Введение к работе
Актуальность темы. Ферменты обмена нуклеиновых кислот играют ключевую роль в метаболизме клетки, обеспечивая протекание таких жизненно важных, процессов, как репликация, рекомбинация и репарация генетического материала. Особую группу составляют ферменты обмена нуклеиновых кислот, выделенные из. термофильных и некоторых мезофильных микроорганизмов, которые обнаруживают свойства термостабильности и термофильности. Благодаря своим уникальным свойствам, эти ферменты находят широкое практическое применение. Наиболее ярким примером является использование термостабильных ДНК-полимераз в циклической полимеразной реакции, секвенировании и ряде других современных методов молекулярной биологии и генетики. Несмотря на значительный прогресс в изучении термостабильных ферментов, их физико-химические свойства, а также механизмы функционирования исследованы недостаточно. В частности, сравнительно мало изучены механизмы взаимодействия термостабильных ДНК-полимераз с субстратами и особенности репликации ДНК у термофильных микроорганизмов. Также весьма ограничены сведения о свойствах термостабильных ферментов, используемых для гидролиза нуклеиновых кислот. Исследование свойств этих ферментов играет важную роль в разработке новых технологий получения компонентов нуклеиновых кислот.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось выделение и изучение свойств некоторых практически значимых ферментов обмена нуклеиновых кислот, разработка на их основе новых технологий получения компонентов нуклеиновых кислот. В работе были поставлены следующие задачи:
выделить термофильные нуклеазы из гриба Spicaria violacea и изучить их физико-химические свойства и субстратную специфичность;
разработать новой способ получения 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-мо-нофосфатов;
разработать новый метод выделения ДНК-полимеразы из термофильной бактерии Thermus aquaticus;
изучить свойства ДНК-полимеразы Taq и исследовать эффективность взаимодействия праймеров различной длины с ферментом. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе изучены термофильные нуклеазы из мицелия гриба Spicaria violacea. Впервые был получен гомогенный препарат нуклеазы, определены некоторые физико-химические свойства и субстратная специфичность фермента. Разработан способ получения 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-мо-нофосфатов на основе гидролиза ДНК нуклеазами из гриба Spicaria violacea и проведены промышленные испытания данной технологии.
В работе также был предложен эффективный способ выделения ДНК-полимеразы из бактерии Thermus aquaticus, который внедрен и в настоящее время используется для получения фермента на Омутнинском химическом заводе. Были исследованы физико-химические свойства ДНК-полимеразы Taq и впервые изучена эффективность взаимодействия олнгонуклеотидов-проммерой раі/іичнсц "Элины с этим срермчнтом. Нами найдены величины Км и Умакс для праймеров oligo(dA)n , где п—2-14. Показано, что величины -IgKM и IgWiaKC линейно возрастают с увеличением длины праймера до п=10. При увеличении длины праймера на одно нуклеотидное звено (в интервале п=2-10) происходило возрастание его сродства к ферменту в 3.3 раза. Сделано предположение о том, что оптимальный размер праймера равен 10 нуклеотидным звеньям.
Структура работы. Диссертация включает 114 стр. машинописи, 24 рисунка, 11 таблиц и список литературы (113 ссылок). Работа состоит из введения (2 стр.), обзора литературы (28 стр.), описания материалов и методов (13 стр.), описания полученных результатов и их обсуждения (45 стр.), а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения (22 стр.)
Публикации. По материалам опубликовано 4 печатные работы и поданы 2 заявки на патент.