Введение к работе
.:, л,',' " J І.
І«І» Актуо д нооть течьг. В разситіш современник проблем 'імтзхшдагки значительное №сто зешает кудьтітаїропошіе клеток із тканей животных и челезекз вкэ органг.зка (солоі-і-сп З.Д,, йктсмироз р.Л.,1963; Сергеев Б.А..1976; Дьяконов Д.П.,1933; тьяконов Л.П. и Др., 1935, 1937; Eve$e .Я. tt al,, 1935; tdyt'te ,'/.й< й «г/., 1933). кульмшгрускые клетки попользуется ;ля реиения мясгях гаучнах я цркхлзднах задач сельского хозяйства, мвдпцшш к йишогки. Ояи яддяится >;а;.шим объектом при їзучеши канцерогенеза и дтіффзревдіровки кло:'о.\- з згтрусологя-іескнх, бкохгаллесісих и другзх деследозаидях.
При работе с культурам:! клеток необходимо выполнять, определённые требования к посуде, прибора;.:, nc.wmptn.qw к парзмзт— :іа.м еязшнєй среда, окружающей глет:., знраетззо::;з /л I'itfo . Кдетки зхивотных а человека для свеэго развития яу.-жштая з яа-пїзяом белке» В кудьтуральЕЕЗ среди пообходжо доСзглять (5--: одо--?ччеекие гддкеегл, содер.^цие юсс;{емолелул.яряые беды: и связанные с ней! вещества, Налболео часто употребляемо!! бяологя-теской .жидкостью является сыворотка крови глво'мщх ( 7г ., 1974; Голубев Д.Б. к ДР., ГС73; АДзк P., I223lvef3 Х. zt лі., 1985; Jaytvefi.W. еі а/., іззз; коккл д. и др., IS8S). Чаще кспользуется сшоротка крови взрослого крупного ро-гаюї'о скота, но при культивирования наиболее ценных лший кяе-гок и гибридом припишется сиворотка крови з::фяокав крроз, но её eiidqkoq Еспользогание ограничивается, прежде всего, дефіцитом, пнсокоЗ стстаооть», а такке шзким уровнем технологии получения. Для увеличения сбъй/з производства и улучшения качества сиворотки крови животных (особенно онвороткн крови эмбрионов коров) яеобхедааю совершзясгвевакле технология её получения, з оуіцестзувдах г-етоддках получения пильных сивороток кро-вд взрослых «ивотяых и их зкбрионод { Лол д., 1953; Голубез Д.Б. и др.,1376; .Болотников и.А., Соловьев Ю.В., 1980; ТГа'ійії . et al.,1932; Ійулея д.р. е др., Г983; гекзнш г.іг. и др., 1983; хазипов н.З. и др., 1985; franz ft ct г I., I98b; Wittmunn W. tt u/.t 1985; Еондрашова 3.С. я ДР., 1937) не отражены должным образом отдельные этапы технологической цепи получения сыворотки, особо ото .касается способа взятия крови з отделения сыворотки, а существующий способ получения
сыворотки кровЕ птиц (Болотников И.А., Соловьев Ю.В.,К80) при годен лишь в лабораторных условиях к не может быть примечен для прсмжленного производства её в условиях мясокомбината, эт стало одной из прятан редкого использования сыворотки крови птиц, хотя в период становления культур клеток и тканей широко применялась плазма и сыворотка крови кур.
1.2. Цель я задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось усовершенствование технологий получения сивороток кроза кур, бычков,'эмбрионов коров для культивирования кле ток тканей животных. В этой связи были поставлены следующие за дачи:
-
Разработать прогагаленнаЯ, пригодный для условий мяо оком бянато, способ получения цельной сыворотки крови птиц.
-
Усовершенствовать способы получения цельных сывороток крози крупного рогатого скота: бычков и, особенно эмбрионов кс роз, с целью увеличения производительности к улучшения качества конечної продукции.
І,? 3. Разработать простой и общедоступный способ получения кэ цельных, сывороток кроза животных препаратов типа А с пониженным содержанием обаето белка (в том числе jf -глобулинов), евс-бодного гемоглсбигэ, общих линвдоз, э той числе обцего холесте рияа, с целью поиска альтернативных заменителей "ольиой сыворотка крови мбраояов коров, .
1.2.4. ПроБзстк сравнительное изучение цельных сывороток крови кур, быкоз, йіібрионоз коров и препаратов типа А. полученных из них, по некоторым физико-химическим к биохимическим показателям с целью установления раїличий мегцу ними. 1.2.Б. Цровести сравнительное изучение цельных.сывороток крови кур, бычьей, эмбрионов коров и препаратов типа А, полученных из них, по ростовым свойствам при к. лвтюжроваияи линий клеток НГУК-І, РК-І5 и Ve ГО .
1.3. Научная новизна работы. Впервые разработан способ по лучения цельной сыворотки крови птиц, позволяющий производить её на лроьщшіенноЗ основе в условиях мясокомбината. Для ооущес влеяая этого способа сделан столик для фиксации птицы и система для взятая крови - СВК-2. По данной разработке 12.04.88 г. была подана заявка на про .полагаемое изобретение: "способ полу чекпя сыворотки крови птиц" и получено авторское свидетельство * І6ІІЗЗ.,. Разработан способ взятия крови из сердца эмбрионов
лов о использованием устройств длл его осуществления. Пройму-їства предлагаемого способа взятия краги у э;.'йриолот; кораз л шокупяостн дают возможность для увеличения осъеш забираемо;'! роди е сравнении с существующими способами в 1,5-3 разе, что, >ответственно, ведог к сшзсеякю себестоимости конечной прцдук-ш. по отой разработке 12.01.83 г, было и ода па заявка на предлагаемое изобретемте: "Способ взятия крови из сердца ялбрио-т коров". Но заякгу И 4636099/Г5 (008999) получено поленитз.и-36 деление ВЖЙГПЭ от 25.10,89 г>. пз выдачу авторского сп:;де~ зльетва, кроме взятия крови проведено ювериенствовлнне отде-эпяя, сбор? и стерилизации цельно:-; сыворотпк крози эмбрионов проз. Усовершенствованы отдельное этапы получения сыворотки рови бычьей. Разработан способ получения из цельны." сывороток рови кур, бичков к омбрнснов коров препаратов типа А, которые о бизико-химическим показателе к ростовим сзоістег..м могут ыть альтернативными ззкенятеяяглг цельной ещороткт: проби змбрп-яов коров. По данной разработке оформлена гаягпз «< 4820232 048194) на предполагаемое изобретение: "способ повышения ка-естза сызоротки крови животных для культивирования культур леток" от 27.04.90 V.
Выполненная работа является частью планових я<".' w;; .._..
>тдеяа культур клеток и гштзтелышх сред ВЕАК1 (г. > '.'>
:ер государственной регист^лцаи 01860093070.
1.4. Практическая ценность работы, yor-Bi-p,,!-,.- . ^е тех-
ІОЛОГИИ Получения !Т,ЄЛі,НТ/. СЫЕОрОТОК КРОВИ КУР, ОиЧлСд и імбрио-
10В коров снижают затраты труда и создают возможность для уве-мчения объема их производства. Разработанная технологии полу-іения препаратов типа А - простой и общедоступный способ повніє вия качества еыво.готки крови животных для культивирования меток,
1.5. Публикация результатов исоледрг,- чий, да теме диссер
тации опубликовано 3 статьи, подано 4 заявки на предполагаете
ізобретения (по 2 из них получены авторские свидетельства, а
ю 2-м - положительные решения) и оформлено б рационализсторсоне предложений.
1»6. Внедрение результатов исследовании. Результат.:; ПрОі-г-гзидыя исследований внедрены на Казанском мтсскомбн.Ъте ;: и о МЇШ (г.Казань) при получении цельных сывороток цр-j;-... :„:.^тг.::х і препаратов типа А длякультивировалыя лерезглзае.-.-.иу ллн::;: кл---
ток, б тон числе П'їсрзідел.
!? С^ьем, и стпуктур-з цтаоертаїші. Матеріали диссертация кз".ог;еші на 207 страилц-ї.1: маїпіасгисаого текста к состоят і* з общо!! характеристики рзботи, обсорс літератури, собственных исследований, оСсуэдс-ная результатов исследокмшй, внводоа, практических пглуюзонпл, сгоіска літератури ?: сцраакт. о внедренной " утвер>;денно:: ізаучцо-їєишчзскоЯ докуіїзнтоцли па результатам коследозан;;3. їсйст диссортацгш иллюстрирован 25 тсйлк-цьиа а 32 р'лсунхак;. сиісск література включає? 235 ксточимкоз, в іл. 169 иностранных.
1.8. Оо'.'оянна соло^егю;., вннссте.ш ні зягдатд: І.З.Ї. Уоо2«;ріііеіістлошшіио способи получения цельных сивороток і'.роіул атщ, Сіічїхз и гибркоііов короо.
1.8,2» Обоснсзаііке способа получения из цельных сывороток крови кур, сычксБ її ілбрі'.оііов ксоров прс-.заратов типа А. Многообразие ьозможмах вариантов способа.
1.8.3. Результати изучеикя цельных сывороток крова жііботішх и
ИХ ПроіЕрЗТОЗ ТИЕсї Л ПО HSKOTOpUM $ІЇЗИКО-ХІ1МїГ'іЄСКЕМ К СИОХЕКД-
чєск-іи ііокезателям.
1.8.4. Результата изушня ростових свойств цельных сивороток
ісроЕЛ глвоткых и цх прзнаратов тшіа А на ікрезкв^ешх культурах
клеток НГУІМ, РК-І5 и І/е го .
2. ГіЛТЕРІШіІ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалом для получения цельной сыворотки служила кровь, усбираег.ая из сердце кляжчески здоровых кивотных, поступающие ш конвейер, ігри убое их но казанском мясокомбинате, Крозь брали У кур с живой массой от 2,0 до 4,5 кг, у бачков - о жиао'іі кассой 300-400 кг к у эмбрионов коров с лзївой ї.йсоой от 0,5 кг z больше.
Получение цельных сыгороток крови животных проводилось как по известным методикам: у кур (Болотников и.А., Соловьев Ю.В., icao), у биздоз (циг. по Антонову Б.И. и др., 1966), У эмбрионов короз (хазипов Н.З. и дір., 1985>, так и по модіфідирозан-нж nnr.-л способам.
Наряду с цельными снвороткзкг крова животный б опитах ;те~ :олъзоззлись предзраты типа л с іизкш содепг.аниеы оби;;го бел-а, осщих лнпвдоз, в том числе общего холестерина, свободного 'Є'.одлобкна. Материалом для их получения служли гтсдипо cAv>->отки крови кур, бачков и окбриодо.ч коров, кохорка подвергали акорозке о последувщнм их оттаиванием, зэтсы ообиряли лишь светлые слои ешзороток, качиная сверху, до границы раздела их : гемолпзирсванньки слоями и проводил:! стерилизующей фильтра-(ию.
Определение прозрачности і? контроль сыворотки т зозмед-100 присутствие конгап'нантоз - бактерий, ппсаплазп, вирусов
[ ПО РОСТСТЛІЩДИР.УІИЗЙ акТИШІпОТИ прОБОДЗДКСІ. ПО ОСіДЗПрКЛЯЇКМ
ктодикам (Методические ре'даендагкш по контроло г.счєстез :гдд--:од сиворотки крови крупного рогатого скота, дрпмеялзііоїі в та-индийских її биологических целях, 1932). По общепріпіяїпл методикам в сыворотке определялось содержание обдего белка (інструкція по. определении общего белка з сиворотка кроїш по бпурєто-зой реакции, 1972), свободного гемоглобіни (Инструкция по определению гемоглобина крови ге;яіглоспяцнанкдннм методом, IS74), збцхх дигшдов (Инструкция по определению общих лишідев, 1932) і )бідего хотестерияа (Колб З.Г.. Какнаїников B.C., 1976) и рН зшзоротки (методические уягзаяля по применению фззкко-хк.япес-mx методов контроля медицинских биологических препаратов, [977).
Для изучения ростовых свойств сывороток крови здвотннх «^пользовались постояннее линии клеток РК-І5, НГ7Н-І л Vefv Культивирование клеток проводилось по общепринятой методике (АЗакс Р., 1983). Такие яо общепринятой методике определялся індекс пролиферации клеток, как показатель росгсткмулкрующея активности сыворотки крови (Антонов Б.И., я ДР.і ID86).
Электрофорез сывороточных белков проводили з пластинах линейного градиента полкзкрилакидного голя ( 5 -г 10) по методу, изложенному в книге Холода З.М, (1983).