Введение к работе
Актуальность проблемы
Природные нуклеозиды и их модифицированные аналоги находят широкое применение в составе химиотерапевтических препаратов для лечения ряда вирусных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний. Кроме того, их используют для синтеза и поиска новых соединений, представляющих интерес в различных областях фармакологии, а также в качестве предшественников при синтезе олигонуклеотидов, применяемых в диагностических и терапевтических целях.
Традиционно для получения нуклеозидов и их модифицированных производных используется многостадийный химический синтез. Во многих случаях ключевой стадией процесса является формирование N-гликозидной связи. Химические способы образования этой связи дают удовлетворительные результаты в случае получения нуклеозидов рибо-щщ.. Однако при синтезе 2'-дезоксирибонуклеозидов и P-D-арабинофуранозилнуклеозидов, как правило, образуются смеси регио- и стереоизомеров разделение которых требует использования дорогостоящих носителей, больших затрат сырья и реагентов, а также утилизации токсических отходов производства, что не отвечает экологическим требованиям современной биоиндустрии. Альтернативным способом образования N-гликозидной связи при получении природных нуклеозидов и их модифицированных аналогов является биосинтетический процесс, катализируемый N-дезоксирибозилтрансферазами (КФ 2.4.2.6) или нуклеозидфосфорилазами микроорганизмов [пуриннуклезидфосфорилаза (PuNP; КФ 2.4.2.1), тимидинфосфорилаза (ТР; КФ 2.4.2.4) уридинфосфорилаза (UP; КФ 2.4.2.3)]. Из них, благодаря широкой субстратной специфичности, более подходящими биокатализаторами для промышленного применения признаны нуклеозидфосфорилазы.
В присутствии ортофосфата нуклеозидфосфорилазы катализируют обратимый фосфоролиз рибо-, арабино- и дезоксирибонуклеозидов до пентозо-1-фосфата и соответствующих оснований, а также фосфатзависимый перенос пентозы между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями или нуклеозидами (трансгликозилирование) с образованием нуклеозидов, отличных от исходных, по схеме:
Нуклеозид + Pi <-> Пентозо-1-фосфат + Основание
Основным преимуществом биоконверсии перед химическим синтезом является абсолютная регио- и стереоспецифичность катализируемых нуклеозидфосфорилазами процессов. Кроме того, эти ферменты не требуют никаких кофакторов, и реакции могут протекать в простых экологически и технологически безопасных водных буферах.
Известные на сегодняшний день биотехнологические способы синтеза модифицированных нуклеозидов позволяют успешно получать целевые продукты при использовании ферментов или суспензий целых клеток
мезофильных бактерий, но не лишены недостатков. Применение целых клеток приводит к тому, что конечный продукт может быть загрязнен бактериальным содержимым и требует тщательной очистки и мониторинга качества получаемой субстанции фармпрепарата. При том, что нуклеозидфосфорилазы мезофильных бактерий имеют температурный оптимум в районе 55-65С, они не могут продолжительное время сохранять ферментативную активность при такой температуре вследствие низкой термостабильности. Такие функциональные ограничения биокатализаторов могут играть отрицательную роль в случаях, когда требуются особые условия реакции. Например, для обеспечения высокой концентрации малорастворимых пуриновых оснований, нуклеозидов и их модифицированных аналогов при проведении процессов трансгликозилирования в условиях повышенной температуры и/или экстремальных значений рН. Такие условия обычно приводят к дестабилизации четвертичной и третичной структур белка и, в конечном итоге, к потере ферментативной активности. Поэтому актуальной научно-практической задачей для разработки методологии синтеза нуклеозидов и их производных является изучение ферментов термофильных микроорганизмов, в том числе, стабилизированных иммобилизацией, поскольку они могут обеспечивать целый ряд преимуществ по сравнению с ферментами мезофильных микроорганизмов или их целыми клетками при использовании в качестве биокатализаторов:
ферментативная реакция может протекать длительное время при высокой температуре;
проведение реакции при повышенной температуре обеспечивает большую концентрацию слаборастворимых в водных буферах производных нуклеозидов и оснований;
термостабильные рекомбинантные ферменты могут быть легко очищены от термолабильных белков штамма-хозяина простым прогреванием клеточных лизатов;
интерферирующие ферментативные активности ингибируются высокой температурой реакции, что позволяет использовать грубые или обогащенные ферментные препараты термостабильных нуклеозидфосфорилаз;
биореакторы, работающие на основе термостабильных ферментов, устойчивы к бактериальной контаминации.
Цели и задачи работы
Основной целью настоящего исследования являлась разработка эффективного биокаталитического процесса, основанного на ферментативном трансгликозилировании ряда природных, а также модифицированных нуклеозидов, с использованием ферментных препаратов генно-инженерных нуклеозидфосфорилаз из термофильных бактерий Geobacillus stearothermophilus штамма В-2194.
Для достижения основной цели в ходе работы решались следующие задачи:
Клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы II (PuNPII) и пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) из G. stearothermophilus, оптимизация генетических конструкций, создание рекомбинантных штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз, в том числе иммобилизованных.
Сравнение каталитических свойств полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus и родственных ферментов Е.соїі в реакциях трансгликозилирования и фосфоролиза нуклеозидов.
Разработка методов получения комбинированных ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз, подбор соотношений активностей и количества ферментов, условий иммобилизации. Изучение условий трансгликозилирования природных и модифицированных гетероциклических оснований и нуклеозидов в различных температурных режимах с использованием полученных ферментных препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus.
Разработка способа синтеза (регламентов и технологических схем) 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (Кладрибина) с использованием ферментных препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз.
Научная новизна и практическая значимость работы
В работе впервые показан ряд преимуществ использования ферментных
препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с
ферментами мезофильных микроорганизмов или целых клеток, применяемых
в известных технологиях получения нуклеозидов ферментативным
трансгликозилированием. В ходе работы проведены исследования по
клонированию генов и получению штаммов-продуцентов
пуриннуклеозидфосфорилазы II и пиримидиннуклеозидфосфорилазы из G.
stearothermophilus В-2194. Разработан способ получения ферментных
препаратов из созданных штаммов-продуцентов и охарактеризована их
активность в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и
модифицированных нуклеозидов. Показана возможность эффективного
применения ферментных препаратов иммобилизованных
нуклеозидфосфорилаз для биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (субстанция препарата "Кладрибин"); 9-Р->-арабинофуранозил-2-фтораденина (субстанция препарата "Флударабин"); 1 -P-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (субстанция препарата "Рибавирин"), а также природных нуклеозидов. Разработаны методики и технологические регламенты биотехнологического синтеза и выделения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина из реакционной смеси ионообменной хроматографией на сорбентах отечественного и импортного производства (Dowex2x8, АВ17х2) с использованием экологически и технологически безопасных элюентов и реактивов. Наработаны опытные партии препарата 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (суммарно более 200 г) в соответствии с разработанным лабораторным регламентом и требованиями,
предъявляемыми к субстанциям фармацевтических препаратов. Создан "биотехнологический инструментарий", который может использоваться для получения широкого спектра как уже исследованных, так и новых препаратов нуклеозидной природы для нужд медицины и других целей.
Публикации и апробация работы
По результатам диссертационной работы опубликовано четыре статьи в рецензируемых научных журналах, включённых в список ВАК. Получен Патент РФ № 2230118 от 10.07.2004. Результаты исследования были представлены на российских и международных конференциях: VIII чтениях памяти академика Ю.А.Овчинникова, (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», (Москва, 2009), VII Всероссийской конференция "Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009" (Уфа, 2009) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного нуклеозидфосфорилазам бактерий и их использованию, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Работа изложена на
страницах, содержит рисунков и таблиц.