Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы и постановка задач исследования 13
1.1. Токсичность плазмонно-резонансных наночастиц 13
1.2. Методы определения токсичности 22
1.3. Характеристика флуоресцирующих нанокластеров 37
1.4. Наночастицы для усиления противоопухолевой активности лекарств 43
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Реактивы и материалы 51
2.2. Оборудование 52
2.3. Клеточные культуры, использованные в работе 53
2.4. Культивирование животных клеток 53
2.5. Культивирование клеток микроводоросли 53
2.6. Определение жизнеспособности животных клеток методом МТТ-теста 54
2.7. Определение жизнеспособности животных клеток с помощью флуоресцентных красителей 54
2.8. Определение жизнеспособности растительных клеток спектрофотометрическими методами 55
2.9. Синтез наночастиц
2.10. Синтез нанокластеров и ЧСА наночастиц 58
2.11. Культивирование животных клеток с токсикантами 59
Глава 3. Влияние НК и НЧ-ЧСА на жизнеспособность клеток 64
3.1. Физико-химические свойства НК-БСА 64
3.2. Определение локализации НК-БСА в животных клетках методами флуоресцентной микроскопии 66
3.3. Физико-химические свойства НК- ЧСА и НЧ-ЧСА 69
3.4. Определение токсического воздействия и локализации НК-ЧСА и НЧ-ЧСА 72
Глава 4. Влияние коллоидного серебра на жизнеспособность животных и растительных клеток 77
4.1. Определение жизнеспособности D. salina фотометрическими и микроскопическими методами 78
4.2. Определение жизнеспособности животных клеток методами флуоресцентной микроскопии 81
4.2. Определение совместной цитотоксичности СНСф-20 и ЦТАБ методом МТТ-теста.. 89
Глава 5. Определение токсичности противоопухолевых препаратов и их конъюгатов 92
5.1. Определение токсичности конъюгата доцетаксел+ЗНСф-50 93
5.2. Определение токсичности комплекса проспидин+ЗНСф-50+фосфат декстрана методом МТТ-теста 102
Заключения и выводы 113
Список сокращений и условных обозначений 117
Список использованных источников 119
- Характеристика флуоресцирующих нанокластеров
- Культивирование клеток микроводоросли
- Определение локализации НК-БСА в животных клетках методами флуоресцентной микроскопии
- Определение жизнеспособности животных клеток методами флуоресцентной микроскопии
Характеристика флуоресцирующих нанокластеров
В тех работах, где изучается токсичность серебряных наночастиц, основное внимание уделено их воздействию на клетки легких, слизистых оболочек и кожи, поскольку главным образом наночастицы попадают в организм при вдыхании или непосредственном контакте [7]. Стоит отметить, что даже при таком локальном введении на организм, воздействию наночастиц подвергаются почти все органы. В одной из первых статей [14] по легочному воздействию наночастиц исследовалось биораспределение наночастиц серебра в организме крыс после вдыхания их с воздухом. Концентрация наночастиц составляла около 133 мкг/м3. Полученные данные свидетельствуют о том, что уже через несколько часов после вдыхания наночастицы достоверно обнаруживались в крови в концентрации 9 нг Ag/г массы животного, а также в основных органах: печени, почках, мозге. Выведение наночастиц из организма заняло около недели. В данной работе авторы, однако, не ставили задачу выяснить, какое воздействие оказывают наночастицы на организм. Подобное исследование, но направленное уже на изучение проникновения наночастиц в организм через кожу, провели на людях, получивших термические ожоги. В работе Vlachou с соавторами проводилось исследование количества серосодержащих соединений серебра в крови пациентов после лечения серебросодержащими салфетками для покрытия ран [15]. Через 9 дней после начала лечения в крови был зарегистрирован максимум содержания серы на уровне 57 мкг/мл. Повышенный уровень серы держался на протяжении 6 месяцев с конца лечения, что косвенно может говорить о том, что наночастицы также выводились из организма в течение этого времени. Авторы, однако, не наблюдали каких-либо отклонений от нормы у пациентов и делают вывод об отсутствии токсичности у наночастиц при данном способе лечения. Стоит отметить, что подобные раневые покрытия становятся все более распространенными, а исследования по их потенциальному токсическому эффекту проводятся непосредственно на людях. Так в работе Trop с соавторами изучали перевязочные салфетки, содержащие 15 нм частицы коллоидного серебра [16]. В результате 6-ти дневного лечения у пациентов наблюдалось незначительное побледнение цвета кожи, связанное с накоплением наночастиц, однако никаких иных патологических изменений выявлено не было. На основе этих и других исследований можно сделать вывод, что использование коллоидного серебра в качестве антибактериального препарата в раневых покрытиях практически лишено каких-либо побочных эффектов. Однако в недавней работе ученые из Норвегии пришли к выводу, что не все наночастицы серебра обладают одинаковыми свойствами, и что их токсичность носит сильный размерозависимый характер [17]. Авторы использовали в качестве тест-модели нормальные эпителиальные клетки легкого человека BEAS-2B, и тестировали целый ряд серебряных наночастиц: размером 10, 40, 75 нм, покрытые и не покрытые поливинилпирролидоном. Согласно полученным данным, разницы между покрытыми и не покрытыми наночастицами не было, однако среди всех размеров только 10 нм частицы оказались токсичными для клеток. Исследователи выяснили, что причиной послужило интенсивное образование ионов серебра именно от частиц с диаметром 10 нм. Наблюдался так называемый эффект «троянского коня»: частицы, попав внутрь клетки, подвергались воздействию внутриклеточных ферментов, что приводило к увеличению концентрации ионов серебра во внутриклеточном пространстве и гибели клетки. Такой результат оказался неожиданным, особенно на фоне того, что частицы размером порядка 50 нм клетками поглощались в 4 раза более интенсивно. Объяснить это можно большей суммарной площадью поверхности наночастиц меньшего размера, которая для наночастиц размером 10 нм в 1600 раз больше.
В недавней работе исследователей из группы Эль-Саеда [18] проводится подробное исследование клеточного ответа опухолевых клеток линии HSC-3 (плоскоклеточная карцинома языка) на золотые и серебряные частицы, покрытые различными вещества, в том числе для установления зависимости клеточного поглощения от поверхностной функционализации наночастиц. По результатам проведенных авторами исследований было установлено, что золотые наночастицы, покрытые mPEG-SH (метоксиполиэтиленгликоль-тиол), практически не проникают внутрь клеток. Часть наночастиц была дополнительно функционализирована молекулами-мишенями для специфического накопления в ядре или цитоплазме. Было установлено, что после 24 часов инкубирования наночастицы в концентрации 100 мг Ag/л снижают дыхательную активность клеток примерно на 20%, при этом концентрация 25 мг Ag/л приводит к возрастанию количества некротических клеток на 25% по сравнению с контролем. Дополнительно было установлено, что золотые наночастицы обладают меньшей оксидативной активностью по сравнению с серебряными наночастицами, и вызывают лишь незначительное увеличение числа некротических клеток. Авторы делают вывод, что серебряные наночастицы в 20-40 раз более токсичны, чем золотые, что связано, в основном, с увеличением числа активных форм кислорода внутри клеток и с повреждением митохондрий.
В работе Zeng с соавторами исследуют воздействие золотых и серебряных наночастиц различных форм и размеров на культуры опухолевых клеток HEp-2 (карцинома гортани) и HeLa (карцинома шейки матки) [19]. Авторы утверждают, что для золотых наночастиц, полученных методом цитратного восстановления, токсичность носит размерозависимый характер и возрастает при увеличении размера частиц. Золотые наностержни, покрытые ЦТАБ, при тех же концентрациях оказались более чем в 100 раз токсичней для обеих клеточных культур (IC50 составила 1,75 пМ Au). Для серебряных наночастиц снижение жизнеспособности на 30% было достигнуто при концентрации 400 мкг Ag/мл. Авторы делают вывод, что поглощение наночастиц сильно зависит от их размера и формы, а также поверхностной функционализации, при этом состав наночастицы (золотая или серебряная) не играют роли. ЗНСф-30 оказались более токсичными, чем ЗНСф-15, а серебряные нанотреугольники менее токсичны, чем серебряные сферы. Во всех случаях, покрытые ЦТАБ наночастицы оказывались многократно токсичнее. Дополнительно было установлено, что цитратные золотые наночастицы в 100 раз более токсичны, чем кадмиевые квантовые точки. Необходимо отметить, что подобный результат удивителен, поскольку цитратные наносферы с диаметром в десятки нанометров почти не обладают собственной токсичностью, что подтверждают как многочисленные исследования различных золотых наночастиц [20], так и сравнительный анализ их токсичности с кадмиевыми точками в других работах [21]. Данное противоречие еще раз служит доказательством того, что разный выбор клеточных культур и методов оценки жизнеспособности может давать противоречивые результаты.
Культивирование клеток микроводоросли
Идея усиления эффективности лекарств путем их адресной доставки в целевой орган далеко не нова, однако на данный момент только несколько препаратов успешно дошли до финальной стадии клинических испытаний [100]. Нужно отметить, что данные препараты крайне просты по своему составу по сравнению с большинством разрабатываемых перспективных препаратов на основе наночастиц.
Ранее противоопухолевые препараты делились на две группы: с цитостатическим и цитотоксическим действием. Цитостатические препараты или цитостатики - группа противоопухолевых препаратов, которые вызывают некроз опухолевых клеток, в отличие от цитотоксических препаратов, которые запускают процесс апоптоза внутри злокачественной клетки. Данная классификация в последнее время не применяется в силу иного подхода к описанию клеточной смерти [101]. В новой принятой классификации различают случайную клеточную гибель (accidental cell death, ACD) и регулируемую клеточную гибель (regulated cell death, RCD). Согласно этой классификации, морфологические и функциональные аспекты клеточной гибели не обязательно связаны друг с другом. Таким образом регулируемая клеточная гибель может сопровождаться как признаками некроза, так и апоптоза. Исходя из этого, цитостатические препараты являются лишь подгруппой цитотоксических препаратов, отражающей несколько иной механизм противоопухолевого действия. Каждая из этих групп имеет множество подгрупп, основанных на различном механизме действия конкретного лекарственного препарата [102].
Рассмотрим основные морфологические аспекты некроза и апоптоза. Апоптоз - это генетически обусловленный, физиологически регулируемый процесс гибели клеток, который происходит при нормальном развитии клеток. Неправильно регулируемый апоптоз связан с возникновением заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рак и др. В организме клетки большинства тканей постоянно разрушаются, омертвевают и замещаются. За год в организме человека замещается клеток общей массой, равной весу человека [103]. Необратимое прекращение функций отдельных клеток представляет собой необходимый компонент нормальной жизнедеятельности в процессе регенерации. Важным в данной случае является то, что при апоптозе сохраняется целостность мембран, органеллы выглядят неповрежденными, а продукты дробления клетки - апоптозные тельца (или везикулы) - представляют собой отдельные фрагменты, окруженные мембраной [103]. Благодаря этому, апоптозные клетки могут детектироваться с помощью флуоресцентного микроскопа, посредством методов, описанных выше, или просто визуально, по характерным изменениям клеточной мембраны. При апоптозе возникают заметные изменения клетки и межклеточного вещества: происходит блебблинг цитоплазмы, конденсация ядра, разрывы нити ядерной ДНК и последующий распад ядра на части, фрагментация клетки на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптозные тельца), фагоцитируемые макрофагами и клетками - соседями. В процессе апоптоза часть внутреннего содержимого клетки лизируется, что связано с активацией гидролитических ферментов лизосом - рибо- и дезоксирибонуклеаз, кислой фосфатазы и других, в результате повышения проницаемости клеточных мембран, изменения осмотического равновесия.
Нарушение процесса апоптоза приводит к различным болезням. Если клетка не в состоянии произвести апоптоз из-за мутации или заражения вирусом, она может начать делиться бесконтрольно, что приводит к опухоли. К примеру, человеческий папилломавирус использует свой ген Е6, чтобы разрушить белок p53, критически важный для апоптоза [104].
Существующие технологии терапии опухолевого процесса не могут считаться удовлетворительными. Парадоксальным образом многие десятилетия активного изучения этого вопроса не смогли предложить лучшего подхода к лечению опухоли, нежели хирургический. Использование современных достижений химиотерапии, а также различных комбинаций препаратов и технологий не продемонстрировало существенного прорыва в скорости или качестве излечения злокачественных новообразований. А с учётом всевозрастающей стоимости лечения при скромном росте эффективности и увеличения продолжительности жизни возможно говорить о тупике в развитии онкологии в целом [105].
Возможным выходом из этого технологического тупика может быть локальное (интратуморальное и/или интраоперационное) введение противоопухолевых препаратов с местным действием [106]. Стратегической целью данного подхода является предположение о том, что локальная (интратуморальная) терапия химиопрепаратами существенно уменьшит или даже остановит течение опухолевого процесса.
Важным аргументом для интратуморального введения является то обстоятельство, что при традиционной химиотерапии действующая концентрация препарата непосредственно в опухоли достигается при системном использовании препарата, то есть происходит не избирательное применение препарата. Подавляющая часть побочных действий препаратов связана именно с этой неизбирательностью. Очевидно, что интратуморальное применение лишено этих негативных явлений.
Определение локализации НК-БСА в животных клетках методами флуоресцентной микроскопии
Препарат СНСф-20 представляет собой незащищенный (электростатически стабилизированный) гидрозоль металлического наносеребра с размерами частиц около 20 нм в диаметре – продукт восстановления нитрата серебра ЭДТА в слабощелочной среде. СНСф-20 сохраняет свою агрегационную стабильность только в условиях низкой ионной силы при хранении в герметически укупоренных флаконах. Плазмонно-резонансный пик СНСф-20 находится в области 400 нм. При быстрой агрегации спектры СНСф-20 значительно уширяются, приобретая в конечном виде практически спектрально нейтральный характер. Свежеприготовленный раствор коллоидного серебра имеет концентрацию серебра по синтезу 30 мг Ag/л и серо-желтый цвет. При синтезе коллоидного серебра используются такие вещества как ЭДТА и гидроокись натрия. ЭДТА по отношению к ряду животных и растительных клеток обладает выраженным токсическим и мутагенным действием [128]. При концентрациях менее 100 мкМ (29.2 мкг/мл) ЭДТА вызывает замедление пролиферации и апоптоз у нормальных клеток почек крысы [129]. Концентрация ЭДТА по синтезу в золе составляет 64 мкг/мл, что в два раза выше указанной концентрации. Также гидроксид натрия может повлиять на pH культуральной среды, а токсическим действием могут обладать ионы серебра, неизбежно присутствующие в растворе.
Данные, представленные в литературе о токсичности коллоидных препаратов серебра, будь то комплексные соединения или непосредственно наночастицы, сильно отличаются в отношении концентраций, которые вызывают заметные патологические изменения в клетках или приводят к их гибели. В целом, авторы связывают это с индивидуальными особенностями клеточных культур, которые могут проявлять разную чувствительность к действию коллоидного или ионного серебра. Здесь необходимо отметить, что непосредственно частицы коллоидного серебра проявляют крайне низкую цитотоксичность, токсичными являются поверхностно-адсорбированные вещества, а также ионы серебра, которые в большом количестве образуются при попадании наночастиц в кислое окружение, например, лизосомы. В статьях, посвященных изучению токсичности коллоидного серебра, обычно не рассматривается методологический аспект проведения данных экспериментов. Основной сложностью при использовании стандартных методов определения жизнеспособности для исследования токсичности коллоидного серебра является то, что наночастицы обладают плазмонным резонансом, что предполагает значительный вклад изменений оптической плотности токсиканта в общее ослабление света тестируемым образцом. Таким образом, при применении только одного типа методов, например, спектрофотометрических, можно допустить ошибку в определении основных токсикометрических характеристик. Для оценки цитотоксического действия отдельно коллоидных наночастиц и растворенных веществ, путем центрифугирования при 13 000 g в течение 15 минут были получены две фракции: надосадок светло-желтого цвета, содержащий минимальное количество мелкодисперсных наночастиц, и бурый подвижный осадок, содержащий основную фракцию наночастиц. Данные атомно-абсорбционной спектроскопии определения серебра в стоковых растворах показали, что супернатант содержит 13% металла от исходного раствора СНСф-20.
Мы использовали культуры как животных, так и растительных клеток, чтобы определить, какие из методов определения жизнеспособности лучше подходят для исследования цитотоксичности.
Жизнеспособность популяции D.salina определяли по изменению оптической плотности суспензии в области красного максимума поглощения хлорофилла. Мы использовали планшетный вариант измерения жизнеспособности, поскольку это позволяет избежать процедуры экстракции хлорофилла и оценивать кинетику его фотодеструкции, сопровождающую гибель клеток. Интактные клетки сохраняют свою окраску, при этом концентрация хлорофилла пропорциональна количеству жизнеспособных клеток. Это позволяет судить о количестве живых организмов и кинетике развития популяции. Результат гибели клеток, регистрируемый фотометрическим способом, надежно проявляется уже через 24 ч наблюдений. В лунках, где произошла гибель клеток, взвесь обесцвечивается. В этой части исследования нас интересовали в первую очередь ограничения, накладываемые на систему колориметрической детекции, связанные с применением частиц с выраженным плазмонным резонансом, с учетом сложного характера эволюции их спектров в процессе агрегации. Мы также подсчитывали живые и мертвые клетки в инвертированном флуоресцентном микроскопе. Мертвые клетки выглядят как объекты с голубым (без красного) свечением при возбуждающем освещении на длине волны 355 – 425 нм (кубик-делитель D). Корректный подсчет живых клеток возможен лишь в химически фиксированных культурах после полного оседания клеток. При этом он осложнен тем обстоятельством, что в контрольных образцах клетки лежат на дне лунки более чем в 1 слой. Однако даже на таких изображениях единичные мертвые клетки достаточно надежно дифференцируются и могут быть подсчитаны. Микроскопическую оценку в данном случае проводили на культуре, фиксированной глутаровым альдегидом после 48 ч инкубации с токсикантами. Мы провели сравнительный эксперимент по токсическому действию СНСф-20 и его супернатанта. Данные фотометрических и микроскопических анализов приведены на рисунке 13.
Определение жизнеспособности животных клеток методами флуоресцентной микроскопии
Таким образом, клеточные культуры проявили разную реакцию на воздействие фосфата декстрана. По данным микроскопического наблюдения ни для одной из клеточных культур для всех концентраций не было замечено отклонений в морфологии клеток. Чтобы установить возможное влияние фосфат декстрана на восстановление МТТ-реагента мы провели дополнительное исследование, проведя стандартный МТТ-тест в лунке без клеток. Было установлено, что наличие фосфат декстрана в лунке не оказывает влияния на восстановление МТТ-реагента.
Далее исследовали совместное влияния фосфата декстрана и ЗНСф-50 на дыхательную активность клеток (Рисунок 35). Для клеток HEp-2 получили значительный прирост дыхательной активности, до 200% при концентрации фосфата декстрана 12,5 мг/мл. Для клеточной линии C6 отмечали рост дыхательной активности при концентрации фосфата декстрана 3,13-12,5 мг/мл по сравнению с меньшими концентрациями. Для клеток SPEV-2 фосфат декстрана проявил наибольшую токсичность, LC5010 мг/мл. По результатам микроскопического исследования культур HEp-2 и C6 морфологических изменений клеток не отмечено. Для клеток SPEV-2 в лунке с концентрацией 12,5 мг/мл отмечено полное открепление клеток от субстрата, для остальных концентраций морфологических изменений клеток не отмечено.
Таким образом, мы определили, что входящие в состав коньюгата ЗНСф-50 и фосфат декстрана (при концентрациях выше 12,5 мг/мл) оказывают негативное влияние на дыхательную активность клеток, как по отдельности, так и при совместном воздействии. При исследованных концентрациях они не оказывают влияния на оптическую плотность раствора в лунках и не изменяют показания МТТ-теста.
Далее исследовали цитотоксичность только проспидина (Рисунок 36). Все клеточные культуры при больших концентрациях проспидина оказались одинаково чувствительны к препарату. При концентрации 64 мг/мл снижение дыхательной активности составило почти 100%. Снижение дыхательной активности для всех клеток происходит по линейному закону при увеличении концентрации проспидина с 4 мг/мл до 64 мг/мл. LOEC для клеточных линий HEp-2 и C6 определена как 8 мг/мл, для SPEV-2 менее 2 мг/мл. По данным микроскопического наблюдения в лунках с концентрацией 64 и 32 мг/мл все клетки откреплены от субстрата, округленные, с явными признаками грануляции цитоплазмы. В лунках с концентрацией меньше 16 мг/мл морфологических изменений клеток не отмечено.
Для комплекса проспидин+фосфат декстрана наблюдали уменьшение цитостатической активности для всех концентраций по сравнению с только проспидином (Рисунок 37). Для культуры HEp-2 при концентрации 4 мг/мл был отмечен прирост дыхательной активности на 36±5%, в то время как для только проспидина при данной концентрации отмечено незначительное повышение дыхательной активности на 42%. Снижение дыхательной активности клеток SPEV-2 на 20% достигалось в лунках с только проспидином при его концентрации около 10 мг/мл, в случае же с комплексом проспидин+фосфат декстрана это концентрация составила 18 мг/мл. Аналогичное уменьшение отмечено и для клеток C6. По данным микроскопического наблюдения, для клеток C6 и HEp-2 в лунках с концентрацией 64 и 32 мг/мл все клетки открепились от субстрата, начиная с концентрации 16 мг/мл монослой представлен в неизмененном состоянии. Для SPEV-2 полное открепление клеток наблюдалось только при максимальной концентрации. Таким образом, наблюдали значительное снижение эффективности комплекса проспидин+фосфат декстрана по сравнению с только проспидином.
Далее сравнивали цитостатическую активность коньюгатов проспидин+ЗНСф-50 и проспидин+фосфат декстрана+ЗНСф-50. Коньюгат проспидин+фосфат декстрана+ЗНСф-50 реализовывали в двух вариантах. Первый вариант заключался в смешивании заранее приготовленного конъюгата проспидин + ЗНСф-50 с фосфатом декстрана, а второй вариант добавлении комплекса проспидин+фосфат декстрана в лунку с заранее добавленными наночастицами. На рисунках 38-40 представлены гистограммы изменения дыхательной активности клеточных линий после инкубирования с обеими вариантами в сравнении с конъюгатом проспидин+ЗНСф-50. Наибольший интерес для нас представлял диапазон концентраций проспидина, в котором при отсутствии ЗНСф-50 препарат оказывал слабое цитотоксическое действие на исследуемые культуры клеток, в данной случае это диапазон от 2 до 8 мг/мл.
Для всех клеточных культур отмечали снижение цитостатической активности конъюгата проспидин+фосфат декстрана+ЗНСф-50 в обоих вариантах для концентраций проспидина 2-8 мг/мл по сравнению с конъюгатом проспидин+ЗНСф-50, вплоть до превышения контрольных значений в отдельных лунках на 42±10%. Также было установлено, что первый вариант синтеза конъюгата менее предпочтителен.
Мы предположили, что снижение общей эффективность конъюгата проспидин+фосфат декстрана+ЗНСф-50 может заключаться в недостаточной скорости десорбции проспидина. В живом организме данный гель подвержен физическому воздействию, которое совместно с диффузией способствует десорбции проспидина. В лунке культурального планшета мы имеет механически изолированную систему, в которой отсутствуют конвекционные потоки культуральной среды, и весь объем в лунке находится в состоянии покоя, поэтому десорбция конъюгата может быть снижена. Для проверки нашего предположения мы дополнили схему эксперимента. Использовали клеточную культуру С6 как проявившую наибольшую чувствительность к действию конъюгата, из двух вариантов получения конъюгата выбрали первый. Время инкубирования увеличили до 48 часов, среда во всех лунках периодически аккуратно перемешивалась с помощью автоматической пипетки. Мы сравнили дыхательную активность клеток после 48-часового инкубирования с пипетированием и 24 и 48-часового инкубирования без пипетирования (Рисунок 41).
На основании полученных данных было установлено, что пипетирование не изменяет скорость десорбции конъюгата, разница в дыхательной активности клеток в лунках, в которых среда перемешивалась и оставалась нетронутой, находилась в пределах стандартного отклонения.