Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы существеннуа угрозу
для. производства сахарной, свеклы во всех основных свеклосеющих
странах мира представляет ризомания - одно из наиболее опасных ви
русных заболеваний.Впервые обнаруженная а северных районах Италии
/Canova, 1959/, болезнь распространилась практически во всех стра-
. яах Средиземноморья и Европы, отмечены очаги заболевания в Китае,
США, Японии. В начале 80-х годов "ризомания была зарегистрирована в
Киргизии /Руженцова, 1984, 1987./,,а затем в Казахстане /Кременцова
И др.,1387/» В целом потери урожая при поражении сахарной свеклы
ризоманией достигая! в разных странах мира 50--702' ',а сахарис
тость корнеплодов снимается ка 5- 107. при содержании.сахара в здо
ровых корнеплодах - 17 - 18Х /Власов и-др.; 1985; Gozdziewicz,
1988/.' '-; _ "!'',. .'..' ,.>7.--v '"' ;; " -. ;
, Ооновные признаки заболевания. развиваются на корнеплодах в виде чрезмерного.разрастания и некрогизации боковых корешков и образования "бороды"» При этом главный корень частично или полностью разрушен. В Киргизии обнаружен системный характер поражения сахарной свеклы ризоманией, при котором вирус локализуется в корневой ; части растения, тогда как в Казахстане распространена также сис-. темная инфекция о. проявлением пожелтения и нектротизации жилок листьев /Власов, Акперлинов, 1990 /.
Японскими исследователями установлено, что возбудителем ризо-маяии является многокомпонентный палочковидный вирус с разделенным
геномом, представленный чегырьма типами РНК - вирус некротического
пожелтения жилок свеклы /ВНШС/,; а его переносчиком и.реэерватором
- плаэмодиофоровый гриб Polymyxa betaeKeskin /Tamada, .- Baba,
1973/. Вирусные частицы разделяют на три,или четыре класса. Разные
: изоляты, полученные в- лабораториях, мира,:- отличаются по модальным
'''"длинам частиц ; определенной длины внутри - иэолята - -УА1 Musa, Mink,1981;. Власов и др.,1985; Fraenkel-Conrat, 1986/.
Меры борьбы с ризоманией малоэффективные, .' единственным перспективным: методом, является создание ^устойчивых сортов сахарной свеклы /Кох» 1992/. В этой связи необходимо иметь надежный и высо-
кстувстаительный'метод ;:дгнті$;:каций'вируса в растите льнем матери-.
, але. 'tta'сегодняшний' день, для обнаружения вируса разработаны мето
ды, позволяющие диагностировать заболевание визуально, методом
. 'растений-ішдикаторов, растений- приманок, иммуносорбентной элект-
ройной микроскопии, иммуноферыентного анализа и гибридизации нуклеиновых кислот о кДКК - зондами на твердых носителях. Поскольку вирус неравномерно распределяется в органах растении сахарной, свеклы и содержится в очень низких концентрациях, предпочтение отдается таким высокочувствительны^, методам как иммуноферментный анализ /USA/ и метод молекулярной гибридизации нуклеиновых . кислот о к$Щ - зондами на твердых носителях. \.
- Особого внимания заслуживает метод гибридизации нуклеиновых кислот Э2Р-меченныш кДНК-зондами, о. помощью которого может Сыть выявлено' до 1 пг вируссспецифической нуклеиновой , кислоты /^Koeniff,lS8S/, тогда как чувствительность ИФА составляет 1 Нг вируса на і мл экстракта УНеЬегГе-Bors et al., 1984; De Biagzi 1986/. Однако необходимость в высокомеченных предшественниках и ферментах для введения их в'полішуклеотйда, а также в специальных условиях и оборудовании для проведения таких работ, .ограничивает возможности применения метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в диагностических целях. В последние годы стали использовать нерадиоактивные биотинилированные ДНК-зонды, которые не уо-тупапт по чувствительности 32Р-ыеченным кДНК -зондам /Relsfeld et al., 1987; Мелдрайс и др., 1991/. . .
В литературе отсутствуют сведения о диагностике ,ВНІІЖС методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот-с использованием бяо-тинилированных ДНК-зондов. Промытого, мы не ..обнаружили научных публикаций в странах СНГ о идентификации ВШШС методом гибридиаа- . ции нуклеиновых кислот с использованием 32Р-меченных кДНК-зондов.
Цель и задачи исследования. Исходя из этого, цель диссертационной работы заключалась в"определении ЕНПНС методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием згР. -меченных и биотинилированных кДНК-зондов в листьях и морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы при системном и несистемном поражении растений ризомзнией. ' 4 Для. достижения. поставленной. целя репали несколько: задач:
-
Иденяфикадая генома ВНШС "аголята . К-88 .методсм Нозерн-блст. гибридизации нуклеиновых кислот с 32Р-меченяыми кДНК-аондами. ;'
-
Определение ВКПЗС в сястешго и несистешо пораженных рпзомакие;: растениях сахарной сгеклы методом Нозеря-блог и дот-^гиСркдига-цяи нуклеиновых /кислот при использовании 32Р-мечэнных.колену-
лярных зондов. 3. Разработка сясгеыы тестирования ВНПНС методом дот-гибридизации
нуклеиновых кислот с кДНК, меченной биотином. 1. Сраанитедьнсв изучение зыязлея;и ВНПНС методом гибридизации
нуклеиновых кислот и иммунсфермеятнсго анализа в .варіанте
PAS-ELISA. .
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые разработана система тестирования ВНШЕС методом молекулярной гибридизаций нуклеиновых кислот с использованием биотинилированных ДНК-азк-дов с последующей обработкой гибридизационного фильтра конькгатсы стрелтзвидин-щелочная фосфзтзза. Установлено, что метод гибр;щига-ции РНК вируса с меченной биотинам кДНК не отличается по чувствительности от такового с использование 32Р-меченных кДНК-эондоа.
С помощью гибридизационного теста с 32Р-меченнкми кДНК-зондами установлено распределение вирусных РНК в морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы о системный и яеснсге.'-шзл хзраг-сггргм заболевания. Показано, что метод молекулярной гиЗридизацші нуклеиновых . кислот, позволяет -выявлять ' присутствие -вируса в латентном бессимптомном периоде инфенхцйл и может Сыть использован для ранней диагностики ризомаяии.
.Сравнение методов идентификации ВНПНС показало, что метод гиб- ридизацші нуклеиновых кислот при выявлении равных количеств вируса является более высокоспецифичным и высокочувствительным, чем ИСА в варианте PAS-ELISA. Таким образом, метод гибридизации нуклеиновых кислот можно широко использовать в качестве диагностического теста на ВНШС в селекционно-генетической работе с сахарной свеклой и производственных посевах, а также для диагностики других патогенных вирусоа;~." '-
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доле--' . жены. и обсуждались на конференции молодых ученых Института сахарной.свеклы УААН /Киев, 1993/; на II съезде Украинского общества физиологов растений /Киев, 19ЭЗ/; на 1-м Учредительном /VIII/сьез-де Украинского микссЗяслогкческсга общества /Одесса,1S33/; 'научны-: семинарах лабораторій .биохимии вирусов Института микробиологии ;: вирусологии им. А.Кирхенятейяа АН Латвии /Вез, 1991,1992/; научных семинарах' лабораторій культуры ткани и генетической икхенер:::: Института сахарной свеклы УААН /Kites, 1SS2, 1533/.
Пубджаши. Ш материалам диссертации опубликовано и подано в печать 6 научных работ. . Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Я.А.Мелдрайсу ^ститут 'микробиологии и вирусологии им. А.Кирхегатейкз, Рига, Латвия/ за лЪмога и полезные советы, оказанные при выполнении работы, а.тзк^а, благодарит др.Г\2ояарда /Институт молекулярной биологии, Страсбург, Франция/ за предоставление реломбинангных плазмид, к.б.н. Е.Б.Кремэнцову /Институт защиты растений РААН, Пушкин, Россия/ за предоставление . иэолята ЕНШС К-88, Н.А.Васильеву /Институт сахарной свеклы УААН, Киев, Украина/ за псмовь в проведении полевых опытов в Киргизки и Казахстане.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, об
зора литературы, экспериментальной части, выводов, методических,:
рекомендаций и списка литературы, включающего 175 наименований..
Работа изложена на страницах мааикописного текста и содержит 28'
рисунков. .'"''".-''.