Введение к работе
,.'';"'
Актуальность проблемы. Общеизвестно, что азотное питание растений является одним из важнейших факторов их роста и развития. Дефицит азота в почве приводит к снижению урожая и, в конечном счете, обуславливает дефицит белка - проблему, имеющую глобальное значение. В увеличении содержания связанного азота в почве существенную роль играет биологическая фиксация молекулярного азота. Этот процесс осуществляют микроорганизмы - свободноживу-щие или развивающиеся в прикорневой стстеме, либо в симбиозе с растениями. Все они содержат фермент нитрогеназу (КФ І.І8.2.І.). Наиболее хозяйственно важными среди азотфиксирующих микроорганизмов являются бактерии рода Rhizoblum , образующие клубеньки на корнях главным образом бобовых растений / Кретович,1987 /. Эти растения, увеличивая количество связанного азота в почве, кроме того,сами являются хорошим источником кормового и пищевого белка. В нашей, стране одной из важнейших зернобобовых культур является люпин. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что продуктивность растений в большой степени определяется, начальными этапами усвоения неорганического азота, которое сводится в конечном счете к ассимиляции аммиака, образующегося в бактериальной части азотфиксирующих клубенькоз, путем включения в аминокислоты и амиды. Поэтому выяснение механизмов ассимиляции аммиака, изучение свойств и регуляции ферментов, осуществляющих эти процессы в клубеньках бобовых растений, является основополагающим при исследовании симбиотической азотфикса-ции.
До недавнего времени считалось, что в бактероидах происходит лишь фиксация молекулярного азота, а ассимиляция образующегося аммиака полностью осуществляется в растительной части клубенька - цитозоле, под действием глутаминсинтетазы (КФ 6.3.1.2.) и глу-таматсинтазы (КФ I.4.1.13.). Однако, в настоящее время есть данные, которые позволяют заключить, что связывание аммиака происходит также и в самих бактероидах путем включения в глутаынн, глутаминовую и аспарагиновую кислоты. Одним из возможных путей связывания аммиака в бактероидах может быть также образование аланина, так как эта аминокислота заметно преобладает среди
свободных аминокислот бактероидов R. lupini в условиях интенсивной азотфиксации / Шапошіиков,1977 /. Полагают, что основным путем новообразования аланина у микроорганизмов является путь восстановительного аминирования пировиноградной кислоты, осуществляемого had —зависимой аланішдегидрогеназой (КФ І.4.І.І.). Этот фермент довольно широко распространен у бактерий, в том числе и у азотфиксирующих / Озолинь,1966 /. Следует отметить, что к началу нашей работы в литературе имелись данные об ала-ниндегидрогеназе только из двух азотфиксирующих объектов -цианобактерии Anabaena cylindrica /Rowell,Stewart, 1976' / и симбиотической азотфиксирующей бактерии Rhizobium japonicum / Dunn,Clucas,1973; Muller,Werner, 1982 /. Авторы ЭТИХ работ предполагают, что аланиндегидрогеназа может играть определенную роль в ассимиляции аммиака.
Цель и задачи исследования. Учитывая возможную роль аланин-дегидрогеназы у симбиотрофных азотфиксирующих бактерий в асси- . милиции аммиака, образующегося в процессе азотфиксации, или же в снабжении свободноживущих бактерий источниками углерода и азота, главной целью настоящей работы было изучение аланинде-гидрогеназы бактероидов RhizoMum lupini.
Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:
-
исследовать синтез аланина целыми изолированными бактероидами R. lupini из аммиака и различных источников углерода;
-
выделить аланиндегидрогеназу в гомогенном состоянии, изучить её структурную организацию и определить некоторые физико-химические свойства;
-
исследовать специфичность и кинетику действия аланиндегидро-геназы;
-
изучить регуляцию активности и синтеза исследуемого фермента. Научная новизна работы. В результате проведенной работы показано, что целые изолированные бактероиды R, lupini из аммиака и источников углерода (сахароза,пируват) синтезируют главным образом аланин. Максимальное количество аланина образуется при использовании аммиака, пирувата и наш , что свидетельствует о возможной причастности к этому процессу аланиндегидрогена-зы.
Аланиндегидрогеназа обнаружена в виде двух молекулярных форм, незначительно различающихся по электрофоретической подвижности. В условиях интенсивной азотфиксации в бактероидах преобладает форма ( > 90% суммарной активности) с меньшей электрофоретической подвижностью.
Аланиндегидрогеназа бактероидов R« lupini получена в гомогенном состоянии (степень очистки ~1000, выход около 4%). Ферментный препарат содержал обе формы в соотношении, равном исходному, и не содержал посторонних белков.
Молекулярная масса аланиндегидрогеназы равна 180 кДа. Показано, что исследуемый фермент обладает олигомерной структурой -состоит из четырех идентичных мономеров молекулярной массы 41 кДа. Впервые для аланиндегидрэгеназ изучена четвертичная структура фермента методом электронной микроскопии. Показано, что идентичные мономеры в молекуле аланиндегидрогеназы из бактероидов R» lupini расположены с диэдрической точечной группой симметрии 222 ( D2 ) П0 вершинам искаженного тетраэдра.
Изоэлектрическая точка аланиндегидрогеназы (5,05) свидетельствует о том, что фермент по этой характеристике не отличается от других ферментов ассимиляции аммиака у Rhizobium lupini.
Аланиндегидрогеназа бактероидов R- lupini t в отличие от аланиадегидрогеназ из других объектов, обладает строгой специфичностью по отношению к субстратам и кофактору. Фермент не-, активен с ь-аспартатом, L-глутаматом, 2-оксоглутаратом, лактатом, оксалоацетатом, а также с uadph.
Кинетика действия фермента характеризуется отрицательной неоперативностью, что может играть заметную роль в регуляции его активности. Ключевую роль в регуляции активности алпнинде-гндрогенази играют субстраты (аммиак, пируват и аланші). В регуляции-синтеза исследуемого фермента также основная роль принадлежит субстратам.
Совокупность полученных в работе данных свидетельствует о том, что в азотфиксирующих бактероидах н. lupini аланиндегидрогеназа играет определенную роль в ассимиляции аммиака и является, вероятно, основным ферментом синтеза аланина.
Практическая значимость. Полученные в работе данные расширят1 и углубляют представления об азотном метаболизме азоіфикснруп.иїх
корневых клубеньков люпина и об участии бактериального компонента симбиотической системы в ассимиляции аммиака, а также о связи ассимиляции аммиака и биосинтеза аминокислот с углеродным обменом. Полученные результаты могут быть использованы при селекции клубеньковых бактерий и определении факторов, влияющих на продуктивность бобовых растений.
Апробация работы. Результаты работы докладывались: на УІІ Всесоюзном Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Тбилиси,1983); на 16-й Конференции ФЕБО (Москва,1984); Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе"(Пущино, 1985).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заклкь. чения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 179 названий, в том числе 57 на русском языке.