Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время более чем для 100 болезней человека установлено патофизиологическое значение активних фори кислорода (АФЮ (Halliwel,1994). 0; шм из наиболее перспективных направлении для борьбы с ниш является создании лекарственных препаратов на основе зупероксидднемутазы (СОД) -антиоксидантного фермента организма, т.к. он участвует в пре-рнвании цепей генер ции к'.'Л на начальном эт-^е их образования, катализируя дисмутацию супероксидных радикалов, включается в естественный путь катаболизма, и не обладает токсичностью, аллергенностыз и др. показателями бионесовместимости. Однако, эффективность применения СОД в качестве терапевтического средства ограничена быстротой ее выведения .из организма, а также тем, что она является генераторов перекиси - предшественника ОН* и субстрата длядру.оп. мощного источника разнообразных кислородных радикалов - шелопероксидазы {ШОК
Для пролонгирования действия СОД применяют химическую модификацию фермента различными агентами, что позволяет во много раз увеличивать время ее пребывания в кровотоке. Общеизвестными критериями оценки таких модифицированных форм СОД .являются следующие показатели: 1) время полувыведения фермента из организма; 2) терм'устойчивость; 3) рН-устойчивость. Но для создания эффективного лекарственного препарата. на основе СОД этих критериев, как мы считали, недостаточно, т.к. 'з условия* очага воспаления дейстчуит лейкоцитарные оксиданты, наиболее разрушительными из которых являются ОН' и ОСІ", "днако, исследования устойчивости модифицированных форм. СОД к действию этих оксидантов на проводятся.
Кроме того, для "яучшения эффективности СОЛ-терапик целесообразно, наряду с использованием модифицированных форм СОД, одновременно удалять генератор наиболее токсичных оксидантов -МПО из экстрацеллюлярного пространства очага воспаления, зоны деструктивного действия этого фермента.
Таким образом, .исследования, направленные на выявление возможных эндогенных механизмов удаления ШІО из организма, а также на изучение устойчивости модифицированнъг форм СОД к инактивации при 'действил лейкоцитарных оксидантов с целью
выявления наиболее устойчивых из них являются перспективными, актує 'хьными и представляют большой практический интерес, т.г. будут способствовать созданию новых терапевтических средств противовоспалительного действия.
Связь темы с планом научных работ. Диссертация выполнялась по проекту: "Разработка нового ферментного препарата медицинского назначения - супероксиддисмутазы" в соответствии с приказом Министерства Науки РФ & 0769Ф от 31.03.92.
Цели и задачи исследования. Настоящая работа посвящена сравнительному анализу устойчивости различных модифицированных форм СОД и нативного фермента к действию лейкоцитарных оксидантов очага воспаления, что может служить новым критерием для отбора наиболее устойчивых к инактивации форм фермента, а также выявлению _ возможных эндогенных механизмов, опосредующих удаление наиболее разрушительного лейкоцитарного фактора - МПО из зоны ее деструктивного действия. В соответствии с этим были поставлены'следующие задачи:
провести сравнительный анализ устойчивости нескольких модифицированных }орм СОД и нативного фермента к действию лейкоцитарных оксидантов: ОСІ", Н202, 0Н;
получить биоспецифические сорбенты для очистки ФН и IgG: желатин-агарозу, лизин-агарозу, белок А'-агарозу;
получить высокоочищенные препараты МПО, ФН (фибронектин) и IgG (иммуноглобулине); '
получить биоспецифические сорбенты для изучения комплексообразования МПО с опсонинами плазмы крови человека: ФН-агарозу, МПО-агарозу, IgG-агарозу.
изучить комплексообразование между МПО и ФН, МПО и IgG с помощью метода количественной аффинной хроматографии.
Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ устойчивости различных форм СОД (нативной и модифицированных) к инактивации при действии оксидантов очага воспаления, и, таким образом, предложен новый, более функционально обоснованный критерий для отбора наиболее устойчивых форм фермента.
Усовершенствованы известные методы выделения и очистки белков: МПО, ФН и IgG, что позволило получить более высоко очищенные по сравнению с аналогами препараты этих белков.
Предложена схема иммобилизации ФН на BrCN-активированной агарозе. Это позволит изучать его гомеостатическую функцию по удалению в составе комплекса продуктов деградации тканевых структур и белков, циркулирующих в организме, а также использовать его„ в частности, для целей аутогемотрансфузии.
*
Выявлено, что МПО является лиг ндом ФН и термоагрегирован-ного IgG (функционального аналога ЙК), что намечает пути для удаления МПО из ас а ее деструктивного дрчствия. Определены количественные параметры комплексообразования между ШІ0 и ФН, а также МПО и термоагрегированным IgG, а тленно константы диссоциации и количество участков связывания.
Практическая значимость. Предложены критерии устойчивости ряда форм СОД (нативных и модифицированных), более адекватно учитывающие такие условия в оче 'е воспаления, как высокие концентрации АФКІ Усовершенствованы ранее известные методы выделения и очистки ШЮ, ФН, IgG, что позволило получить более очищенные препараты этих белков. Предложена схема '".мобилизации ФН на BrCN-активированной агарозе, что позволит изучать его комплексирующую функцию по поддержанию внутреннего гомеортаза организма, а также для разработки рекомендация по Использованию ФН в эфферентной терапии. Обнаружено, что МПО является 'Лігандом д-я ФН и термоагрегированного IgG, что свидетельствует о принципиальной возможности разработки Средств удаления МПО из зоны ее деструктивного чействия а организме й тем самым улучшить эффективность СОД-терапии.
Апробация работы. Резул'таты работы были предстар'ены на Ьбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института км. Пастера (С.-Петербург, 1993), на Международных конференциях "Biotechnology St.Petersburg 94м и *Спид, рак и родственные проблемы* <С.-Петербург. 1995). Материалы работы отражены в трех статьях, принятых в печать.
Публикация работы. Основное содержание диссертации опубликовано в 4-х работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глач, выводов и списка литературы, включающего 304 названий, в т.ч. 249 иностранных авторов. Работа содержит 177 страниц, в том числе 35 рисунков, 7 таблиц.