Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Основная часть 10
2.1. Обзор литературы 10
2.1.1. Методы определения стельности у крупного рогатого скота 10
2.1.2. Методы лиофилизации биопрепаратов 28
2.1.2.1. Основы процесса лиофилизации 28
2.1.2.2. Вспомогательные вещества, применяемые в процессе лиофилизации 33
2.2. Материалы и методы исследований 37
2.3. Результаты собственных исследований
2.3.1. Разработка технологии изготовления лиофилизированной модификации иммунологического биопрепарата для диагностики стельности коров 40
2.3.2. Выбор условий замораживания экспресс-теста 43
2.3.3. Разработка режима сублимационной сушки биопрепарата 46
2.3.4. Изучение влияния толщины слоя раствора на качество лиофилизата экспресс-теста
2.3.5. Подбор параметров для стандартизации лиофилизиро-ванного иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров 52
2.3.6. Изучение диагностической эффективности модифицированного биопрепарата для определения стельности коров 58
2.3.7. Экономическое обоснование результатов исследования 64
2.3.7.1. Учет затрат на диагностику стельности коров стандартным и новым способами 64
2.3.7.2. Определение экономической эффективности профилактики бесплодия коров за счет ранней его диаг
ностики с использованием иммунологического теста 65
2.3.8. Обсуждение полученных результатов 67
3. Заключение 80
3.1. Выводы 80
3.2. Практические предложения 81
3.3. Перспективы дальнейшей разработки темы 82
Список литературы
- Методы лиофилизации биопрепаратов
- Разработка технологии изготовления лиофилизированной модификации иммунологического биопрепарата для диагностики стельности коров
- Изучение диагностической эффективности модифицированного биопрепарата для определения стельности коров
- Перспективы дальнейшей разработки темы
Введение к работе
Актуальность темы. Увеличение продуктивности коров напрямую зависит от условий содержания, кормления и правильной работы по воспроизводству.
Без строгого ветеринарно-зоотехнического надзора, позволяющего планировать на протяжении календарного года запуск, роды, осеменение животных и текущую внутрифермерскую работу; своевременно пополнять стадо молодняком, квалифицированно осуществлять выбраковку животных, непригодных к воспроизводству, невозможно осуществлять мероприятия по борьбе с бесплодием крупного рогатого скота на животноводческих фермах.
Для достижения этих целей требуются регулярные диагностические исследования на стельность и бесплодие, а также постоянный учет в маточном стаде основных групп коров: стельных, в послеродовом периоде, осемененных, но не проверенных на беременность и бесплодных.
Степень разработанности темы исследований. В настоящее время существуют различные методы определения беременности. Все они неравноценны и различаются рядом особенностей, меньшей или большей специфичностью и достоверностью. Эти методы в разной степени сложны по технике выполнения и отличаются также скоростью наступления реакции, что имеет большое практическое значение (В.В. Храмцов, 2007; С.А. Хадер, 2000; А.М. Семиво-лос, 2001; В.В. Руденко, 2000; Г.П. Дюльгер, А.Г. Нежданов, 2006).
Для ветеринарной практики был разработан иммунологический экспресс-тест, определяющий стельность крупного рогатого скота (М.А.Богданова, 2008). Жидкая форма препарата требует определенного режима хранения и транспортирования – от +2 до +4ОС, нарушение которых как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры может приводить к снижению их активности. В связи с этим возникает необходимость совершенствовать форму выпуска экспресс-теста, позволяющую исключить вышеуказанные отрицательные воздействия. В данном аспекте одним из решений проблемы является разработка лиофилизированной формы диагностикума.
Цели и задачи исследований. Цель настоящих исследований – усовершенствование технологии получения экспресс-теста для диагностики беременности коров путем разработки лиофилизированной формы препарата.
Для решения данной цели мы поставили следующие задачи:
-
подобрать оптимальные параметры лиофилизации иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров;
-
определить диагностическую точность иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров в лиофилизированной форме и экономическую эффективность его применения;
-
разработать нормативно-техническую документацию, регламентирующую изготовление и применение иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров в лиофилизированной форме.
Научная новизна. Впервые получены данные об оптимальных режимах лиофилизации биологического препарата для диагностики стельности коров.
Получены данные о влиянии лиофилизации на качество и диагностиче-
скую эффективность иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров.
Усовершенствована технология получения иммунологического биопрепарата для диагностики стельности коров.
Практическая значимость работы. Для ветеринарных и зоотехнических служб разработана новая форма биопрепарата, позволяющая в кратчайшие сроки на ранних стадиях с высокой степенью достоверности устанавливать стельность.
Разработаны нормативно-технические документы, регламентирующие производство и применение экспресс-теста в лиофилизированной форме для диагностики беременности коров в условиях животноводческих ферм и частных подворий и требования к качеству биопрепарата с учетом интересов заказчиков, требований к продукции для жизни, здоровья людей и животных, окружающей среды.
Анализ технико-экономической эффективности внедрения лиофилизиро-ванной формы экспресс-теста показал, что экономическая эффективность диагностики беременности коров достаточно высокая и составляет до 13,30 руб. в расчете на каждый рубль затрат.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ; хирургии, акушерства, фармакологии и терапии ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА».
Методология и методы исследований. Исследования были проведены в период 2010–2017 гг. в рамках плановых научных исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА» (тема НИР: «Изучение нарушения гормональной регуляции репродуктивной функции животных и разработка методов определения ее патологии» (номер госрегистрации АААА-А16-116041110204-1), а также тематических планов-заданий на выполнение научно-исследовательских работ федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина» по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета на 2014 и 2015 гг. (№ госрегистрации: 01201460234; 115042810002).
Работа выполнялась на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА», ООО «НТЦ «ПромТехЭнерго», ООО «НТЦ «Биотек».
Изучение диагностической эффективности разработанного метода проводили в животноводческих хозяйствах Ульяновской области.
Полученные цифровые данные лабораторных исследований обрабатывали методом вариационной статистики на ПК с использованием программ «Microsoft Exel» и Sstat. Достоверность сравнимых показателей определялась по критерию Стьюдента и критерию Фишера.
Основные положения, выносимые на защиту диссертации:
– параметры лиофилизации иммунологического теста для определения стельности коров;
– результаты производственных испытаний лиофилизированной модификации иммунологического теста для определения стельности коров;
– нормативно-техническая документация, регламентирующая изготовление и применения препарата.
Степень достоверности и апробация результатов исследований. Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается достаточным количеством наблюдений, современными методами исследования, которые соответствуют поставленным в работе целям и задачам. Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, подкреплены убедительными фактическими данными, наглядно представленными в приведенных таблицах и рисунках. Подготовка, статистический анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации.
Основные материалы диссертации апробированы с 2010 по 2017 г.г. и представлялись на следующих научных конференциях и конкурсах:
– V международная научно-практическая конференция "Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2012);
– VI международная научно-практическая конференция "Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2013);
– международная научно-практическая конференция "Молодежь и наука XXI века" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2014);
– выставка инновационных достижений международного инновационного форума молодых учёных "U-NOVUS" (Томск, 2014);
– международная специализированная выставка племенного дела и технологий для производства и переработки продукции животноводства «Агро-Фарм-2017» (Москва, 2017).
Результаты научных исследований отмечены призовыми местами следующих конкурсов:
– первое место по итогам конкурса "Я - Инноватор", состоявшегося в рамках Международного молодежного научного аграрного форума (Ульяновск, 2014);
– прохождение в международную группу "100 инноваторов" Московского международного форума инновационного развития "Открытые инновации" (Ульяновск, 2014).
– гран-при в номинации «Лучшая научная разработка – АгроФарм 2017» (Москва, 2017)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 6 научных статей, из которых 3 – в изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых долж-
ны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук».
Личный вклад автора. Участвовал в планировании диссертационного исследования, непосредственно проводил литературный поиск, экспериментальные исследования, осуществлял статистический анализ. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, практические предложения, список использованной литературы и 8 приложений.
Работа иллюстрирована 8 таблицами, 13 рисунками. Список использованной литературы включает 179 источник, из которых 72 иностранных.
Методы лиофилизации биопрепаратов
Анализ информационных источников по состоянию исследований в данном направлении, в том числе по проблемам контроля воспроизводства животных показал, что существующие методы диагностики стельности коров неравноценны и отличаются рядом особенностей, большей или меньшей специфичностью и достоверностью.
В арсенале ветеринарных специалистов имеется большое количество различных методов диагностики беременности у самок сельскохозяйственных животных: - клинические методы исследования – рефлексологический (основанный на учете реакции самки на самца), наружный (осмотр самки, пальпация брюшной стенки и аускультация), внутренний (вагинальный и ректальный). - лабораторные методы – определение беременности по изменению физико-химических свойств цервикальной слизи, по концентрации половых гормонов в крови или молоке, и др. [23, 25, 40, 92, 93, 94, 95]. Разработанные отечественными [36, 49, 107] и зарубежными учеными [158] клинические методы исследования позволили ветеринарным специалистам диагностировать беременность или ее отсутствие у самок сельскохозяйственных животных.
Клинические методы диагностики беременности у животных основываются на комплексе анатомо-топографических и физиологических изменений, возникающих в организме и в половых органах коров в связи с плодоношением. Эти изменения сопровождаются характерными симптомами, которые могут быть легко обнаружены общепринятыми методами клинического исследования – осмотром, пальпацией и аускультацией. Метод осмотра является большей частью общим клиническим способом исследования беременного животного для объективного изучения его состояния перед родами. Метод пальпации позволяет диагностировать беременность только с 5-6 месяцев [26].
Следует отметить, что осмотром, пальпацией не всегда точно можно установить бесплодие, а также сроки беременности, но они могут быть использованы в отдельных случаях как вспомогательные способы [42, 43, 60].
Существует клинико-рефлексологическая диагностика беременности у коров, основоположником которой является Н.Н. Гавриленко [17]. Принцип ее заключается в том, что у беременных животных после 20-25 дней от начала оплодотворения не проявляется половая охота (положительная реакция на быка). У небеременных коров половая охота периодически повторяется через каждые 20-25 дней. В дальнейшем данный прием получил глубокое научное обоснование в работах В.С. Шипилова и др. [106]. Появилась система учета и контроля на основе «Календаря техника по искусственному осеменению животных», давшая возможность ставить диагноз на стельность или бесплодие в течение первых 30 дней после осеменения. Точность этого способа диагностики составляет 92-100% [69, 70, 67, 92]. Однако и он не лишен недостатков. Во-первых, в хозяйстве необходимо держать специальных «быков – пробников», которые выявляют в стаде коров с половой охотой (повышенной сексуальной активностью), а это сопровождается дополнительными затратами на содержание, кормление и обслуживание пробников. Во-вторых, при акушерско-гинекологических заболеваниях у коров половая охота может не проявляться, и это приводит к ошибочному мнению, что данная корова беременна.
В.П. Попков предлагает исследование кожно-висцеральных рефлексов как один из методов рефлексологической диагностики беременности [68]. Этот метод основан на изменении электрочувствительности кожи в связи с беременностью. У беременных животных возникают и постоянно поступают в область поясницы биотоки, в результате чего понижается электрочувствительность кожи и повышается порог возбудимости нервно-мышечных элементов в этой области. Автор предлагает использовать гальванический аппарат, способный давать на выходе электродов при нагрузке 1200 Ом, 60 В и 50 Ма. Один электрод является активным, точечным. Второй – в виде пластины Точечный активный электрод, идущий от отрицательного полюса аппарата, накладывают между 1 и 2 поясничными позвонками, а второй – на область крестца. Затем включают аппарат и потенциометром подают ток силой до 40 Ма. По данным автора, реакция на действие тока такой силы у беременных отсутствует, а у небеременных возникает сокращение мышц и прогибается поясница. Достоверность метода составляет 58-73%.
В.В. Руденко предлагает комплекс моделей и алгоритмов для автоматизированной диагностики ранних сроков беременности животных методами рефлексодиагностики [75]. Объектом исследования – энергетические характеристики информативных проекционных зон и в частности биологически активных точек, полученных с помощью специально разработанного алгоритма.
В практике скотоводства в качестве контроля воспроизводства широко используется ректальный метод исследования, впервые предложенный Ларсеном в 1895 году и усовершенствованный Н.Ф. Мышкиным [51, 52, 53].
Мышкин Н.Ф. внес кардинальные изменения в методику ректального исследования животных, сущность которых заключалась не в отыскании плода, как это делалось прежде, а в исследовании состояния самого органа – матки, в которой может быть или не быть плод. Тем самым была обеспечена возможность точного установления сроков беременности, чего при прежних способах нельзя было достигнуть.
Этот метод не является техническим приемом, который может быть легко выполнен животноводом; такую работу должен выполнять только опытный ветеринарный врач с соблюдением элементарных санитарных правил (использование одноразовых перчаток и инструментов). К тому же рассматриваемый метод трудоемок и негигиеничен, кроме того, частые ректальные манипуляции неблагоприятно сказываются на состоянии как коровы, так и плода, а при неумелом их выполнении нередко приводят к абортам. Несоблюдение правил гигиены при массовом обследовании влечет за собой распространение инфекционных заболеваний [59, 69, 70, 88, 106].
К сожалению, точный диагноз, устанавливаемый даже опытным лицом, возможен только при обследовании коров с 3–4-месячной беременностью. Точность этого метода может достигать 95–100%
Высокая диагностическая эффективность усовершенствованного метода ректального исследования коров на беременность и бесплодие способствовала широкому внедрению его в практику ветеринарного акушерства многих стран [4, 24, 29, 38, 39, 85, 94, 122, 128, 151].
Висконсинские исследователи [178] сообщили о вполне удовлетворительном клиническом методе диагностики, который заключается в обнаружении в матке амниотического пузыря. Наиболее надежные результаты определения получены в период около 5 недель после искусственного осеменения, хотя была успешной и более ранняя диагностика
Разработка технологии изготовления лиофилизированной модификации иммунологического биопрепарата для диагностики стельности коров
Исходя из приведенных результатов, наивысшим разведением тестируемой сыворотки, которое выявляет в моче коров гормон хориогонин, является 1:400. 3-й этап. Конъюгация ализарина с антихориогонин – антителами. Адсорбция антихориогонин – антител на частицах индикатора (ализарина) является последующей стадией изготовления экспресс-теста. В лабораторной мельнице перемалывали 1 г ализарина до состояния пыли. Затем навеску гомогенизировали с 2-3 мл дистиллированной воды в роторном шейкере в течение 2-3 ч. После чего доводили объем суспензии до 20 мл дистиллированной водой, разливали в конические пробирки с завинчивающейся крышкой и центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 30 мин. Полученный осадок, отделенный от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 20 мл дистиллированной воды и повторно центрифугировали при тех же параметрах. Надосадоч-ную жидкость сливали, а осадок смешивали с 90 мл дистиллированной воды, переливали в колбу со стеклянными бусами и встряхивали в роторном шейкере 15 мин. Суспензию ализарина разливали в пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин 30 с. Надосадочную жидкость пропускали через предварительный фильтр, отделяя мелкодисперсную (1-1,6 мкм) взвесь частиц ализарина.
К 2 мл антисыворотки, разведенной в соотношении 1:5 с 1%-ым раствором борной кислоты, добавляли 10 мл суспензии ализарина, смесь помещали в термостат с температурой +37С на 2 ч, далее выдерживали в холодильнике при +4…8С в течение 13 ч. Далее раствор ультрацентрифугировали до просветления, надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 10 мл раствора 0,5%-ной борной кислоты на физиологическом растворе с добавлением 2% нормальной сыворотки кролика.
Полученный биопрепарат хранили в холодильнике при t +2…4С. Далее технология изготовления подверглась модификации. В соответствии с рекомендациями, изложенными в литературных источниках, в исходный препарат были внесены криопротекторы, формообразующие и стабилизирующие компоненты. В качестве формообразующего компонента, криопротектора и стабилизатора в биопрепарат добавляли 6% сахарозы. Последующие исследования были направлены на отработку различных способов заморозки, сублимации и досушивания. При этом использовали методики, использованные Аршиновой О.Ю. [2].
Подбор параметров заморозки образцов является первым этапом разработки оптимального режима лиофилизации биопрепарата. Поочередно осуществляли: выбор способа заморозки препаратов; определение температуры заморозки; изучение воздействия длительности заморозки на качественные свойства экспресс-теста.
При разработке технологии лиофильного высушивания иммунологического препарата для определения требуемой температуры замораживания необходимо установить точку эвтектики. Чаще всего температура замораживания устанавливается ниже эвтектической на 5-10С.
Термический метод является наиболее простым для определения эвтектической точки. В основе вышеуказанного способа лежит измерение температуры препарата, замороженного ниже эвтектической температуры, в процессе оттаивания. На выстроенной кривой измерений температуры образца в результате достижения точки эвтектики формируется площадка, в соответствии со временем, когда поступающее извне тепло не повышает температуру, а тратится на растапливание льда при имеющейся эвтектической «концентрации» препарата. Получить такое плато возможно при условии высокого содержания веществ в образце, исходя из этого, метод применим в нашем случае.
Для заморозки использовали полученный по вышеуказанной технологии иммунологический препарат для диагностики стельности, который разливали по 2 мл в пробирки вместимостью 15 мл, высота жидкости составляла 5 мм. Применяя термический способ, определили границы эвтектической зоны биопрепарата, которая распространялась от –3С до –5С.
Исследуя влияние скорости заморозки на структуру иммунологического препарата, последний дозировали по 2 мл в пробирки вместимостью 15 мл. Заморозку проводили на полках лиофилизационной установки до –50С, используя следующие методы: 1. Быстрая заморозка (рисунок 2) – образец помещали в камеру лиофилиза-тора при t +20 C, затем снижали температуру до – 20 С и выдерживали в тече 44 ние 1 ч (1 фаза). После этого температуру понижали от -20 до -30 C со временем экспозиции 1 ч (2 фаза), далее снижали от -30 до -40 C с экспозицией еще 1 ч, затем камеру охлаждали до температуры образца -45…-50 C, время выдержки при данной температуре составляло 3 ч (3 фаза); 2. Многофазная (медленная) заморозка – образец помещали в камеру лио-филизатора при +20 C, замораживали в течение 1 часа при – 20 C, далее 2 часа при – 30C, 3 часа при – 40 C, 4 часа при -45 C, затем температуру образца снижали до -50 C с выдержкой в течение 3 часов (рисунок 3).
Изучение диагностической эффективности модифицированного биопрепарата для определения стельности коров
При контроле качества и стандартизации лиофилизированных биопрепаратов необходимо учитывать следующие показатели: внешний вид, растворимость, значение рН, средняя масса содержимого в пробирке, точность дозирования, остаточная влажность.
Целью данного исследования являлся подбор оптимальных параметров для контроля характеристик лиофилизированного иммунологического препарата. Основные критерии характеристик выбирали на основе требований (ГОСТ 24061-89) к препаратам биологическим сухим.
Все изготовленные серии лиофилизированного биопрепарата оценивали по следующим показат исследованные серии биопрепаратов для иммунологической диагностики беременности коров представляли собой лиофильновысушенную сухую пористую однородную массу светло-оранжевого цвета. Растворимость и время растворения в моче небеременной коровы П елям: Внешний вид Все осле внесения в содержимое пробирки 5 мл мочи от небеременной коровы и интенсивного встряхивания в течение 20 – 40 секунд получали раствор ярко-оранжевого цвета однородной консистенции. Активность лиофилизированного биопрепарата для определения беременности коров Активность биопрепарата проверяли путем внесения в пробирку с лиофи-лизатом мочи от заведомо беременной коровы. После 20-40 секунд активного встряхивания содержимое пробирки растворялось до однородной консистенции ярко-оранжевого цвета. В течение 15 минут цвет раствора становился темно 53 фиолетовым. Затем в течение 40 минут начинал выпадать черно-фиолетовый осадок, надосадочная жидкость просветлялась. Точность дозирования
Из трёх разных производственных серий сделали выборку по 10 пробирок с биопрепаратом, далее проводили количественное определение лиофилизата по описанной в соответствующем разделе методике. За номинальное содержание лиофилизированного биопрепарата в пробирке принимали 8 мг. После проведенных измерений выявили максимальное отклонение от номинального количества биопрепарата в пробирке, которое не ниже – 3,3 % и не превышает + 1,8 % (Таблица 3). Полученные значения являются допустимыми отклонениями от нормы – не более 15,0 %.
Упаковка. Маркировка
Учитывая физико-химические свойства лиофилизированного препарата для диагностики беременности коров подобрали упаковку в виде цилиндрических пластиковых пробирок с завинчивающимися крышками. Такая упаковка наиболее приемлема для процесса лиофилизации (является термостабильной и не бьется), хранения, транспортировки. Также пробирка с лиофилизатом препарата является сосудом для проведения диагностической тест-реакции. Хранение На основе изученных литературных данных по свойствам лиофилизиро-ванных препаратов были подобраны условия: хранение в защищенном от света месте при температуре + 10 С. Срок годности Качество лиофилизированного препарата для диагностики беременности коров при хранении определяли каждые полгода по методике, разработанной для стандартизации экспресс-теста. Определение срока годности биопрепарата и его активности при хранении продолжается. Таблица 3 - Точность дозирования лиофилизированного препарата для диагностики беременности коров
Серия изготовления Номинальноесодержаниепрепарата, мг Содержание лио-филизированного биопрепарата в пробирке, мг Наличие в образце, % Отклонение от номинала,
Оценка качества жидкой и лиофилизированной формы препарата для диагностики беременности коров в зависимости от срока хранения
Для определения срока годности лиофилизированного препарата изготовили 6 серий лиофилизированного экспресс-теста, согласно технологии, описанной ранее. Затем полученные образцы заложили на хранение при температуре от 10 C до 20 C в защищенное от света место. Через каждые 6 месяцев анализировали заложенные на хранение серии препаратов. Определяли активность экспресс-теста в диагностической реакции с мочой беременной и не беременной коров. Параллельно проводили исследования активности жидкой формы биопрепарата, полученного на основе тех же серий. Сроки хранения исследовали в течение 2 лет. Результаты исследования показали, что жидкая форма биопрепарата не выдерживает длительного хранения, его диагностическая активность утрачивается по истечении 1 года хранения (Таблица 4). Качество серий лиофилизированного иммунологического препарата (Таблица 5), произведенного по разработанной технологии, не снижается на протяжении 2 лет. Этот факт доказывает стабильную активность данного диагностикума в виде разработанной лиофильновысушенной формы по сравнению с жидкой формой
Перспективы дальнейшей разработки темы
Широкое применение в медицине получили тесты на беременность, основанные на определении хорионического гонадотропина в моче или в сыворотке крови. Тесты отличаются простотой применения, достоверностью, высокой воспроизводимостью результатов и диагностической точностью, которая составляет до 98%. [27, 28].
Есть сведения, что ХГ обнаружен у всех до сих пор исследованных видов млекопитающихся E.C. Amorosa, I.S. Perry (1975) (цит. по И.М. Солопаевой, 2000) [86].
В экстрактах плаценты одиннадцати видов высших приматов с помощью биологических и иммунологических методов определяли концентрацию ХГ. Оказалось, что хорионический гонадотропин всех этих видов приматов по строению и концентрации в плаценте сходны между собой и ХГ человека поздних стадий беременности. Сходные гонадотропины были обнаружены в плаценте крыс, мышей и морских свинок (Hobson и Wide, цит. по (К. Остин, Р. Шорт, 1987))[62]. Эти авторы предполагают, что в ближайшем будущем будут обнаружены плацентарные гонадотропины и у других млекопитающих (И.Н. Солопаева, Н.И. Шаро-ва,1988) [86].
Колектив авторов во главе с Багмановым М.А. провели исследования по изучению концентрации хорионического гонадотропина в сыворотке крови стельных коров методом твердофазного иммуноферментного анализа в клинико-диагностической лаборатории родильного дома г. Ульяновска. Результаты исследования показали наличие хорионического гонадотропина, концентрация которого менялась в зависимости от срока стельности. Среднее содержание ХГ в первый месяц стельности составило 4,6±0,83 МЕ/л. На второй месяц стельности концентрация сохранялась на уровне 4,1 – 5,0 МЕ/л (средний показатель – 4,47±0,15 МЕ/л). В третий месяц регистрировалось увеличение количества ХГ до уровня 8,4±1,36 МЕ/л. В дальнейшем уровень гормона снижался до 6,2±0,21 МЕ/л в четыре месяца. Начиная с пятого месяца, отмечено изменение содержание гормона, выраженное в уменьшении его концентрации до 5,92±0,21 МЕ/л. В дальнейшем количество хориогонина сохранялось на уровне 5,68±0,12 МЕ/л. С седьмого месяца стельности концентрация постепенно снижалась и перед отелом зафиксирован показатель 3,30±0,19 МЕ/л. В пробах сыворотки от бесплодных коров ХГ не был обнаружен [5].
При изучении состава препарата «Хорио-фаг», исходным материалом, для которого служила плацента, были обнаружены гормоны в следующих количествах: эстрадиол – 3078-4086 пг/мл, ФСГ – 9,23-15,50 мме/мл, ЛГ – 5,97-8,54 мме/мл, хорионический гонадотропин – 5,09-13,0 мме/мл, пролактин – 92,6-123,7 мме/мл [5].
Таким образом, вопрос о наличии и концентрации ХГ в организме млекопитающих, и в частности, коров остается открытым и требует глубокого изучения. Возможно, в организме беременных коров обнаруживаются белковые вещества, сходные по антигенной структре с хорионическим гонадотропином, что позволяет их обнаруживать в иммунологической реакции.
Учитывая успешный опыт применения тестов на беременность женщин в медицине, для ветеринарной практики был разработан иммунологический экспресс-тест, определяющий стельность и бесплодие крупного рогатого скота [10].
Данный препарат показал себя как высокоэффективное диагностическое средство, позволяющее устанавливать беременность в достаточно ранние сроки [8].
При этом следует отметить, что география потребителей препарата достаточно широка и включает регионы России и зарубежные страны с различными климатическими условиями, неблагоприятно отражающимися на качестве биопрепарата при его пересылке, транспортировке и хранении. Жидкие препараты требуют определенного температурного режима хранения и транспортирования – от +2 до +4ОС, нарушение которого как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры может привести к снижению активности. В связи с этим возникает необходимость совершенствования формы выпуска экспресс-теста, позволяющей исключить вышеуказанные отрицательные воздействия. В данном аспекте одним из решений проблемы является разработка лиофилизированной формы диагностикума. Лиофилизация — способ щадящего высушивания веществ, при котором образец предварительно замораживается, а затем переносится в вакуумную камеру, где происходит сублимация растворителя. Сухие вещества, полученные при помощи лиофилизации, не теряют присущих им свойств, химически не изменяются при долговременном хранении в положительных температурах, вследствие чего упрощаются условия хранения, транспортировки и увеличивается срок годности. При лиофилизации белки не подвергаются денатурации и могут длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 C). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства.
Лиофилизации, как правило, подвергаются микроорганизмы и бактериофаги. Она широко применяется для получения способной к долговременному хранению плазмы крови (сухая плазма) и ее отдельных фракций, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, вакцин, антибиотиков, гормонов, трансплантатов тканей, поэтому для них отработаны разнообразные режимы замораживания и высушивания [2, 103, 138, 141, 146].