Введение к работе
Актуальность темы.
Управление ростом и физиологической активностью микроорганизмов язляется важной проблемой в биотехнологии. Одним из направленні! решения этой проблемы иалиется использование для этой цели различного рода стимуляторов. Применение таких веществ позволяет без дополнительных затрат сырья, практически без изменения технологии значительно увеличивать выход целевых продуктов, степень потребления компонентов среды, что улучшает экономические показатели процесса, и, что не менее важно, снижает степень загрязнения стоков микробиологических производств.
В качестве стимуляторов используют самые различные индивидуальные вещества (аминокислоты, витамины, нуклеотиды. антибиотики, поверхностно-активные вещества и др.) и сложные смеси веществ (различные экстракты и гидролизаты растительного и животного происхождения, отходы промышленности, сельского хозяйства и др.).
Стимуляторы, используемые в биотехнологии, должны отвечать
определенным требованиям, основными из которых являются: отсутствие
токсичности, высокая эффективность действия, известный 1!
стандартный состав, доступность, сравнительно низкая стоимость, стабильность при хранении. Высокие требования существенно ограничивают число используемых стимуляторов и обусловливают необходимость поиска и создания новых.
Важным вопросом в проблеме поиска и применения стимуляторов является выяснение механизмов их действия, что позволяет определить уровень специфичности действия, расширяет представления о защитных клеточных реакциях в ответ на воздействие этого фактора, позволяет прогнозировать развитие и скорость адаптации к нему, во многом определяет перспективу их использования.
В наших более ранних исследованиях было показано, что эффективным стимулятором ряда микробиологических процессов являются продукты конденсации формальдегида. Учитывая простоту способа получения конденсата, доступность сырья, невысокую стоимость, стабильность состава и биологической активности он может быть отнесен к числу перспективных биостимуляторов. Однако многие
вопросы этой проблемы, интересной н научном и практическом аспектах оставались нерешенными, а по некоторым из них высказаны лиш; предположения той или иной степени достоверности. Прежде всего ЭТ( касается вопросов: какое вещество (или группа веществ), входящие і состав конденсата, определяют его биологическую активность; каковь пути направленной регуляции синтеза этих биологически-активны: веществ, каковы спектр и механизмы их действия на биологически' объекты различного уровня организации и др.
Целью настоящей работы является разработка теоретических осної направленного синтеза биологически активных веществ в процесс конденсации формальдегида и разработка технологического процесс; получения стимулятора с заданными свойствами; определение характер; и механизма действия конденсата на морфолого-культуральные і физиолого-биохимичекие признаки микроорганизмов, перспективны.' направлений использования его в биотехнологии.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
изучить основной качественно-количественный состаї
конденсатов, получаемых в различных условиях;
определить природу активного начала, ответственного з;
биологическую активность конденсатов формальдегида",
разработать лаборгггорный регламент для получения конденсатої
формальдегида с повышенным содержанием веществ, обусловливающие
их биологическую активность;
определить спектр действия конденсата на биологичеки<
объекты, различающиеся по уровню организации: бактерш
(грамположительные и грамотрицательныс), микромицеты, высшие
базидиальные грибы, растения;
выявить возможные механизмы стимулирующего шн
ингибирующего действия конденсата в зависимости от доз действия і
чувствительности объектов-реципиентов;
изучить эффективность стимулирующего действия конденсата і процесаїх биосинтеза ценных метаболитов: антибиотиков, аминокислот ферментов, а также биомассы высших базидиальиых грибов < использованием промышленных продуцентов;
определить другие возможные области применения продукте* конденсации формальдегида.
Научная новизна.
Впервые показано, что разветзленные углеводы, в том числе
2-С-гндроксішетилтрпоза, 2-С-гндроксиметилтстроза. 2-С-підроксн-
метнлпентоза и 2-С-гидроксиметилгексоза являются биологически
активными соединениями. Биологическая активность конденсатов
формальдегида обусловлена наличием в их составе разветвленных
углеводов Са-Ст.
Исследовано влияние на синтез биологически активных
разветвленных углеводов основных физико-химических параметров
процесса - температуры, концентраций формальдегида и катализатора,
природы и концентрации сокатализатора и растворителя. Установлено,
что природа органического сокатализатора и растворителя оказывают
существенное влияние на состав продуктов конденсации. Определены
условия конденсации формальдегида, позволяющие получать смеси с
преимущественным содержанием разветвленных углеводов. Впервые в
составе конденсатов формальдегида идентифицированы 5 разветвленных
углеводов и 2 дезоксисоединения. При исследовании механизма
начальной стадии конденсации формальдегида показано, что реакция
самоконденсации формальдегида не является инициирующей стадией
автокатализа. Для начала конденсации необходимо присутствие в
реакционной смеси небольших количеств ацетальдегида или других
органических сокатализаторов.
Впервые проведено комплексное исследование характера и
эффективности действия конденсата формальдегида на рост, некоторые
физиологические процессы и морфолого-культуральные признаки
микроорганизмов - как прокариот, так и эукариот. Показано, что в
соответствии с правилом Арнт-Шульца конденсат может быть отнесен к
биорегуляторам, характер действия которого - стимуляция или
ингибирование - определяется его концентрацией.
Впервые установлено, что основным механизмом как стимулирующего, так и ингнбирующего действия регулятора (независимо от уровня организации тест-объекта) является изменение под его влиянием структурной организации цитоплазматической мембраны, а именно: повышение ее текучести' вследствие увеличения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах.
Впервые выявлено свойство конденсата формальдегида регулировать процесс пеллетообразования у мицелиальных организмов -
стрептоміщетоа и грибов при глубинном способе их культивирования, присутствии конденсата уменьшается размер пеллет, увеличиваете степень дисперсности мицелия. Показано, что одним из возможны механизмов такого воздействия являются изменения в структуре составе клеточной поверхности культур, возникающие под действие конденсата.
Обнаружено свойство конденсата формальдегида воздействоват
на морфолого-культуральные признаки микроорганизмов. Впервы
показано, что одной из неспецифических реакций микромицетов н
воздействие конденсата является усиленный синтез им
полисахаридов.
Практическая значимость.
Разработан способ и научно-техническая документация дл получения стандартных смесей продуктов конденсации формальдегида преимущественным содержанием биологически активных компонентов разветвленных углеводов. Наработана опытная партия препарата проведены его испытания.
С использованием в качестве стимулятора конденсат; формальдегида разработаны способы интенсификации процессої биосинтеза аминокислот лизина (а.с. 1112780), валина (а.с. 1549071) пролина, триптофана, гистидина; антибиотиков тилозина (а.с. 1554390) имбрицина; протеиназ фибринолитического действия; протосубтилина биомассы высших базидиальных грибов, дрожжей (а.с. 1194874 промышленными продуцентами. Включение конденсата в состаї ферментационных сред позволяет на 15-37%, в зависимости от процесса повысить выход целевого продукта, сократить удельный расход сырья і продолжительность процессов.
Показано, что в присутствии конденсата формальдегид? повышается эффективность выделения антибиотика имбрицина и: биомассы, что может быть использовано для интенсификации выделени; его в промышленных условиях.
Показана возможность использования конденсата формальдегида для регуляции сукцессионных изменений в микробных популяция* компостов при получении органических удобрений. Конденсат вносимый в соломистые компосты в концентрации 0,1% (по РВ)
позволяет сократить продолжительность созревания компосто». направленно влиять на их микробные сообщества.
Исследуемый в работе биорегулятор может быть использован и в другой области - в сельском хозяйстве, например, для повышения морозоустойчивости пшеницы (а.с. 12692980). а также для разработки способоз очистки от формальдегида сточных вод некоторых химических производств.
Место проведения работы.
Работа выполнялась на кафедре технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского технологического института (зав. кафедрой д.т.н., проф. Яковлев В.И.), в лаборатории моносахаридов Пражского химико-технологического института (зав. лабораторией д.х.н., проф. И.Яры) и в Санкт-Петербургском научно-исследовательском центре экологической безопасности РАН (директор д.эк.и. Донченко В.К.). Инициатором исследований в этой области является д.х.н.. проф. кафедры органической химии СПбТИ Глибин Е.Н. Отдельные фрагменты исследований выполнены совместно с сотрудниками ВНИТИАФ (Санкт-Петербург), НИТИЛ (Ереван), НИИ пищевой промышленности (Санкт-Петербург), Технологического института пищевой промышленности (Москва), ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).
Апробация работы и публикации.
Результаты исследований были представлены на Научно-практической конференции "Научно-техническое сотрудничество отраслевых НИИ и Вузов" (Ленинград, 1980), VII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Пущино, 1982), Всесоюзной конференции "Контроль и управление биотехнологическими процессами" (Горький, 1985), VII съезде микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), Всесоюзной конференции "Перспективы получения новых лекарственных препаратов с помощью биотехнологии" (Москва, 1985), VIII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Москва, 1987), VII съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989), V и VII European symposium on carbohydrates (Praqua. 1989; Cracow, 1993), VI Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996).
По теме диссертации опубликована 3! работа, в том числе I монография, получено 6 авторских свидетельств на изобретения.
Обьем н структура работы.
Диссертация состоит из введения, семи глав (обзора литературы, методов исследований, пяти глав по результатам экспериментальной работы), выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 229 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и фотографиями, 26 таблицами. Список литературы включает 323 наименований.