Введение к работе
Актуальность проблемы. Лен культурный (Linum usitatissimum L, 2n=30) - одна из древнейших и важнейших технических культур комплексного использования, значение которой в мире неизменно высоко (Trump Т., 1980; Van Dam J.E.G. etal., 1994). Спрос на волокно и семена обусловлен уникальными и высокими свойствами этой культуры. Для того, чтобы льноводство было более эффективно, ведутся интенсивные разработки новых направлений использования льна в пищевой, медицинской, автомобильной, строительной и других отраслях промышленности, а также путей существенного повышения урожая волокна (до 20-30 ц/га у льна-долгунца) и семян (до 40 ц/га у льна масличного). Для решения этих вопросов необходимы качественно новые сорта и нетрадиционные высокоэффективные методы селекции.
Одним из наиболее перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия, ускоренно получить выровненный по селектируемым признакам материал, идентифицировать, быстро размножить и, в конечном итоге, в сжатые сроки создать качественно новые, конкурентоспособные сорта.
Методами традиционной селекции созданы сорта льна-долгунца с высокой продуктивностью, высоким содержанием волокна, высокой устойчивостью к ржавчине и фузариозу. Однако большая часть сортов имеет низкое качество волокна, не обладает достаточной.устойчивостью к полеганию, ряду болезней и насекомым. Кроме того, селекционный материал характеризуется генетическим однообразием (Кутузова С.Н., 1993; Жученко А. А., 1994). Низкий коэффициент размножения льна-долгунца, необходимость селекции на трудносовместимые признаки (высокая урожайность волокна и семян,, высокая урожайность и качество волокна и др.), а также полигенный контроль большинства хозяйственно ценных признаков, низкий коэффициент наследуемости и трудоемкость технологий их оценки на фоне недостаточного внимания к вопросу интенсификации селекционного процесса привели к тому, что традиционная селекция льна на сегодняшний день остается малоэффективным, трудоемким процессом.
Для решения селекционно-генетических задач лен, как объект биотехнологических исследований, используется в различных странах. Однако большая часть исследований находится на стадии методической проработки и не вышла за пределы лабораторных испытаний. 8 связи с упомянутыми выше проблемами возникает необходимость
_4-
оценить перспективы и разработать методы использования биотехнологии как инструмента селекции для повышения эффективности селекционного процесса и генетического улучшения культуры льна.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось усовершенствование селекционного процесса и создание линий льна-долгунца, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков, на основе разработки и использования биотехнологических методов.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать методы создания генетического разнообразия путем культивирования соматических тканей, пыльников и незрелых зародышей, полученных при внутривидовой и межвидовой гибридизации, а также генетической трансформации. Предусматривалось разработать питательные среды и условия культивирования исходных эксплантов, каллусов и регенерантов.
-
Выявить эффективные способы генетической стабилизации популяций льна путем использования гаплоидов, полученных в культуре пыльников и при разных формах апомиксиса; разработать технологии массового получения гаплоидов и дигаплоидов в культуре пыльников, эмбрио--культуре, а также полиэмбрионии.
-
Исследовать новые возможности оценки генотипов in vitro.
-
Усовершенствовать процесс размножения льна in vitro с целью ускоренной передачи особо ценных геноисточников в селекционную практику.
-
Создать на основе биотехнологических методов линии льна-долгунца с высокими показателями хозяйственно,ценных признаков, представляющих интерес для селекционной практики и производства.
Научная новизна работы. Исследования по разработке и применению методов in vitro для решения селекционно-генетических вопросов льна являются современным направлением как в нашей стране, так и за рубежом.
В представленной работе впервые показана роль биотехнологических методов в усовершенствовании селекционного процесса льна-долгунца на этапах создания генетического разнообразия, получения константного, в генетическом отношении, селекционного материала, оценки его in vitro и размножения.
Разработаны и усовершенствованы технологии получения регенерантов в культуре ткани, пыльников и эмбриокультуре. Уточнены условия
-5,
для проведения генетической трансформации льна-долгунца А. tumefaciens на примере введения маркерного гена NPT-II. Впервые получены трансгенные формы льна долгунцового типа с повышенной устойчивостью к гербицидам группы хлорсульфурона, обусловленной наличием гена ALS. Разработана питательная среда для культивирования пыльников льна, по которой принято положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ.
Показано, что культивирование тканей и органов льна в условиях in vitro сопровождается образованием широкого спектра генетической изменчивости в последующих поколениях. При этом, впервые на культуре льна показана высокая значимость сомаклонов, близнецовых дигаплои-дов и регенерантов, полученных от незрелых недоразвитых зародышей самоопыленных генотипов, а также межсортовых и межвидовых скрещиваний для ускоренного создания линий, характеризующихся высокими показателями хозяйственно ценных признаков.
Впервые широко изучено распространение гаплоидии у льна и оценены различные способы получения гаплоидов, основанные на использовании индуцированного апомиксиса, эмбриокультуры, культуры пыльников. Показаны морфогенетические особенности различных типов экс-ппантов в зависимости от условий культивирования донорных растений, предобработки и условий культивирования эксплантов, а также способы их использования для решения селекционно-генетических вопросов.
Выявлены эффективные методы оценки селекционного материала на устойчивость к гербицидам в условиях in vitro и в вегетационных опытах, определены условия для оценки генотипов льна по проросткам на устойчивость к хлориду алюминия и болезням, вызываемым грибами Fusarium oxysporum и Colletotrichum lini.
Получены новые данные, свидетельствующие о взаимодействии генома и плазмона при образовании полиэмбриональных зародышей и культивировании льна в культуре in vitro.
Теоретическая и практическая ценность исследований. Результаты, представленные в диссертационной работе, развивают представление о значении биотехнологических методов в селекции льна-долгунца. Они показывают целесообразность комплексного использования технологий in vitro для повышения эффективности селекционного процесса.
Полученные углубленные знания о гаплондии у льна вида L, usitatissimum L. подтверждают предположение о полиплоидном проке-
хождениит этого вида, позволяют понять и объяснить ряд таких явлсий, как генотрофия, быстрое вырождение сортов, которые характерны для льна. Показывают новые возможности ускоренного получения константного селекционного материала.
Данные о влиянии различных абиотических и биотических факторов на морфогенез эксплантов, прорастание семян подтверждают целесообразность использования растворов гербицидов, хлорида алюминия и культуральной жидкости ряда грибов для экспресс-оценки генотипов льна в условиях in vitro. Разработанные автором методы массового получения регенерантов в культуре пыльников, эмбриокультуре и культуре ткани, а также уникальные генотипы, характеризующиеся нетрадиционным комплексом и высокими показателями хозяйственно ценных признаков нашли широкое применение в селекционной практике в Российской Федерации и за рубежом.
Использование результатов исследования. Полученный селекционный материал (линии), а также методические и технологические разработки используются в селекционном процессе во Всероссийском научно-исследовательском институте льна, в Тверском государственном университете (Россия), в Институте лубяных культур (Украина), в Институте натуральных волокон (Польша), в Институте технических культур (Китай) и фирмах "Агритек" (Чехия), "Фонтен-Кани" (Франция), Ван де Билт Заден (Голландия) и ряде других учреждений. Основные положения, вынесенные на защиту:
- генетическая трансформация, змбриокультура нежизнеспособных
зародышей, получаемых при межсортовых скрещиваниях, сома- и гаме-
токлональная изменчивость - эффективные способы увеличения генети
ческого разнообразия льна;
- использование гаплоидов и дигаплоидов, получаемых методом "grandiflorum" и полиэмбрионии, является перспективным способом генетической стабилизации признаков селектируемого материала;
проращивание семян льна на селективных средах, включающих растворы гербицида Препарат 1, хлорида алюминия, культуральной жидкости грибов Fusarium oxysporum и Colletotrichum Ііпі, позволяет дифференцировать генотипы льна по устойчивости к оцениваемым факторам;
культура апикальных частей побегов при уточненных условиях культивирования исходных эксплантов, почек, побегов и регенерантов оправдана для ускоренного размножения in vitro особо ценного селекционного материала и сохранения генотипов, у которых затруднен процесс воспроизводства.
- использование методов биотехнологии - способ создания геноисточни-ков и родоначальников новых сортов льна-долгунца с высокими показателями основных хозяйственно ценных признаков, включающих устойчивость к экстремальным факторам среды.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом исследований, проведенных автором лично в течение 17 лет. В проведении комплексных исследований под его руководством принимали участие специалисты разных профилей из ВНИИЛ: Т.А. Александрова, Л.Н. Павлова, Н.И. Лошакова, Т.В. Крылова, О.Ф. Чикризова, Л.П. Кудрявцева, О.Ю. Сорокина, А.И. Копасов, Н.А. Кудрявцев.Е.Г. Егорова, Н.В. Пролетова, О.В. Баранова, Л.В. Никитина. Часть исследований проведена совместно с ГБС АНРФ - А.Г. Слюсаренко, В.Н. Суворовой; Институтом натуральных волокон (Польша) - И. Рутковской-Краусе, Г. Маньковской; фирмой АГРИТЕК (Чехия)' - Е. Тейкловой; Научно-производственным кооперативом "Фонтен-Кани" (Франция) - Жан Поль Труве. Всем коллегам автор признателен за сотрудничество.
В ходе работы автор пользовался консультациями академика БАН Л.В. Хотылевой, академика РАСХН B.C. Шевелухи, директора ВНИИЛ, члєн-корр. РАЕН, заслуженного агронома РФ АН. Марченкова, доктора биологических наук А.А. Жучен ко, которым выражает глубокую благодарность.
Связь диссертационной работы с тематическим планом научно-исследовательских работ. Работа выполнена з соответствии с планом НИР ВНИИ льна по решению научно-исследовательских проблем - 0. СХ. 21 [задание 01 (Р)], № государственной регистрации 01.9.30.001897, № 01.9.60.012464, № 02.890.003583, а также в рамках федеральной целевой программы "Развитие льняного комплекса России" и международной программы "Генетика льна".
Апробация работы. Основные положения работы были доложены или представлены на IV и V съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Кишинев, 1982; Москва, 1987), Третьей всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев, 1987), Научной конференции " Использование искусственного климата в селекции сельскохозяйственных культур (Ленинград, 1988), Second European Regional Workshop on Flax " Flax as a fibre and oil bearing crop" (Brno, 1991), Second meeting of the International Flax Breeding Research Group (Brno, 1994), Третьем Всероссийском симпозиуме " Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995), Всероссийском съезде по защите растений " Защита растений в условиях реформиро-
еания агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность"
(Санкт-Петербург, 1995), XIV EUCARPIA Congress (Jyvaskyla Finland. July 31-August 4, 1995. University of Jyvaskyla. Jyvaskyla. 1995), Third meeting of the International Flax Breeding Research Group "Breeding for fibre and oil quality in flax" (St. Valery en Caux, 1995), Fourth European Regional Workshop on Flax "Producing for the market" (Rouen, 1996), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (16-20 июня 1997 г. Пущино, 1997), IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (24-26 июня 1997 г. Москва, МСХА); VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда (25-28 ноября 1997 г., Москва); FAO conference "Bast Fibrous Plants Today and Tomorrow. Beyond 21st Centuty" (September 28-' 29, 1998, St. Petersburg).
Публикации результатов исследований. По результатам исследований по теме диссертации опубликована 54 работа и получено положительное решение ВНИИГПЭ (от 8.01. 1998 г.) о выдаче патента на изобретение "Питательная среда для культивирования пыльников льна".
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, основных выводов, предложений для селекционной практики, заключения, списка литературы и приложений. Она изложена на 300 страницах машинописного текста, содержит 108 таблиц, 22 рисунка. Список литературы состоит из 616 наименований, в том числе 302 на русском и 314 на иностранных языках. Приложения включают 16 документов, подтверждающих использование результатов диссертационной работы.