Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Тестирование вируса некротического пожелтения жилок свеклы методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот Кляченко, Оксана Леонидовна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кляченко, Оксана Леонидовна. Тестирование вируса некротического пожелтения жилок свеклы методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.00.23.- Москва, 1993.- 25 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность проблемы. В последние годы существеннуа угрозу
для. производства сахарной, свеклы во всех основных свеклосеющих
странах мира представляет ризомания - одно из наиболее опасных ви
русных заболеваний.Впервые обнаруженная а северных районах Италии
/Canova, 1959/, болезнь распространилась практически во всех стра-
. яах Средиземноморья и Европы, отмечены очаги заболевания в Китае,
США, Японии. В начале 80-х годов "ризомания была зарегистрирована в
Киргизии /Руженцова, 1984, 1987./,,а затем в Казахстане /Кременцова
И др.,1387/» В целом потери урожая при поражении сахарной свеклы
ризоманией достигая! в разных странах мира 50--702' ',а сахарис
тость корнеплодов снимается ка 5- 107. при содержании.сахара в здо
ровых корнеплодах - 17 - 18Х /Власов и-др.; 1985; Gozdziewicz,
1988/.' '-; _ "!'',. .'..' ,.>7.--v '"' ;; " -. ;

, Ооновные признаки заболевания. развиваются на корнеплодах в виде чрезмерного.разрастания и некрогизации боковых корешков и образования "бороды"» При этом главный корень частично или полностью разрушен. В Киргизии обнаружен системный характер поражения сахарной свеклы ризоманией, при котором вирус локализуется в корневой ; части растения, тогда как в Казахстане распространена также сис-. темная инфекция о. проявлением пожелтения и нектротизации жилок листьев /Власов, Акперлинов, 1990 /.

Японскими исследователями установлено, что возбудителем ризо-маяии является многокомпонентный палочковидный вирус с разделенным

геномом, представленный чегырьма типами РНК - вирус некротического
пожелтения жилок свеклы /ВНШС/,; а его переносчиком и.реэерватором
- плаэмодиофоровый гриб Polymyxa betaeKeskin /Tamada, .- Baba,

1973/. Вирусные частицы разделяют на три,или четыре класса. Разные
: изоляты, полученные в- лабораториях, мира,:- отличаются по модальным

'''"длинам частиц ; определенной длины внутри - иэолята - -УА1 Musa, Mink,1981;. Власов и др.,1985; Fraenkel-Conrat, 1986/.

Меры борьбы с ризоманией малоэффективные, .' единственным перспективным: методом, является создание ^устойчивых сортов сахарной свеклы /Кох» 1992/. В этой связи необходимо иметь надежный и высо-

кстувстаительный'метод ;:дгнті$;:каций'вируса в растите льнем матери-.
, але. 'tta'сегодняшний' день, для обнаружения вируса разработаны мето
ды, позволяющие диагностировать заболевание визуально, методом

. 'растений-ішдикаторов, растений- приманок, иммуносорбентной элект-

ройной микроскопии, иммуноферыентного анализа и гибридизации нуклеиновых кислот о кДКК - зондами на твердых носителях. Поскольку вирус неравномерно распределяется в органах растении сахарной, свеклы и содержится в очень низких концентрациях, предпочтение отдается таким высокочувствительны^, методам как иммуноферментный анализ /USA/ и метод молекулярной гибридизации нуклеиновых . кислот о к$Щ - зондами на твердых носителях. \.

- Особого внимания заслуживает метод гибридизации нуклеиновых кислот Э2Р-меченныш кДНК-зондами, о. помощью которого может Сыть выявлено' до 1 пг вируссспецифической нуклеиновой , кислоты /^Koeniff,lS8S/, тогда как чувствительность ИФА составляет 1 Нг вируса на і мл экстракта УНеЬегГе-Bors et al., 1984; De Biagzi 1986/. Однако необходимость в высокомеченных предшественниках и ферментах для введения их в'полішуклеотйда, а также в специальных условиях и оборудовании для проведения таких работ, .ограничивает возможности применения метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в диагностических целях. В последние годы стали использовать нерадиоактивные биотинилированные ДНК-зонды, которые не уо-тупапт по чувствительности 32Р-ыеченным кДНК -зондам /Relsfeld et al., 1987; Мелдрайс и др., 1991/. . .

В литературе отсутствуют сведения о диагностике ,ВНІІЖС методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот-с использованием бяо-тинилированных ДНК-зондов. Промытого, мы не ..обнаружили научных публикаций в странах СНГ о идентификации ВШШС методом гибридиаа- . ции нуклеиновых кислот с использованием 32Р-меченных кДНК-зондов.

Цель и задачи исследования. Исходя из этого, цель диссертационной работы заключалась в"определении ЕНПНС методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием згР. -меченных и биотинилированных кДНК-зондов в листьях и морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы при системном и несистемном поражении растений ризомзнией. ' 4 Для. достижения. поставленной. целя репали несколько: задач:

  1. Иденяфикадая генома ВНШС "аголята . К-88 .методсм Нозерн-блст. гибридизации нуклеиновых кислот с 32Р-меченяыми кДНК-аондами. ;'

  2. Определение ВКПЗС в сястешго и несистешо пораженных рпзомакие;: растениях сахарной сгеклы методом Нозеря-блог и дот-^гиСркдига-цяи нуклеиновых /кислот при использовании 32Р-мечэнных.колену-

лярных зондов. 3. Разработка сясгеыы тестирования ВНПНС методом дот-гибридизации

нуклеиновых кислот с кДНК, меченной биотином. 1. Сраанитедьнсв изучение зыязлея;и ВНПНС методом гибридизации

нуклеиновых кислот и иммунсфермеятнсго анализа в .варіанте

PAS-ELISA. .

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые разработана система тестирования ВНШЕС методом молекулярной гибридизаций нуклеиновых кислот с использованием биотинилированных ДНК-азк-дов с последующей обработкой гибридизационного фильтра конькгатсы стрелтзвидин-щелочная фосфзтзза. Установлено, что метод гибр;щига-ции РНК вируса с меченной биотинам кДНК не отличается по чувствительности от такового с использование 32Р-меченных кДНК-эондоа.

С помощью гибридизационного теста с 32Р-меченнкми кДНК-зондами установлено распределение вирусных РНК в морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы о системный и яеснсге.'-шзл хзраг-сггргм заболевания. Показано, что метод молекулярной гиЗридизацші нуклеиновых . кислот, позволяет -выявлять ' присутствие -вируса в латентном бессимптомном периоде инфенхцйл и может Сыть использован для ранней диагностики ризомаяии.

.Сравнение методов идентификации ВНПНС показало, что метод гиб- ридизацші нуклеиновых кислот при выявлении равных количеств вируса является более высокоспецифичным и высокочувствительным, чем ИСА в варианте PAS-ELISA. Таким образом, метод гибридизации нуклеиновых кислот можно широко использовать в качестве диагностического теста на ВНШС в селекционно-генетической работе с сахарной свеклой и производственных посевах, а также для диагностики других патогенных вирусоа;~." '-

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доле--' . жены. и обсуждались на конференции молодых ученых Института сахарной.свеклы УААН /Киев, 1993/; на II съезде Украинского общества физиологов растений /Киев, 19ЭЗ/; на 1-м Учредительном /VIII/сьез-де Украинского микссЗяслогкческсга общества /Одесса,1S33/; 'научны-: семинарах лабораторій .биохимии вирусов Института микробиологии ;: вирусологии им. А.Кирхенятейяа АН Латвии /Вез, 1991,1992/; научных семинарах' лабораторій культуры ткани и генетической икхенер:::: Института сахарной свеклы УААН /Kites, 1SS2, 1533/.

Пубджаши. Ш материалам диссертации опубликовано и подано в печать 6 научных работ. . Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Я.А.Мелдрайсу ^ститут 'микробиологии и вирусологии им. А.Кирхегатейкз, Рига, Латвия/ за лЪмога и полезные советы, оказанные при выполнении работы, а.тзк^а, благодарит др.Г\2ояарда /Институт молекулярной биологии, Страсбург, Франция/ за предоставление реломбинангных плазмид, к.б.н. Е.Б.Кремэнцову /Институт защиты растений РААН, Пушкин, Россия/ за предоставление . иэолята ЕНШС К-88, Н.А.Васильеву /Институт сахарной свеклы УААН, Киев, Украина/ за псмовь в проведении полевых опытов в Киргизки и Казахстане.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, об
зора литературы, экспериментальной части, выводов, методических,:
рекомендаций и списка литературы, включающего 175 наименований..
Работа изложена на страницах мааикописного текста и содержит 28'
рисунков. .'"''".-''.