Введение к работе
Актуальность темы
Цветоводство является одной из важных отраслей сельскохозяйственного производства. Основные доходы в этой области связаны со сре-зочными цветочными культурами, среди которых большое значение имеет гвоздика ремонтантная. Ежегодый годовой оборот от продажи гвоздики только на голландских аукционах составляет около 140 млн. долларов.
Несмотря на обилие и разнообразие сортов, работа по совершенствованию сортимента гвоздики ведётся непрерывно, поскольку требования рынка и вкусы покупателей постоянно меняются. Однако достичь желаемого сочетания характеристик в одном растении с помощью 'классических" селекционных программ не всегда удаётся, что связано с высокой гетерзиготностью генома большинства сортов. Сочетание классической селекции и генетической инженерии открывает большие перспективы по расширению существующего ассортимента.
В настоящее время достижения в области генетической инженерии цветочных культур, гораздо скромнее, чем для многих других сельскохозяйственных растений. Это связано с ограниченным числом методик трансформации, которые не всегда воспроизводимы. Тем не менее, гвоздика опережает остальные цветочные культуры по числу полевых испытаний (20), что указывает на важность и перспективность генно-инженерных манипуляций с этой культурой.
На сегодняшний день трансформация гвоздики является трудным и многоэтапным методом, сопряженным с подбором большого числа факторов для её успешного проведения. Но даже существующие методики, в силу важности этой культуры для цветоводства являются либо собственностью таких биотехнологических фирм, как DNA Plant Technology или Florigene, либо информация об эффективном протоколе трансформации ограничена, что не позволяет её воспроизвести, либо предлагаемая методика дает низкую частоту трансформации.
Настоящая диссертация посвящена определению оптимальных условий для быстрого агробактериального переноса генов в геном гвоздики ремонтантной и их экспрессии в растениях. Поскольку разработка такой системы требует изучения целого комплекса условий, нами рассмотрены различные аспекты, связанные с регенерацией побегов, касающиеся гормонального состава среды, генотипа, типа соматической ткани, физиологического возраста и происхождения эксплантов, а также значение гена селективного маркера и особенности экспрессии перенесенного гена.
Цели и задачи исследований
В задачи наших исследований входило подобрать условия для эффек тивной регенерации и трансформации гвоздики ремонтантной с помощьк Agrobacterium tumefaciens. Исходя из поставленных целей, нами решалисі следующие задачи:
1. Разработать методику регенерации гвоздики ремонтантной,
а) подобрать оптимальный гормональный состав среды для эффектив
ной регенерации из различных типов эксплантов.
б) рассмотреть влияние физиологического возраста и происхождени:
экспланта на эффективность адвентивного органогенеза.
в) оценить регенерационный потенциал различных сортов и выделит
наиболее пригодные для генетической трансформации.
2. Разработать эффективную методику агробактериальной трансформа
ции гвоздики ремонтантной в том числе:
а) оценить компетентность различных тканей гвоздики для успешноі
агробактериальной трансформации;
б) изучить влияние селективного агента на эффективность трансформа
ции.
в) воспроизвести методику трансформации на разных сортах гвоздики;
г) изучить особенности экспрессии репортерного гена в тканях транс
генных гвоздик.
Научная новизна и практическая ценность исследований
Подобраны условия для эффективной регенерации побегов и различных эксплантов гвоздики. Показано влияние физиологическое возраста листовых и стеблевых эксплантов на эффективность регенерацій Выявлены различия регенерационного потенциала листовых эксплантоЕ происходящих от растений iv vitro и in vivo. Впервые получені трансгенные растения гвоздики одного генотипа с использование! различных типов ткани, что позволило определить оптимальный эксплан для агробактериальной трансформации. Впервые получены трансгенны растения гвоздики с использованием гена селективного маркер гигромицин-фосфотрансферазы. Достигнута высокая частот агробактериального переноса генов в геном гвоздики (более 10%' Впервые выявлена количественная экспрессия гетерологичного гена трансгенных растениях гвоздики.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатны работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, заключение, выводы, список литературы. Общий объем диссертации составляет 149 страниц. Включая 17 таблиц и 14 рисунков, библиография включает 258 наименований работ.