Содержание к диссертации
Введение
Список сокращений 6
1. Обзор литературы 7
1.1. Состав и строение ДНК 7
1.2. Практическое значение ДНК и ее производных 8
1.3. Источники и способы выделения ДНК из биологического материала .
1.4. Способы гидролиза ДНК 25
1.5. Общая характеристика и классификация липидов и их функции 27
1.6. Области применения липидов. 30
1.7. Источники получения липидов 32
1.8. Методы выделения и очистки липидов. 34
1.9. Характеристика галофильных и метанокисляющих бактерий. 38
1.9.1. Характеристика галофильных бактерий 38
1.9.2. Характеристика метилококков 45
2. Материалы и методы 50
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Реагенты 51
2.3. Методы анализа
2.3.1. Определение влажности образца 53
2.3.2. Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых растворах
2.3.3. Количественное определение углеводов 54
2.3.4. Определение содержания нуклеиновых кислот 55
2.3.5. Методика определения концентрации фосфат-иона в водном растворе методом Фиска-Саббароу. 56
2.3.6. Определение содержания ДНК по Дише. 56
2.3.7. Определение индекса растворимости азота (nsi) 57
2.3.8. Определение дезоксирибонуклеозидов в растворе методом двумерной тонкослойной хроматографии 57
2.3.9. Установление чистоты препарата методом ТСХ
2.3.10. Определение эффективности гидролиза ДНК методом одномерной ТСХ 59
2.3.11. Определение массового содержания основного вещества в препарате по поглощению в УФ спектре. 60
2.3.12. Определение общих жиров. 60
2.3.13. Тонкослойная хромотография 61
2.4. Методы исследования 62
2.4.1. Методика проведения концентрирования вакуум - выпариванием.
2.4.2. Методика проведения осаждения белковых веществ из водных, водно-спиртовых и водно-ацетоновых растворов 63
2.4.3. Методика проведения процесса ультрафильтрации
2.4.3.1. Устройство и принцип действия лабораторной установки концентрирования 63
2.4.3.2. Методика проведения процесса концентрирования
2.4.4. Методика проведения ионного обмена 65
2.4.5. Методика проведения ферментативного гидролиза 66
2.4.6. Методика проведения гель-электрофореза в полиакриловом геле 66
2.4.7. Методика проведения сушки
2.4.7.1. Распылительная сушка 67
2.4.7.2. Лиофильная или сублимационная сушка 69
3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Разработка основ технологии выделения липидов из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus 74
3.1.2. Хроматографический анализ полученной липидной фракции 79
3.1.3. Изучение процесса фракционирования экстракта липидов биомассы бактерий Methylococcus capsulatus 82
3.2. Разработка основ технологии выделения концентратов ДНК и РНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus 86
3.3. Получение препаратов ДНК из других источников микробного происхождения
3.3.1. Исследование процесса выделения каротиноидов из биомассы бактерий Halobacterium halobium. 94
3.3.2. Выделение нуклеиновых компонентов из биомассы Bifidobacterium bifidum 105
3.3.3. Выделение нуклеиновых компонентов из отходов микробного происхождения. 105
3.4. Разработка основ технологии получения производных аденина,
гуанина, тимина и цитозина из бактериальной ДНК 109
3.4.1. Выбор способа гидролиза 109
3.4.2. Исследование процесса выделения производных гуанина 115
3.4.3. Исследование процесса выделения производных тимина
3.4.5. Очистка растворов производных нуклеиновых кислот. 125
3.4.6. Апробация разработанной технологической схемы получения производных нуклеиновых кислот для ДНК, выделенной из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus 130
3.5. Выделение белковой фракции из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus 133
3.5.1. Подбор оптимальных условий кислотной экстракции белковых веществ из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus 134
3.5.2. Подбор оптимальных условий ферментативного гидролиза белковых изолятов из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus 137
3.5.3. Подбор оптимальных условий ферментативной экстракции белковых веществ из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus 138
3.5.4. Исследование влияния различных видов сушки на качество получаемых белковых веществ. 139
4. Расчт технико-экономических показателей цеха по комплексной переработке биомассы Methylococcus capsulatus мощностью 2 тонн/год по исходному сырью . 143
Выводы 145
Заключение 147
Список литературы 148
- Источники и способы выделения ДНК из биологического материала
- Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых растворах
- Разработка основ технологии выделения концентратов ДНК и РНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus
- Подбор оптимальных условий ферментативного гидролиза белковых изолятов из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus
Введение к работе
Актуальность темы. Возникшая в настоящее время проблема импорто-замещения в Российской Федерации является приоритетной задачей для государства. В связи с неблагоприятной экологической и социально-экономической ситуацией возрастает потребность в пищевых (Фролова М.А., 2008) и кормовых добавках, косметологических (Албулов А.И. и др., 2011) и лекарственных препаратах для лечения заболеваний, связанных с нарушением деятельности иммунной системы животных (Кривопушкин А.В. и др., 2009, Игнатенко М.В. и др, 2009) и человека (Федоров Ю.Н. и др, 2009). Многие из таких препаратов изготавливают на основе компонентов нуклеиновых кислот, промышленное производство которых в России практически отсутствует. Поэтому актуальной является задача разработать основы технологии получения компонентов нуклеиновых кислот, в частности дезоксирибонуклеотидов, которые могут найти широкое применение в ветеринарии и медицине в качестве иммуномодулирующих, ранозаживляющих, противовирусных препаратов, диагностических средств, а также для лечения онкологических заболеваний.
Степень разработанности темы.
В качестве сырья для получения дезоксирибонуклеотидов используют эритроциты цыплят, молоки осетровых рыб (Фролова М.А. и др, 2005, Албулов А.И. и др, 2012), пуриновые и пиримидиновые предшественники. Однако использование животного сырья не позволяет получить дезоксирибонуклеотиды с высоким выходом, а химический синтез и биотрансформация требуют тщательной очистки от сопутствующих примесей, что существенно увеличивает стоимость конечных продуктов. Поэтому в настоящее время повышается интерес к микробным источникам дезоксирибонуклеозидов, в частности биомассе бактерий (Крылов И.А. и др, 1997).
Бактериальные продуценты широко используются для получения метаболитов. В этом случае отработанная биомасса, отличающаяся высоким содержанием ценных биологически активных веществ липидной, белковой, нуклеотид-ной природы, является трудноутилизируемым отходом производства. Кроме того, получение на основе биомассы бактерий вторичных метаболитов способно обеспечить добавочную стоимость, что позволяет повысить рентабельность основного производства. В соответствии с вышеизложенным представляется актуальным разработать технологическую схему получения препаратов нуклео-тидной природы из биомассы бактерий в рамках ее комплексной переработки с получением в качестве попутной продукции препаратов липидной и белковой
природы, имеющих самостоятельное практическое значение, например, в качестве технических смазок, дерматологических препаратов, компонентов питательных сред и кормовых добавок.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологической схемы получения дезоксирибонуклеотидов из бактериальной биомассы в условиях комплексной переработки сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить оптимальные условия предварительной обработки бактериальной биомассы с целью извлечения липидов и предложить технологическую схему получения продуктов липидной природы из полученной липидной фракции;
научно обосновать и разработать оптимальные условия выделения ДНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus;
определить оптимальные условия получения дезоксирибонуклеозидов из бактериальной ДНК;
разработать технологическую схему переработки ДНБМ бактерий в продукты белковой природы и оценить возможность их применения в качестве азотсодержащей основы питательных сред;
- провести технико-экономическую оценку разработанной технологии
комплексной переработки микробного сырья;
- оценить возможность применения разработанной технологии получения
дезоксирибонуклеозидов из других видов бактериального сырья.
Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально реализована возможность промышленного получения препарата ДНК из микробного сырья с содержанием основного вещества не менее 90% без использования токсичных органических растворителей и сложных технологических операций, включающая стадии экстракции липидной фракции, отделения биомассы центрифугированием, экстракции НК, отделения денуклеинизированной биомассы центрифугированием, ультрафильтрации, осаждения и сушки. Выход ДНК составил 80% от ее содержания в биомассе.
Разработан способ разделения дезоксирибонуклеозидов методом ионообменной хроматографии, основанный на различной растворимости и протониру-емости дезоксирибонуклеозидов. Разработана технологическая схема получения дезоксирибонуклеозидов (с содержанием основного вещества не менее 90%) из бактериальной ДНК с выходом 73% от их содержания в ДНК, включающая ста-
дии: гидролиза ДНК, осаждения производных гуанина, катионного обмена, очистки производных аденина, гуанина, тимина и цитозина на анионообменных смолах, сушки.
Показана принципиальная возможность применения разработанной технологической схемы комплексной переработки биомассы бактерий Methylococ-cus capsulatus, для получения препаратов ДНК из других бактериальных продуцентов и вторичного сырья, образующихся при переработке бактериальной биомассы. Разработана технологическая схема комплексной переработки биомассы бактерий с получением дезоксирибонуклеотидов, липидов (в том числе каротиноидов), изолятов и гидролизатов белка.
Теоретическая и практическая значимость. Разработана технологическая схема комплексной переработки бактериальной биомассы на примере Methylococcus capsulatus с получением препаратов дезоксирибонуклеозидов в качестве основных продуктов, а также липидов, белковых гидролизатов и изо-лятов в качестве побочных.
Разработана технологическая схема получения на основе бактериальной ДНК препаратов дезоксиаденозина, дезокситимидина, дезоксигуанозина, дез-оксицитидина с содержанием основного вещества не менее 90 % и выходом 73% от содержания в исходном сырье. Проведена предварительная технико-экономическая оценка разработанной технологии, в соответствии с которой себестоимость получаемого препарата меньше зарубежных аналогов на 31%, что подтвердила возможность импортозамещения.
Предложены пути переработки денуклеинизированной биомассы в продукты белковой природы: белковые гидролизаты и изоляты.
Разработана гибкая схема комплексной переработки вторичного сырья производств, специализирующихся на получении биомассы бактерий, что позволяет решать экологические проблемы утилизации биологических отходов.
Методология и методы исследования.
Избранная методология соответствует общепринятой схеме биотехнологического поиска фармакологически активных веществ среди объектов микробного происхождения, которые рассматриваются как потенциальные продуценты ценных метаболитов.
В работе в качестве такого продуцента использовалась биомасса биомасса бактерий Methylococcus capsulatus, предоставленная ЗАО «ИНКОР ИНЖИНИРИНГ».
Этапы разработки
Алгоритм исследований
Форма завершения
Предмет исследования - нуклеиновые
компоненты
Объект исследования: Methylococcus
capsulatus
Научная гипотеза и поисковые исследования
I
Обоснование направлений исследования:
- по совершенствованию технологии вы
деления нуклеиновых компонентов из
бактериальной биомассы
- по разработке комплексной переработке
бактериальной биомассы
Постановка цели и частных
задач исследования.
Формулировка проблемы
Принципиальная схема получение нуклеиновых компонентов
Экспериментальные исследования экстракции ДНК, ее гидролизу и выделению дезоксирибонуклеотидов
\
Осуществление комплексной переработки бактериальной биомассы с получением фракций белковой и липидной природы
Экспериментальная апробация
Лабораторный регламент Внедрение в производство
Рисунок 1 - Структурно-методологическая схема достижения цели
диссертационной работы.
Расчеты и построение технологических графиков осуществлялись с помощью пакета Microsoft Office excel 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office 2010.
Подробное описание методов, связанных с пробоподготовкой материала, приводится в соответствующих разделах работы.
Положения, выносимые на защиту.
1. Технология получения ДНК и РНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus включающая в себя:
технологию экстракции липидной фракции и ее разделения до свободных жирных кислот, триглицеридов и фосфолипидов.
усовершенствованный метод экстракции нуклеиновых компонентов, как из нативной, так и из биомассы, освобожденной от липидной фракции;
- стадию разделения смеси нуклеиновых компонентов с целью получения
отдельных фракций ДНК и РНК.
2. Технология получения производных аденина, тимина, гуанина и цито-
зина из гидролизата ДНК:
эффективные условия гидролиза бактериальной ДНК;
усовершенствованный метод разделения смеси производных аденина, тимина, гуанина и цитозина;
- усовершенствованный метод очистки полученных фракций.
3. Экспериментальное обоснование использования денуклеинизированной
бактериальной биомассы с целью получения белковой фракции, пригодной для
осуществления процесса культивирования микроорганизмов.
Степень достоверности и апробация результатов
Работа выполнена с использованием современных методов биотехнологии, препаративной химии, клеточной и молекулярной биологии.
Полученные результаты подтверждены многочисленными экспериментами и обработаны с использованием современных методов статистического анализа.
Для оптимизации технологических этапов производства препаратов использовали метод математического планирования Гаусса-Зайделя.
Обработку результатов экспериментов (с числом повторов 3) проводили статистическим методом анализа и обработки данных – методом определения грубых ошибок («промахов»), а для определения количества компонентов использовали метод математического планирования Гаусса-Зайделя.
Материалы диссертации были доложены на 6-ом и 7-ом Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2010 г, март 2012 г), 7-ом, 8-ом, 9-ом и 11-ом Международном конгрессе молодых ученых по химии и химической технологии (Москва, октябрь 2010 г, октябрь 2011 г, октябрь 2012 г, октябрь 2014 г).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рецензируемых ВАК, и 8 материалов научных конференций.
Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5-ти глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы (143 наименования, в том числе 43 на иностранных языках) и 3 приложения. Работа изложена на 166 стр. машинописного текста и содержит 35 таблицы и 60 рисунков.
Источники и способы выделения ДНК из биологического материала
Очень велико биологическое значение нуклеиновых кислот. Особенности их химического строения обеспечивают возможность передачи информации по наследству дочерним клеткам, переноса в цитоплазму и хранения информации о структуре белковых молекул. Но этим физиологическое значение ДНК не исчерпывается. Уже давно было обнаружено иммуномодулирующее воздействие на организм самой ДНК, ее составных частей (олиго- и мононуклеотидов), пиримидиновых и пуриновых оснований и их химически модифицированных производных.
Препараты ДНК применяются в медицине, а именно в онкологии, и могут быть использованы при лечении опухолей. Лечебный эффект производных ДНК носит универсальный характер и заключается в нормализации метаболизма в тканях, находящихся в экстремальных условиях [84]. До недавнего времени к основным методам лечения онкологических заболеваний относились химио- и лучевая терапии, а так же хирургическое вмешательство. В последнее время все чаще применяют метод биотерапии, а именно используют природные БАВ (интерфероны, интерлейкины), а также иммуномодуляторы (производные ДНК). При этом отмечают [130], чрезвычайную перспективность применения производных ДНК. Так, в зависимости от вида онкологического заболевания деринат (Sodium deoxyribonucleate - натрия дезоксирибонуклеат) снижает скорость роста опухолей: карциномы Уокера – на 2,5–25,6 %, саркомы – на 18,6–45,0 %, альвеолярного рака печени – на 13,8 % [48].
Был разработан метод основанный на использовании фрагментов ДНК, который применяется для лечения некоторых онкологических заболеваний. Такие препараты также обладают радиопротекторным, антитоксическим и противоопухолевым действием. Однако, ввиду того что в данном случае фрагментированная ДНК не защищена от действия нуклеаз крови человека, и в клетки доставляются преимущественно короткие фрагменты ДНК, данный метод обладает недостатком - относительно низкой эффективностью лечения. Для его устранения используют максимально допустимые дозы фрагментированной ДНК (приближающейся к 1500 нг/мл), что позволяет доставить более крупные фрагменты экзогенной ДНК. Только в этом случае для репарирования зон повреждений, связанных с утратой одного нуклеотида или фрагмента хромосомной ДНК, в клетку доставляется некоторое количество полноразмерных фрагментов ДНК. Повышение эффективности достигается введением в организм фрагментированной ДНК в комплексе с негистоновым белком протамином, выполняющим защитную функцию [126].
Одним из достоинств препаратов ДНК является то, что по отношению к ним не возникает резистентности. Помимо этого, для успешной терапии онкозаболеваний также используется способность ДНК служить проводником цитостатика и накапливаться в тканях, находящихся в критическом состоянии. [61]. Препараты на основе ДНК применяются также при лечении миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией. При таком методе инъекция ДНК стимулирует костномозговое кроветворение [94]. ДНК используют также в качестве средства фармакологической защиты при гипертермии в процессе лечения онкологических заболеваний. Было показано, что опухолеповреждающее действие гипертермии усиливается деринатом. При этом значительно легче протекают пред- и послепроцедурный периоды [61].
Обращает на себя внимание еще один аспект применения натриевой соли ДНК – для лечения заболеваний, характеризующихся аутоиммунной агрессией [109]. К таким заболеваниям относятся: неспецифический язвенный колит, ряд инфекционных заболеваний, инфаркт миокарда, сахарный диабет.
В таких случаях назначается лечение заключающееся в комплексной терапии, которая направлена на подавление аллергических процессов. В настоящее время для подавления аллергических реакций используют препараты, действие которых направлено на блокирование гистаминоподобных веществ, например, иммунодепрессанты и кортикостероиды, а также иммуноглобулины. Как правило, такие схемы лечения позволяют добиться временной неустойчивой ремиссии, а известные кортикостероиды и иммунодепрессанты не обладают селективным действием на определенные звенья клеточного и гуморального иммунитета и вызывают развитие толерантности. В.В.Стариков с соавторами [109] вводили больному натриевую соль ДНК, полученную из молок осетровых рыб в сочетании с человеческим альфа-фетопротеином (АФП). Основанием для применения ДНК-Na-АФП был известный факт, что ДНК выступает в качестве эндогенного материала для регенерации и избирательно накапливается в местах поврежденных тканей и клеток. Комплексное использование АФП и ДНК позволяет получить качественно новый синергетический эффект, обусловленный стимулирующими регенерацию свойствами первого препарата и иммуносупрессорными свойствами второго.
Иммуномодулирующие свойства препаратов ДНК получили высокую оценку в гинекологии за счет возможности сочетать их со многими лекарственными средствами и отсутствия противопоказаний и побочных явлений. Как известно [51], при хронических воспалительных заболеваниях придатков и матки наблюдаются признаки выраженного вторичного иммунодефицита. В отличие от Дерината, системная иммунотерапия с использованием индукторов интерферона и препаратов тимуса не приводит к восстановлению защитных свойств слизистой оболочки репродуктивных органов женщин. По этой причине необходима местная иммунокоррекция Деринатом, при этом наблюдается наиболее интенсивное влияние иммунотропного препарата на лимфоидную ткань и местные факторы иммунитета. Помимо прочего ДНК так же может быть использована для лечения мужского бесплодия. При постепенном введении курсовой дозы (300–750 мг) ДНК наблюдается восстановление сперматогенеза примерно через 10 дней после начала лечения.
Широкое применение нашли также гидролизаты ДНК, причем не только в онкологии. Они эффективны в качестве противовирусных и противомикробных препаратов. Такое действие гидролизатов ДНК основано на способности стимулировать местный и системный иммунитет, что способствует устранению возбудителя инфекции на этапе внедрения в метаболизм чужеродного организма и его блокировки. Более того, гидролизаты ДНК не вызывают аллергических реакций, но даже могут быть использованы для их лечения. Гидролизаты ДНК можно применять и в качестве оптимальных средств профилактики, поскольку их действие направлено на восстановление повреждений слизистых, а их целостная структура будет служить основным препятствием для внедрения возбудителей в организм [142]. Также в медицине часто используются смеси нуклеотидов, например в гастроэнтерологии. Известно, что нуклеиновые кислоты во многом определяют пролиферацию и клеточную дифференцировку, лежащие в основе любого восстановительного процесса тканей. В связи с этим применение ДНК при лечении язвенной болезни целесообразно, ввиду высокой скорости заживления язвы и повышения степени дифференцировки новообразований слизистой оболочки желудка. На фоне лечения больных с эрозивным гастритом, язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки отмечаются исчезновение диспептических явлений, болевого синдрома, и уже через 2 дня улучшение аппетита. Во всех случаях наблюдалось значительное ускорение эпителизации повреждений слизистой оболочки. При воздействии ДНК значительно сокращались количество дефектов и площадь поражения в случае эрозивного процесса. Помимо прочего после лечения с включением ДНК в курс терапии Helicobacter pilori, определенный в начале болезни у некоторых больных, после лечения обнаружен не был.
Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых растворах
Содержание фосфат-ионов определяли по методу Фиска-Саббароу. При обработке растворов, содержащих ортофосфат, молибденовокислым аммонием (NH4)2МоО4 в кислой среде образуется фосфорномолибденовая кислота Н7[Р(Мо2О7)]6. При взаимодействии с восстановителем (аскорбиновой кислотой) образуется смесь комплексов, содержащих молибден в различных валентностях. Смесь этих комплексов растворима в воде и называется молибденовой синью. Интенсивность окраски пропорциональна количеству фосфора, которое определяют по калибровочному графику со стандартным раствором фосфора.
Содержание ДНК определяли по методу Дише. Метод основан на реакции между дифениламином и дезоксирибозой, отщепляющейся от пурино-вых нуклеотидов в результате кислотного гидролиза. N-гликозидная связь в пиримидиновых нуклеотидах при этом не разрушается и вследствие этого определяется лишь около половины углеводов, входящих в состав ДНК; поэтому рекомендуется в качестве стандарта использовать гидролизат ДНК, концентрацию которого предварительно определяют спектрофотометриче-ским методом. Концентрацию ДНК в г/л находили по формуле: [ДНК]= СР Р 10"3, где Ср - концентрация ДНК в анализируемом растворе, найденная по калибровочному графику, мг/л;
Для определения количества растворенного азота готовили 75 мл 10 %-го раствора образца в дистиллированной воде. Полученную суспензию инкубировали на магнитной мешалке при 30 С в течение часа. Центрифугированием отделяли осадок, а надосадочную жидкость доводили до 100 мл в мерной колбе и в аликвотной части определяли содержание растворенного азота методом Къельдаля.
Расчет индекса растворимости азота выполняют по формуле: NSI fVx 0,05x14x100x20 100% , где mx10x V - объем стандартной серной кислоты, пошедшей на титрование, мл; 0,05- концентрация титранта, мг-экв/мл; 100- объем раствора в мерной колбе после сжигания, мл; 10 – объем раствора, взятого для отгона аммиака, мл; m - навеска абсолютно сухого вещества, мг; 14 – количество азота (мг), которое связывает 1 мг-экв серной кислоты; 20 – пересчет аликвотной части на весь объем пробы; WN – содержание общего азота в анализируемом образце (определяется методом Къельдаля).
. Определение дезоксирибонуклеозидов в растворе методом двумерной тонкослойной хроматографии Нуклеиновые компоненты имеют высокие мольные коэффициенты экс-тинкции = 104 л/моль смеси в УФ-области (макс = 250-280нм), что позволяет определить микроколичества (мкг) этих веществ методом тонкослойной хроматографии. 1-ая система: 2-ая система: ацетон - 45% изопропанол - 70% н-бутанол - 45% аммиак водный (25% раствор) - 15% муравьиная кислота - 2% вода дистиллированная - 15% вода дистиллированная - 8% Схематическое изображение полученной высушенной хроматограммы представлено на рис. 2.1, где 1 – направление движения элюента №1; 2 – направление движения элюента №2; А – аденозин; Т – тимидин; G – гуанозин; С – цитидин Эффект разделения нуклеозидов на пластине обусловлен различающимися скоростями прохождения веществ по Silufol.
Под действием элюента №1 хорошо отделяются производные тимиди-на. Их пятно локализовано и имеет округлую форму. Остальные нуклеозиды практически не сдвигаются с места, сливаясь в одно пятно.
Элюент №2 позволяет отделить производные аденозина, которые на пластине также имеют четкую округлую форму. Пятна производных гуано-зина и цитидина разделить не удается, на пластине они представляют собой единое размазанное пятно.
Применяя метод ТСХ можно установить чистоту препарата: если при проведении тонкослойной хроматографии после похождения через Silufol элюента, на пластинке не обнаруживается никаких посторонних следов или пятен, следовательно, можем сделать вывод, что препарат чистый.
Если кроме основного пятна присутствуют также другие, это говорит о необходимости проведения дополнительной очистки образца. 2.3.10. Определение эффективности гидролиза ДНК методом одномерной ТСХ
Мономерные нуклеиновые компоненты способны перемещаться по Si-lufol, в отличие от полимерных, которые будут оставаться в точке нанесения. Также моно- и полинуклеозиды определяются в УФ области спектра, при этом максимум поглощения негидролизованной ДНК и смеси нуклеозидов будет составлять 270 нм.
Схематическое изображение полученной высушенной хроматограммы представлено на рис. 2.2,где 1 – место нанесения исходной пробы; 2 – смесь дезоксирибонуклеозидов. Стрелкой указано направление движения элюента. При этом в пятне №1 сосредоточены высокомолеку лярные (негидролизовавшиеся) молекулы ДНК, а мономе Рисунок 2.2. ры НК под действием элюента поднялись при этом не раз делившись между собой.
Такой метод позволяет сравнивать степени гидролизов, за счет отношения оптической плотности в верхнем и нижнем пятнах.
Пятно исследуемого нуклеозида вырезали с пластинки и вещество вымывали небольшим количеством раствора соляной кислоты (4 мл 0,1 н HCl) при кратковременном взбалтывании.
Оптическая плотность полученного раствора измеряли при длине волны 270 нм (макс). Использовали кварцевые кюветы с длиной поглощающего слоя l = 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали жидкость, образовавшуюся при взбалтывании в 4 мл кислоты кусочка пластинки, приблизительно равного по площади вырезанному пятну анализируемого нуклеозида.
Разработка основ технологии выделения концентратов ДНК и РНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus
Для оценки универсальности предложенной в предыдущем разделе схемы выделения ДНК данная схема была апробирована для переработки отходов производств, основанных на получении биомассы бактерий, а именно: 1) биомассы бактерий Halobacterium halobium – отходу производства бак териородопсина и баксина; 2) жидких отходов (лизата и культуральной жидкости), образующихся в технологическом процессе выделения бактериородопсина из биомассы Halobacterium halobium; 3) биомассы бактерий Bifidobacterium bifidum — отходу производства би-фидобактерина. Аналогично проведенным ранее исследованиям по выделению ДНК из биомассы бактерий Methylococcus capsulatus, на первом этапе работы необходимо было подобрать условия предобработки биомассы бактерий Halobacterium halobium и Bifidobacterium bifidum с целью очистки от соединений липидной природы. В биомассе Halobacterium halobium последние представлены главным образом каротиноидами, которые в настоящее время имеют самостоятельное практическое значение, и препараты на их основе могут рассматриваться как побочный продукт производства ДНК и ее производных.
Поэтому необходимо было разработать технологическую схему выделения каротиноидов из биомассы Halobacterium halobium.
Биомасса галобактерий характеризуется относительно высоким содержанием нуклеиновых кислот (9,7 % от СВ), что делает ее перспективным источником для выделения нуклеиновых компонентов. Однако, она также характеризуется высоким содержанием липидов (23 % от СВ), которые, как отмечалось выше, представлены в основном каротиноидами. Из литературы известно, что клетки Halobacterium halobium способны к биосинтезу таких ка-ротиноидов липидной природы как ксантофиллы, бактериоруберин и бета-каротин.
Каротиноиды находят широкое применение в медицине в качестве ан-тиоксидантов, ранозаживляющих средств, препаратов для лечения гипертонии и атеросклероза [91,96, 128]. Сначала необходимо было выбрать способ подготовки биомассы, который обеспечивал бы наиболее полную экстракцию каротиноидов. В качестве объектов исследования были выбраны: – суспензия биомассы бактерий, неочищенная от компонентов питательной среды (СВ - 23%), – влажная биомасса бактерий (СВ - 28%), отмытая от питательной среды, – сухая измельченная биомасса с размером частиц от 3 до 5 мм, – сухая измельченная биомасса с размером частиц менее 0,5 мм. – «восстановленная» биомасса – т.е. сухая биомасса, предварительно обработанная раствором хлорида натрия с концентрацией 260 г/л (что соответствует концентрации данной соли в питательной среде для культивирования данных бактерий в течение 1 ч. В качестве экстрагента был выбран ацетон, так как анализ литературных данных показал, что ацетон обладает высокой экстракционной способностью относительно каротиноидов. Эффективность экстракции определяли по величине оптической плотности полученных экстрактов (рис 3.3.1) при длине волны 470 нм, что соответствует максимуму поглощения фракции ка-ротиноидов [52].
При проведении экстракции контролировали потери с экстрактом нуклеиновых компонентов и белковых веществ (рис. 3.3.2, 3.3.3).
В результате проведенных исследований было установлено, что самая низкая эффективность экстракции каротиноидов наблюдается для биомассы, не отмытой от компонентов питательной среды, при этом уже в ходе первой экстракции происходит образование агломератов диаметром 1,5 – 2 мм, что затрудняло дальнейшее извлечение каротиноидов. 20
Величина поглощения экстрактов каротиноидов при 470 нм в зависимости от кратности экстракции, полученных из 1 - влажной биомассы, 2 - измельченная сухая биомасса (3-5 мм), 3 -измельченная сухая биомасса (0,5 мм), 4 - восстановленная измельченная биомасса (3-5 мм), 5 - восстановленная измельченная биомасса (0,5 мм)
Что касается нуклеиновых компонентов (рис. 3.3.3), то их максимальные потери наблюдаются при работе с измельченной высушенной биомассой с размером частиц менее 0,5 мм, а минимальные - при обработке влажной биомассы. Это, возможно, связано с нарушением структуры мембран в результате сушки, проводимой при повышенных температурах. Однако использование влажной биомассы осложняется ограниченным сроком хранения последней. В случае использования биомассы с размером частиц 3-5 мм (рис. 3.3.2 и 3.3.3), несмотря на относительно низкие потери нуклеиновых компонентов, для полного извлечения каротиноидов требуется повышать кратность экстракции до 8 раз (рис. 3.3.1), что приводит к увеличению расхода экстра-гента.
Было установлено, что в случае работы с «восстановленной» биомассой кратность экстракции удается снизить с 10 до 6 при сохранении степени экстракции каротиноидов (рис. 3.3.1), достигаемой при работе с влажной биомассой.
Поэтому на следующем этапе исследований определяли оптимальное время предобработки биомассы с размером частиц 3-5 мм раствором хлорида натрия с концентрацией 260 г/л. Для этого биомассу выдерживали в данном растворе в течение 1 ч, 24 ч и 48 ч. После отделения солевого раствора центрифугированием, биомассу подвергали обработке органическим растворителем. В полученных экстрактах измеряли поглощение при длине волны 470 нм.
В результате проведенных исследований было установлено, что практически полное извлечение каротиноидов из клеток наблюдается при длительности предобработки 24 ч (рис. 3.3.4), однако в течение 1-го ч происходит наиболее интенсивное выделение каротиноидов в экстракт (не менее 90% от общего количества), поэтому дальнейшее увеличение времени предобработки нецелесообразно. Следует отметить, что в вышеописанных условиях удалось не только уменьшить кратность экстракции, но и сократить время первой экстракции (с 30 до 10 мин).
Таким образом, с целью повышения эффективности экстракции каро-тиноидов было предложено проводить процесс с сухой биомассой, измельченной до частиц размером 3-5 мм с предварительной ее предобработкой раствором хлорида натрия с концентрацией соли 260 г/л в течение 1 ч при соотношении биомасса:солевой раствор 1:1 (об./об.).
Подбор оптимальных условий ферментативного гидролиза белковых изолятов из денуклеинизированной биомассы Methylococcus capsulatus
Основным отходом, образующимся в технологической схеме выделения нуклеиновых кислот, является денуклеинизированная биомасса, которая в рамках комплексной переработки может быть переработана в продукты белковой природы.
Известно более 30 видов бактерий, которые также могут быть использованы в качестве источника полноценного кормового белка. За счет высокого содержания белка добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию 7 т фуражного зерна и дополнительное производство 800 кг свинины или 5 т мяса птицы. Микроорганизмы-производители белка могут расти на различных достаточно дешевых средах (метанол, этанол, природный газ, нефтепродукты) [87; 104; 112]. Микробный белок может быть использован для приготовления питательных сред, а так же в сфере животноводства в качестве белковых добавок к кормам [66; 72; 85].
Исследование физико-химического состава денуклеинизированной биомассы бактерий Methylococcus capsulatus, показало, что она содержит не менее (21% от СВ белковых веществ), что позволяет рассматривать ее как перспективный источник их получения.
Как правило, для выделения белковых веществ из микробного сырья в промышленности используют кислотную и ферментативную экстракцию. При этом возможно получение как белковых изолятов, так и низкомолекулярных белковых продуктов. Поэтому были подобраны оптимальные условия кислотной и ферментативной экстракции белковых веществ из денуклеинизированной биомассы бактерий.
Повысить эффективность кислотной экстракции можно путем оптимизации температуры и времени проведения процесса. В данной работе проводили сравнение эффективности кислотной экстракции при рН 2 (подтитровка серной кислотой) белковых веществ (БВ) при 70, 75, 80, 85 и 90 С, времени экстракции 3 часа.
В полученных экстрактах анализировали содержание белковых веществ, как высокомолекулярной, так и низкомолекулярной фракций белковых веществ, а также нуклеиновых компонентов и сахаров. Под высокомолекулярной и низкомолекулярной фракциями белковых веществ понимали, соответственно, белки, осаждаемые и неосаждаемые 50%-ной трихлоруксусной кислотой. Полученные результаты представлены на рис. 3.5.1-3.5.3.
Как видно из приведенных данных, оптимальное время экстракции составляет 2,5 ч., т.к. при более длительном контакте белковых веществ с агрессивной экстракционной средой начинается деструкция белковых молекул, что особенно заметно при обработке биомассы при 90 С. При этом наиболее полная экстракция наблюдается при проведении процесса при 90 С, что позволяет выделить до 90 % белковых веществ.
Данные, приведенные на рис. 2-3, подтверждают сделанное ранее предположение о гидролизе высокомолекулярной фракции белка при длительности процесса экстракции более 2,5 ч. Следует обратить внимание, что с увеличением температуры, степень гидролиза высокомолекулярных белков растет. Т. о. оптимальной температурой для проведения кислотной экстракции является 85 С, т.к. проведение процесса при таких условиях позволяет максимально извлечь высокомолекулярную фракцию белка, минимизируя ее деструкцию до пептидов и аминокислот.
Влияние температурного режима и времени экстракции на эффективность выделения высокомолекулярной фракции белковых веществ. Поскольку в исходной денуклеинизированной биомассе содержится остаточное количество нуклеиновых компонентов (не более 1,2%) и значительное количество сахаров, которые могут переходить в белковый экстракт и усложнять в дальнейшем его очистку, был определен выход данных групп соединений. Для оценки количества примеси НК в полученном экстракте, анализировали пробы экстракта, отобранные в начале и конце экстракции (180 мин.).
Проведенный анализ экстрактов показал, что происходит совместная экстракция, как нуклеиновых компонентов, так и белковых веществ, однако концентрация НК в конце экстракции не велика и не превышает 0,6 г/л, а сахаров 0,2 г/л. Таким образом, суммарное количество примесных НК и сахаров в экстракте не превышает 7 %.
На следующем этапе исследований из экстрактов был выделен изолят глобулиновой фракции белка путем осаждения в изоэлектрической точке (рН 4,5, температура 6-10 С, время осаждения - 12 ч). Был проведен сравнительный анализ полученных фракций, который показал, что при повышении температуры экстракции в получаемом белковом изоляте растет количество примесей, а именно НК и сахаров, однако, их суммарное количество не превышает 10 %. При этом содержание белка в изоляте не менее 83%.
Для определения степени разрушения белков в процессе кислотной экстракции полученные экстракты были проанализированы методом гельэлектрофореза, в результате чего было выявлено присутствие в экстрактах белков с молекулярной массой 56 кДа, при этом в экстрактах, полученных при температуре 80 и 85 С, присутствовали белки с молекулярной массой 18,5 и 16 кДа, а при 90 С – 16 и 12 кДа.
Т.о. сравнительный анализ полученных экстрактов показал, что оптимальными условиями экстракции белковой фракции из биомассы Methylo-coccus capsulatus является температура 85 C и время процесса 2,5 часа. В этих условиях удается получить БВ с выходом не ниже 83 % от общего содержания в денуклеинизированной биомассе. При этом доля высокомолекулярной фракции белка в экстракте составляет не менее 32%, что позволяет рекомендовать такой экстракт для выделения белкового изолята. Было установлено, что выход белкового изолята составляет 80% от общего содержания высокомолекулярной фракции белков в биомассе бактерий. При этом полученный изолят содержит не более 13% примесей при содержании основного вещества не менее 85% от СВ. В белковом изоляте преобладают белки с молекулярной массой 55 кДа.
В настоящее время белковые изоляты имеют ограниченное применение, поэтому более перспективно получение на их основе белковых гидроли-затов.
В качестве объекта исследования на данном этапе работы использовали изолят глобулиновой фракции белковых веществ биомассы Methylococcus capsulatus.
Для проведения ферментативного гидролиза были выбраны ферментные препараты: панкреатин, трипсин, папаин, пепсин, характеристики которых приведены в разделе «Материалы и методы». В данном случае оптимизацию процесса ферментативного гидролиза проводили путем выбора ферментного препарата. Эффективность гидролиза оценивали по накоплению низкомолекулярной фракции белка.