Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка, основной этап которого - трансляция - осуществляется на рибосомах. Для прокариотических рибосом хорошо и достаточно подробно- изучены все стадии инициации и элонгации белкового синтеза, имеется множество данных о структурной организации и расположении на рибосоме различных функциональных центров (Oakes et al., 1990; Карпова, Кнорре, 1991; Rinke-Appel et al., 1993; Bhangu et al., 1994). Более сложный процесс трансляции, происходящий в эукариотических системах, изучен хуже, а рибосомы человека на момент начала настоящей работы не были исследованы вовсе. Для изучения процесса трансляции на рибосомах человека необходимо иметь в препаративных количествах функционально активные рибосомы и другие индивидуальные компонента аппарата трансляции. Практически единственной нормальной тканью человека, доступной в больших количествах, является послеродовая плацента. Однако серьезным недостатком этой ткани является высокое содержание в ней РНКазной активности, что существенно осложняет выделение функционально активных рибосом, содержащих целую рРНК.
В 1989 г нами была описана методика выделения функционально активных 40S и 60S субчастиц из замороженной плаценты человека, содержащих практически полный набор рибосомных белков (Бабкина и соавт., 1989). Однако рРНК в субчастицах была деградирована. В связи с этим на первый план выдвигалась проблема разработки методики выделения функциональйо активных рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих целую рРНК.
Взаимодействие рибосомы с мРШ и аминоацил-тРНК, осуществля-пдееся с помощью различных белковых факторов, является центральным событием на всех стадиях трансляции. Чтобы установить, как мРНК и аминоацил-тРНК взаимодействуют с рибосомой в процессе трансляции и как рибосома координирует функционирование этих биополимеров, необходимо иметь информацию о структурных элементах рибосомы, взаимодействующих с компонентами аппарата трансляции (или окружающих их) на различных этапах биосинтеза белка. Наиболее информативным подходом для решения этой проблемы является метод аффинной модификации рибосом реакционно способными производными компонентов аппарата трансляции (аналогами мРНК, тРНК, ATP, GTP и т.д.) в составе модельных комплексов, имитирующих различные функционально значимые состояния рибосом. С ис-
пользованием этого подхода получено множество данных о структурно- функциональной топографии рибосом E.coli (Карпова, Кнорре, 1991; Bhangu et al., 1994; Rinxe-Appel et al., 1993).
Эукариотические рибосомы изучены в этом отношении гораздо слабее, причем подавляпцая часть исследований выполнена в упрощенных модельных системах, когда взаимодействие мРНК и тРНК (или их аналогов) с рибосомой осуществляется без участия факторов трансляции. Единственным функционально-значимым состоянием рибосом, которое может быть получено в таких системах, является претранслокационное состояние с кодон-антикодоновыми взаимодействиями одновременно в* Р- и А-сайтах (в Р-сайте таких комплексов находится деацилированная тРНК, а в А-сайте - дипептидил-тРНК). Недавно в нашей лаборатории в составе таких комплексов с использованием алкилируицих производных олигоуридилатов была изучена область кодон-антикодоновых взаимодействий 80S рибосом из плаценты человека (Malygin et al., 1994), в с помощью реак-ционноспособных производных олигорибонуклеотидов AUGUn (п=0,3) был исследован мЕНК-связываодий центр рибосом из плаценты человека в составе 40S комплексов инициации, образованных в присутствии эукариотического фактора инициации eIF-2 (Mundus et al., 1993).
Цель работы. Целью настоящей работы явилось:
а) выделение рибосомных субчастиц из плаценты человека, со
держащих интактную рРНК;
б) создание бесклеточной белоксинтезирупцей системы, содер
жащей 60S рибосомы из плаценты человека, синтетические мРНК
(или их реакционноспособные аналоги), белковые факторы и другие
компоненты эукариотического аппарата трансляции;
в) изучение аффинной модификации 80S рибосом из плаценты
человека реакционноспособными аналогами мРНК- [4-Ы-(2-хлорэтил)-
н-метиламино)бензилметил-5'-фосфамидными производными олигори
бонуклеотидов [32p]pAUGun (п= о, з, б) и г'.з'-о-и-ьыг-хлор-
этил)-ы-метиламино]бензилиденовым производным AUGU3C32P]pC в
составе комплексов, полученных в белоксинтезирупцей системе.
Научная новизна. Впервые изучена аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов [32P]pAUGUn (п= 0, 3, 6) с алкилирупцей группой на 5'-конце и производным AUGU3[32p]pC с алкилирупцей группой на 3'-конце в составе комплексов, полученных в белоксинтезирупцей системе. Использование этих аналогов мРНК позволило
просканировать область рибосомы, расположенную с 5'-стороны по отношению к декодирующему сайту и получить информацию о структурных элементах рибосомы, расположенных вблизи 3'-стороны колона, связанного с тРНК в Р-сайте. На основании полученных результатов" изданных по аффинной модификации рибосом производными олигоуридилатов предложена схема расположения "матрицы" на 80S рибосомах, согласно которой 5'-сторона кодона, связанного в Р-сайте, находится вблизи участков 18S рРНК внутри фрагмента 975-1172, а З'-сторона этого же кодона - вблизи белка S3a. Не фиксированная кодон-антикодоновым взаимодействием 5'-сторона матрицы образует петлю (или изгиб), что позволяет ей контактировать со структурными элементами рибосомы (последовательностями 18S рРНК внутри фрагментов 593-674 и 1748-1869 и белками S3 и S3a), которые расположены вблизи 3'-стороны участка кодон-антикодсновых взаимодействий.
Практическая ценность. Разработан метод выделения рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих интактную рРНК, основанный на использовании свежей, без предварительного замораживания и хранения, плаценты. Для изучения механизма биосинтеза белка на эукариотических рибосомах создана бесклеточная белок-синтезирувдая система, состоящая из 80S рибосом из плаценты человека, синтетической матрицы (или ее реакционноспособного аналога) и фракционированного лкзата из ретикулоцитов кролика, не содержащего эндогенных рибосом.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы. Результаты работа докладывались на 3^ Германо-Российском рабочем совещании по биотехнологии (Берлин, 1994).
Структура работы. Диссертация 'изложена на 175 страницах, состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. В главе I представлены сведения о структурно-функциональной организации эукариотических рибосом (проанализированы данные за последние 20 лет). Глава 2 представляет собственные исследования и обсуждение результатов. Экспериментальная часть описана в главе 3.