека.'
Научная новизна. Основнім результатом диссертационной работы явилось доказательство существования несхольхих ДНКаз в клеточных ядрах печени крыс, различающихся по физико-химическим и каталитическим свойствам, а являющихся по-видимому изофорнани Ca/tig-зави-синой зндонуклеазы.
Впервые разработаны схены разделения ядерных эндонуклеаз, позволяющие параллельно получать несколько препаратов зндонуклеаэ и препарат топснзонеразы I близкие к электрофоретической гояоген-иостк. На основании данных о свойствах, субстратной специфичности, и иммунофернектного анализа показано подобие отдельных эндонуклеаз описанным ранее ДНКазан: Са/"М#-зависяиой эидонуклелэе, АП-эндонуклеазе и нейтральной ДНКазе из печеня крыс. Некоторые феркекты выделены впервые. Определена прииерная представленность ДНК-разреэающкх ферментов в клеточных ядрах по белку к по актив-сти. Показана способность эндонуклеаз ядра нестохасткчески рас-плять реконбинационныа вставки в плазкиде рБК322» отдельные пос-довательности в составе ДИК парвовируса МУМ я SalGl-PvuII сегпен-та пдазнкды pUCL9, а также повторы Cot<10~* к кеждинуклеосокнье линкеры в хроматине печени крыс. Кнкортализацгя и опухолевая трансфсрнацкя клеток в нескольких испытанных иоделях сопровождалась снижением активности топоизонеразы I и эндонуклеаз с высокий Ca/Hg-синергизмок, и увеличением активности Мп-зависимой зкдонуклеазы. Выявлена способность одной из эндонуклеаз стняулл-розать внеплановый синтез ДНК при введения з полупроницаемые слетки китайского хояячка. Получены косвенные яэккые, указывающие на роль протеолктнческого процессинга в регуляции количества и активности ядерных эндонуклеаз.
Теоретическая и практическая значимость работы. Множественность эндонуклеаз является основой функциональной гетерогенности зтой группы фернентов животной клетки, обеспечиваяией процессы деградации ДНК при клеточной гибели, репарации, репликации, рекомбинации, ограничения прониг.нозекия чужеродной ДНК а клетку. Знание пехаиизков разрезания ДНК и участия в этой процессе эндонуклеаз инеят значение для поникания мгхакнзиов канцерогенеза, вирусной кнфакцни, лучевого поражения клеток, нарушений икнуниой снетекы орггнизна.
В ход» решения поставленных задач разработаны новые методы определения активности и субстратной специфичности ДНКаз, создана катенатическая модель действия адно-дпуударкых эндонуклеаз на кольцевые ДНК. С использовакиен полученного препарата топоизоке-разы I предложен способ определения количества кольцевых ДНК в бактериях и тест для диагностики системной склеродермии среди
других системных заболеваний соединительной ткани, который пробел испытания в клинической практике.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на IV а У Всесоюзних биохимических съездах (Ленинград, 1979, Киев. 1936), Конференциях" по програнне "Ген" АМН СССР (Москва.1981,1983), Всесоюзной конференции по применении ферментов Б биохимических анализах (Паланга,1984 ), V Всесоюзной сиипозиуне по недицинской энзимологии (Махачкала,1986 ). Всесоюзной сиипозиуне по биохимии сельскохозяйственных животных (Ташкент,1986), Совещании по молекулярным механизмам канцерогенеза (Пущино.1987), IX Всесоюзном симпозиуме «Структура и Функция клеточного ядра» (Черноголовка,1987 ), Сиипозиуне "Репликация эукариотической ДНК" (Колд Спринг Харбор.1989), 30-й конференции по клеточкой биологии (Сан Диего,1990), Мзкдуяародной конференции по склзрсг,с:Р"ИИ и схлеродсрккя-яодобным заболеваниям (Варшава,1991 ).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 160 страницах текста, содержит 53 рисунка н 29 таблиц. Список литературы включает 466 источников.